Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12613:2019 Thực phẩm - Phương pháp định lượng axit nucleic

• Số hiệu: TCVN12613:2019
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2019

Kết quả	Biểu thị kết quả
Trình tự đặc hiệu taxon đích không phát hiện được	“Đối với loài X, ADN không phát hiện được”
Trình tự đặc hiệu taxon đích phát hiện được nhưng trình tự đích GM không phát hiện được	Theo TCVN 7605 (ISO 21569) “Đối với mẫu X, trình tự đích biến đổi gen Y không phát hiện được”. LOD của phương pháp là x % được xác định với ABC (mẫu chuẩn) Nếu không thể mô tả cỡ mẫu thử nghiệm và tổng số ADN đích trong PCR đủ để áp dụng LOD, thì câu sau đây cần được thêm vào: “Tuy nhiên, tổng số ADN đích được chiết từ loài X có thể là/ không đủ để LOD có thể được áp dụng đối với mẫu này. LOD mẫu là x %”. (Chỉ rõ đơn vị sử dụng) CHÚ THÍCH: LOD mẫu được xác định bởi số lượng ADN của loài có trong ống phân tích (số bản sao) và tỉ lệ tương đối so với LOD tuyệt đối của đích GM (số bản sao), và trong trường hợp các hạt, số hạt tỉ lệ với phần được nghiền.
Phát hiện được cả hai trình tự đặc hiệu taxon đích và trình tự đích GM nhưng số lượng thấp hơn LOQ của ít nhất một trình tự đích.	Đối với mỗi GMO, nêu rõ: “ADN có nguồn gốc GMO (chỉ rõ GMO) được xác định bởi sự phát hiện (chỉ rõ trình tự đích) có nguồn gốc (chỉ rõ loài) được phát hiện, dưới LOQ thực tế”. Ngoài ra, nếu có thể “LOQ thực tế là x %” (Chỉ rõ đơn vị sử dụng)
Phát hiện được cả hai trình tự đặc hiệu taxon đích và trình tự đích GM và số lượng cả 2 trình tự đích cao hơn LOQ.	Đối với mỗi GMO, nêu rõ: “Hàm lượng ADN có nguồn gốc GMO (chỉ rõ GMO) được xác định bằng phát hiện (chỉ rõ trình tự đích) có nguồn gốc từ (chỉ rõ loài) là x ± Umeas %” trong đó Umeas là độ không đảm bảo đo. (Chỉ rõ đơn vị sử dụng)

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các phương pháp đặc hiệu taxon-đích

A.1  Phương pháp đặc hiệu taxon đích để định lượng tuyệt đối ADN gen adh1 của ngô sử dụng real-time PCR

A.1.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và định lượng gen adh1 (mã hóa alcohol dehydrogenase 1) ở ngô (Zea mays) đặc hiệu taxon để xác định hàm lượng ADN ngô, hoặc để kiểm tra sự có mặt/ không có mặt các chất ức chế PCR có thể phát hiện được trong các dung dịch ADN tách chiết từ các sản phẩm có chứa ADN có nguồn gốc từ ngô, ví dụ: thực phẩm.

Các hạn chế, xem A.1.8.

A.1.2  Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng

...

...

...

Phương pháp được tối ưu cho ADN được tách chiết từ ngô hạt nghiền tinh khiết, lá ngô và các mẫu chuẩn được chứng nhận (dãy IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413^[^10^])^[11^].

Kiểm tra độ tái lập của phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết (U1 tới U6) gồm có ADN ngô hoang dại với số bản sao tương ứng khác nhau của trình tự đích (xem A.1.2.2), và trong các thử nghiệm cộng tác khác kết hợp với các phương pháp đặc hiệu cho các sự kiện ngô biến đổi gen, ví dụ Bt11 (xem D.1).

Số bản sao của trình tự đích trên mỗi bộ gen đơn bội được ước tính là 1^[^11^].

Tính ổn định alen (allelic) của trình tự đích đã được thiết lập^[^11^].

A.1.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Phương pháp đã được xác nhận giá trị sử dụng trong một thử nghiệm cộng tác do Trung tâm Nghiên cứu chung của Ủy ban Châu Âu (EC-JRC), Viện Sức khỏe và Bảo vệ Người tiêu dùng (IHCP) tổ chức, phù hợp với các quy định được hài hòa ở cấp quốc tế ^[12].

Sáu mẫu ADN (S1-S6) của ngô hoang dại được tách chiết từ lá ^[13] chứa các số bản sao biết trước (183 486, 61 162, 20 387, 6 796, 2 265, 755) của các bộ gen ngô đơn bội được sử dụng để thiết lập đường chuẩn để định lượng tuyệt đối các bộ gen ngô đơn bội trong các mẫu chưa biết, số lượng bản sao tuyệt đối trong các mẫu đã biết được xác định bằng cách chia khối lượng ADN trong mẫu (được xác định bởi định lượng huỳnh quang của sợi đôi ADN với PicoGreen, Molecular Probes, Cat. Number P-7589) cho giá trị 1C trung bình được công bố ở các bộ gen ngô (2 725 pg) ^[14^].

Sáu mẫu (U1-U6) của ADN ngô dại (được tách chiết từ lá ^[^13]) được sử dụng làm các mẫu chưa biết. Các số bản sao dự kiến trong các mẫu chưa biết đã được xác định theo cùng một cách giống như xác định cho các mẫu đã biết.

Các kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp trong thử nghiệm cộng tác được tóm tắt trong Bảng A.1.

...

...

...

Bảng A.1 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

Mẫu

U1

U2

U3

U4

U5

U6

...

...

...

12

12

12

12

12

12

Số lượng phòng thử nghiệm trả kết quả

10

10

...

...

...

10

10

10

Số lượng phòng thử nghiệm không hợp lệ

1

1

1

1

1

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại

9

9

9

9

9

9

Số lượng mẫu cho mỗi phòng thử nghiệm

4

...

...

...

4

4

4

4

Số lượng số lạc Cochran

1

1

1

1

...

...

...

-

Số lượng số lạc Grubbs

-

1

1

1

1

1

Số lượng mẫu được chấp nhận

...

...

...

34

34

34

35

35

Giá trị số lượng bản sao dự kiến

7 339

18 349

36 697

...

...

...

91 743

146 788

Giá trị số lượng bản sao trung bình

9 985

23 885

46 918

75 161

100 541

122 080

...

...

...

36,1

30,2

27,9

36,5

9,6

-16,8

Độ lệch chuẩn lặp lại Sr^a

1 318,59

1 463,60

...

...

...

4 539,57

11 306,89

14 843,41

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)^b

13,21

6,13

12,35

6,04

11,25

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập SR^a

2 013,12

2 083,57

6 145,39

6 806,85

14 592,04

17 777,70

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)^b

20,16

...

...

...

13,10

9,06

14,51

14,56

^a Được biểu thị là giá trị số lượng bản sao.

^b Được biểu thị là phần trăm của giá trị trung bình.

A.1.2.3  Đặc hiệu phân tử

A.1.2.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp được thiết kế dựa vào một phần của trình tự được mô tả trong EMBL/GenBank/DDBJ2) mã số tiếp cận X04050. Trình tự này là duy nhất đối với Zea mays (ngô/ngũ cốc) và phân loài Zea mays subsp. diploperennis (teosinte)^[^11].

...

...

...

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua một tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ ^2) sử dụng các trình tự nucleotit làm các trình tự truy vấn với chương trình BLASTN ^2) tại địa chỉ http://www.ncbi.nlm.gov.blast/ (ngày 9 tháng 10 năm 2003). Kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

A.1.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Độ đặc hiệu của phương pháp đã được kiểm tra đối với một dải rộng các loài không phải đích và 20 dòng ngô khác nhau đại diện cho các mẫu đa dạng về phát sinh loài và địa lý ^[11]. Không có phản ứng chéo nào được quan sát thấy với các loài không phải đích (trừ teosinte Zea mays subsp diploperennis, tổ tiên hoang dại của ngô trồng) ^[11^],^[17^]. Số bản sao và độ ổn định alen của trình tự đích qua các dòng ngô khác nhau đã được thiết lập^[11^].

A.1.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa được thực hiện đối với hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM 7700^® 3) và hóa chất TaqMan^® ^3). Thiết kế mồi và đoạn dò được thực hiện với phần mềm Express Primer^® (Applied Biosystem)^3).

A.1.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

Theo các phòng thử nghiệm phân tích, LOD tuyệt đối là 10 bản sao của trình tự đích ^[11^].

Số lượng bản sao thấp nhất của trình tự đích trong thử nghiệm cộng tác là 7 399.

A.1.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

...

...

...

Số lượng bản sao thấp nhất của trình tự đích trong thử nghiệm cộng tác là 7 399.

A.1.3  Điều chỉnh

Chưa có thông tin cụ thể.

A.1.4  Nguyên tắc

Đoạn ADN của gen adh1 có chiều dài 134 bp được khuếch đại sử dụng hai mồi đặc hiệu adh1 của ngô (xem Bảng A.2). Các sản phẩm PCR tích lũy đo được ở cuối mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu- adh1 của ngô (ADH1-MDO, xem Bảng A.2) được đánh dấu với 2 thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^®^3) đã được sử dụng.

Tín hiệu huỳnh quang đo được vượt qua giá trị ngưỡng, được xác định bởi người phân tích sau một số chu trình nhất định. Con số này được gọi là giá trị Ct. Để định lượng tổng số ADN-adh1 của ngô trong một mẫu chưa biết, giá trị Ct được chuyển đổi thành giá trị số bản sao tương ứng bằng cách so sánh với đường chuẩn có giá trị Ct được kiên kết trực tiếp với các số bản sao đã biết (phân tích hồi quy).

A.1.5  Thuốc thử

A.1.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử đã sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276)

...

...

...

A.1.5.3  Dung dịch đệm PCR (không có MgCI₂), 10 x.

A.1.5.4  Dung dịch MgCI₂, c(MgCI₂) = 25 mmol/l.

A.1.5.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (cho mỗi loại).

A.1.5.6  Các oligonucleotit

Chi tiết của các oligonucleotit được liệt kê trong Bảng A.2.

Bảng A.2 - Các oligonucleotit

Tên

Trình tự ADN oligonucleotit

Nồng độ cuối trong PCR

...

...

...

5'-CgT CgT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3'

300 nmol/l

ADH-RR4

5’-CCA CTC CgA gAC CCT CAg TC-3'

300 nmol/l

ADH1-MDO

5’-FAM-AAT CAg ggC TCA TTT TCT CgC TCC TCA-TAMRA-3’^a

200 nmol/l

a FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.

...

...

...

A.1.5.7  Enzym ADN polymerase chịu nhiệt

Enzym ADN Polymerase của AmpliTaq Gold^® 4).

A.1.5.8  Uracil W-glycosylase (tùy chọn).

A.1.5.9  Hỗn hợp phản ứng khuếch đại

Chi tiết của hỗn hợp phản ứng khuếch đại được liệt kê trong Bảng A.3.

Bảng A.3 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

Khuôn mẫu ADN (tối đa 250 ng)

...

...

...

Taq-ADN polymerase

TaqMan^® Universal Master Mix 2 x

12,5 μl(1 x)

Hệ thống khử nhiễm (dUTP bao gồm uracil N-glycosylase)

Đệm phản ứng (chứa chuẩn thụ động ROX)^a

Hỗn hợp dNTP

Mồi

Xem Bảng A.2

Xem A.1.5.6

...

...

...

Xem Bảng A.2

Xem A.1.5.6

^a ROX = carboxyl-X-rhodamine.

A.1.6  Thiết bị, dụng cụ

A. 1.6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

A.1.6.2  Máy chu trình nhiệt

Hồ sơ nhiệt độ-thời gian quy định được thử nghiệm ban đầu với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems) 5). Các thiết bị phát hiện real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp với các điều kiện phản ứng.

A.1.6.3  Các ống phản ứng

...

...

...

A.1.7  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

A.1.7.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị phản ứng PCR cho trình tự đích gen đối chứng và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt trừ khi có quy định khác trong các phụ lục đặc hiệu-đích GM liên quan.

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR 25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với thuốc thử như được liệt kê trong Bảng A.3.

A.1.7.2  Các kiểm chứng PCR

Nếu các kiểm chứng không mang lại các kết quả dự kiến, phải hủy bỏ các kết quả thử nghiệm và phải tiến hành phân tích lại.

ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng cao được tách chiết từ ngô (ví dụ: một CRM từ JRC, IRMM ^5)) có thể được sử dụng^[^13^] làm kiểm chứng dương/vật liệu so sánh chuẩn. Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm như được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

A.1.7.3  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian-nhiệt độ được nêu trong Bảng A.4 được tối ưu hóa trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 (Applied Biosysytem)^5). Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng, chương trình thời gian-nhiệt độ được sử dụng với ADN polymerase của AmpliTaq Gold^®^5). Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu sự điều chỉnh phù hợp cụ thể. Nhiệt độ và thời gian yêu cầu để hoạt hóa enzyme phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng. Bảng A.4 nêu ra các điều kiện phản ứng.

...

...

...

Thời gian s

Nhiệt độ °C

Tiền PCR: Khử nhiễm

120

50

Tiền PCR: hoạt hóa ADN polymerase và biến tính khuôn ADN

600

95

...

...

...

Bước 1

Biến tính

15

95

Bước 2

Gắn mồi-kéo dài

60

...

...

...

A.1.8  Các hạn chế và diễn giải các kết quả

Sự có mặt của các chất ức chế PCR có thể tác động lớn đến độ chính xác của số bản sao adh1 được ước tính trong các mẫu phân tích. Vì vậy, cần khẳng định sự không có mặt của các chất ức chế PCR có thể phát hiện được [xem Phụ lục A của TCVN 7606 (ISO 21571)], ví dụ bằng cách thiết lập các dãy pha loãng của ADN khuôn và kiểm tra sự phù hợp giữa các dãy pha loãng và các khác biệt trong các giá trị Ct (chu kì ngưỡng) (ví dụ: một Ct tương ứng với gấp đôi nồng độ khuôn).

Đối với việc sử dụng phương pháp này, khi kết hợp với một phương pháp để định lượng ADN có nguồn gốc GMO, điều quan trọng là lượng tuyệt đối của ADN khuôn (ng) phải giống nhau cho cả phản ứng PCR adh1 và PCR đặc hiệu GMO. Nếu không, số bản sao tuyệt đối của các phản ứng không trực tiếp so sánh được và do đó cần phải điều chỉnh số bản sao tương ứng. Nếu không, sẽ không tính được nồng độ GMO tương đối.

A.1.9  Hiệu chuẩn và tính kết quả

Các điểm chuẩn được tạo ra với các lượng xác định ADN trong các số bản sao tuyệt đối của ADN bộ gen ngô đơn bội có chứa trình tự đích.

Dựng đường chuẩn bằng cách vẽ đồ thị các giá trị Ct đối với logarit số bản sao đích của các điểm chuẩn. Điều này có thể thực hiện được, ví dụ, sử dụng bảng tính trong Microsoft Excel 6), hoặc sử dụng trực tiếp bằng các tùy chọn sẵn có của phần mềm hệ thống phát hiện trình tự.

Đường chuẩn được sử dụng để xác định các số bản sao ADN tuyệt đối của ngô đơn bội ở các mẫu chưa biết. Cho dù ADN mẫu có thể bị phân hủy bởi quá trình chế biến thực phẩm hoặc có thể chứa các thành phần khác với ngô, điều này không ảnh hưởng đến số lượng các bản sao bộ gen đơn bội tính được của các mẫu chưa biết.

A.2  Phương pháp đặc hiệu taxon đích để phát hiện ADN có nguồn gốc từ gạo

A.2.1  Nguyên tắc

...

...

...

Quy trình tiến hành nghiên cứu cộng tác bao gồm các mô-đun sau.

Real-time PCR định lượng các mẫu ADN gạo (mẫu mù) sử dụng để dựng đường chuẩn

Real-time PCR định lượng các mẫu ADN gạo (mẫu mù) sử dụng đường chuẩn đã dựng.

Thử nghiệm liên phòng được tiến hành phù hợp với các hướng dẫn quốc tế được chấp nhận sau đây:

- TCVN 6910 (ISO 5725);^[5^1]-[^56]

- Quy trình chính thức của IUPAC về thiết kế, tiến hành và diễn giải kết quả nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp

Các kết quả nghiên cứu liên phòng cũng như các protocol liên quan được trình bày trong A.2.3.3

A.2.2  Phạm vi áp dụng

Phương pháp được tối ưu cho gạo hạt và các sản phẩm đã qua chế biến chứa hỗn hợp gạo và các nền mẫu khác, ví dụ: ngô và đậu tương. Khả năng áp dụng của gen SPS được kiểm tra thông qua các thử nghiệm cộng tác sử dụng mẫu ADN chiết tách từ gạo hạt.

...

...

...

A.2.3.1  Độ vững của phương pháp

Độ vững của phương pháp real-time PCR định lượng gen SPS được thử nghiệm bởi tổ chức phát triển phương pháp với các chương trình thời gian-nhiệt độ khác nhau (hai bước và ba bước) và trên ba mẫu ADN khác nhau chứa tổng số ADN gạo biết trước (10 ng, 1 ng, 0,1 ng mẫu ADN bộ gen gạo). Mỗi mẫu được thử nghiệm 3 lần lặp lại. Phương pháp real-time PCR có độ mạnh mong muốn và được tiến hành tốt ở các chương trình thời gian-nhiệt độ khác nhau ở ba nồng độ ADN gạo khác nhau.

Phương pháp PCR định lượng gen SPS cũng được thử nghiệm trên các thiết bị real-time PCR khác nhau (Rotor gen 3000A,^1) Corbett Research và ABI7700,^1) Applied Biosystems), với ba thể tích phản ứng khác nhau (20 μl, 25 μl, và 30 μl; mỗi thể tích lặp lại ba lần). Phương pháp real-time PCR định lượng có độ mạnh phù hợp, hoạt động tốt trên các thiết bị real-time PCR khác nhau với các thể tích phản ứng khác nhau.

A.2.3.2  Thử nghiệm nội bộ

Để chuẩn bị mẫu, tất cả các mẫu ADN được chiết tách bằng phương pháp cetyl(trimethyl) ammonium bromide (CTAB) được chấp nhận bởi TCVN 7606 (ISO 21571). Tiến hành định lượng tổng số ADN chiết tách bằng cách sử dụng phương pháp quang phổ được chấp nhận trong B.1 của TCVN 7606 (ISO 21571),. Sau khi định lượng ADN, tiến hành phân tích real-time PCR định lượng để cung cấp dữ liệu về sự ức chế phản ứng PCR có thể xảy ra.

Phương pháp PCR gen SPS đã được thử nghiệm bởi ba nhà nghiên cứu sử dụng ADN bộ gen gạo và cho ra các kết quả thỏa đáng; đặc biệt trong PCR định lượng, độ chệch thấp hơn 25 % trong dải động học của phương pháp (tức là 0,05 ng đến 1,00 ng).

A.2.3.3  Thử nghiệm cộng tác.

Dựng đường chuẫn bằng cách sử dụng các mẫu ADN pha loãng liên tục do GMDL-SJTU chiết tách từ 4 giống gạo bằng phương pháp PCR định lượng. Hiệu năng PCR của phương pháp PCR gen SPS từ 0,846 3 đến 1,223 3 được tính từ độ dốc của đường chuẩn là (10^-^1/a-1) x 100, trong đó a là độ dốc, và độ tuyến tính (hệ số hồi quy, ) trung bình là 0,997.

Các kết quả của 8 mẫu ADN mù được báo cáo trong Bảng A.5. Chúng được đánh giá dựa trên các tiêu chí chấp nhận phương pháp và các yêu cầu tiến hành phương pháp, được thiết lập bởi mạng lưới các phòng thử nghiệm GMO Châu Âu (ENGL) và được thông qua bởi Phòng thử nghiệm Chuẩn Châu Âu về Thực phẩm và Thức ăn chăn nuôi GM (EU-RL GMFF) (Tài liệu tham khảo [60]). Trong Bảng A.5, báo cáo ước lượng độ lặp lại và độ tái lập cho mỗi nồng độ gạo, sau khi xác định và loại bỏ các số lạc bằng kiểm tra Cochran.

...

...

...

Thông số

Các mẫu mù

0,5 ng

0,5 ng

1 ng

1 ng

2 ng

5 ng

5 ng

...

...

...

Phòng thử nghiệm trả kết quả

12

12

12

12

12

12

12

12

...

...

...

1

1

1

1

1

1

1

1

Tổng số dữ liệu

...

...

...

108

108

108

108

108

108

108

Số kết quả bị loại trừ

4

...

...

...

0

8

0

0

0

0

Lý do loại trừ

Kiểm tra

Cochran

...

...

...

Cochran

-

Kiểm tra

Cochran

-

-

-

-

Giá trị trung bình

...

...

...

0,412 1

0,814 6

0,734 4

1,857 5

5,261 0

5,445 7

10,899 6

Độ lệch chuẩn lặp lại

0,058 3

...

...

...

0,143 5

0,111

0,336 2

0,936 4

1,142 7

1,867 7

Hệ số biến thiên lặp lại, %

14,29

17,44

...

...

...

15,11

18,10

17,80

20,98

17,15

Độ lệch chuẩn tái lập

0,130 2

0,061 8

0,249 6

...

...

...

0,201 3

0,810 9

0,989 6

1,617 5

Hệ số biến thiên tái lập, %

31,92

14,99

30,65

12,63

...

...

...

15,41

18,17

14,85

Độ chệch, giá trị tuyệt đối

0,092 2

0,087 8

0,185 3

0,265 5

0,142 4

...

...

...

-0,445 8

-0,889 6

Độ chệch, %

-18,44

-17,57

-18,54

-26,53

-7,12

5,22

...

...

...

8,90

A.2.3.4  Chọn lọc phân tử

A.2.3.4.1  Yêu cầu chung

Các mồi và đoạn dò đích SPS có độ dài ADN 81 bp được nêu ra trong Bảng A.6.

Bảng A.6 - Trình tự oligonucleotit của các mồi và đoạn dò

Tên

Trình tự ADN oligonucleotide ADN (5’ đến 3’)

Trình tự mồi và đoạn dò của real-time PCR định lượng

Mồi xuôi SPS

...

...

...

Mồi ngược SPS

CggTTgATCTTTTCgggATg

Đoạn dò SPS

HEX- TCCgAgCCgTCCgTgCgTC -TAMRA

A.2.3.4.2  Thực nghiệm

Các mẫu ADN chiết tách từ 11 mẫu thực vật khác nhau (bao gồm gạo) được phân tích bằng phương pháp PCR gen SPS. Trong số 11 mẫu, chỉ có mẫu ADN gạo cho các kết quả dương tính. Mười mẫu mẫu khác (tre, có lông xanh, gạo mạch, gạo mì, kê vàng, cải dầu, cà chua, khoai tây, đậu tương và Arabidopsis) cho các kết quả âm tính.

Các mẫu ADN chiết tách từ 12 giống gạo khác nhau được phân tích bằng phương pháp PCR đặc hiệu được phát triển để phát hiện gen SPS. Tất cả 12 mẫu đều cho các kết quả dương tính.

A.2.3.4.3  Lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò của gen SPS được đánh giá thông qua tìm kiếm sự tương đồng tại cơ sở dữ liệu BLASTN 2.0MP-WashU programme (Tài liệu tham khảo [64], ngày tìm kiếm: 09-01-2010). Trình tự 81 bp được sử dụng làm truy vấn là một phần trình tự của mã số tiếp cận NCBI U33175 (nucleotit từ 1055-1135). Các kết quả tìm kiếm đã xác nhận sự đồng dạng hoàn toàn của trình tự truy vấn với trình tự gen SPS của gạo, và không có sự tương đồng với các gen khác và loài khác.

...

...

...

Đoạn 81 bp của gen SPS được khuếch đại bằng cách sử dụng hai mồi đặc hiệu sps ở gạo. Đo sản phẩm PCR tích lũy cuối mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu sps ở gạo được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang (xem Bảng A.6). Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^®1) được sử dụng. Tín hiệu huỳnh quang được đo vượt qua giá trị ngưỡng, được xác định bởi người phân tích sau một số chu kì nhất định, số này được gọi là giá trị Ct. Để định lượng tổng số ADN sps ở gạo trong mẫu chưa biết, giá trị Ct được chuyển đổi thành giá trị số bản sao tương ứng bằng cách so sánh với đường chuẩn mà giá trị Ct liên kết trực tiếp với các số bản sao đã biết (phân tích hồi quy).

A.2.5  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong Điều này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa của TCVN 6910-1 (ISO 5725-1)^[51^] và TCVN 7608 (ISO 24276).

A.2.6  Số lượng và loại mẫu

Các mẫu ADN chiết tách từ bốn giống gạo, được sử dụng để dựng các đường chuẩn trong nghiên cứu cộng tác này. Sau đó, tám mẫu mù được phân tích bằng cách sử dụng bốn đường chuẩn đã dựng.

Các phòng thử nghiệm tham gia đã nhận các mẫu sau.

- 4 mẫu ADN từ các giống gạo khác nhau (3M, giống Indica từ Hoa Kỳ; Balilla, giống Japonica từ Ý; Guangluai, giống Indica từ Miền Nam Trung Quốc, và Shennong265, giống Japonica Trung Quốc), 50 ng/μl, mỗi mẫu 30 μl. ADN của mỗi giống gạo được pha loãng và sử dụng để dựng đường chuẩn tương ứng.

- 8 mẫu ADN mù từ 4 giống gạo khác nhau có các nồng độ khác nhau (0 ng/μl đến ~ 50 ng/μl), mỗi mẫu 50 μl.

- Kiểm chứng âm ADN đích (dán nhãn N): ADN tinh trùng cá hồi (20 ng/μl).

...

...

...

- Các mồi và đoạn dò của hệ thống PCR gen SPS (xem Bảng A.6) và các thuốc thử phản ứng như sau:

- hỗn hợp gốc PCR (real-time) (1 ml x 6);

- dung dịch pha loãng ADN (0,1 x TE, 1,2 ml).

A.2.7  Giới hạn định lượng (LOQ) và phạm vi áp dụng

Theo phương pháp, LOQ tuyệt đối của phương pháp là 0,01 ng/μl. LOQ tương đối của PCR định lượng không được đánh giá trong thử nghiệm cộng tác.

A.2.8  Ước tính độ không đảm bảo đo

Công bố độ không đảm bảo đo chung của phương pháp từ các kết quả của thử nghiệm cộng tác (xem Bảng A.5).

A.2.9  Các yếu tố gây nhiễu

Quan trọng nhất đối với độ nhạy của phương pháp là tổng số và khả năng khuếch đại axit nucleic dùng làm khuôn mẫu cho real-time PCR. Ngoài điểm tổng quát này, không có các yếu tố gây nhiễu cụ thể nào được nêu ra ở phương pháp này.

...

...

...

Các quy trình yêu cầu điều kiện vô trùng khi tiến hành công việc.

Duy trì chặt chẽ các khu vực làm việc tách biệt để chiết tách ADN, chuẩn bị PCR và khuếch đại.

Bất kỳ ADN tồn dư trên thiết bị cần phải được loại bỏ trước khi sử dụng.

Để tránh ô nhiễm, cần sử dụng đầu hút lọc (A.2.11.6) để ngăn ngừa khí dung.

Chỉ sử dụng găng tay không bột (A.2.11.8) và thường xuyên thay mới găng tay.

Làm sạch định kỳ thiết bị và bàn thí nghiệm với dung dịch natri hypochlorit (10 % clo hoạt động).

Các pipet cần được hiệu chỉnh thường xuyên, nếu cần.

A.2.11  Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị phòng thử nghiệm thông thường, cụ thể như sau.

...

...

...

A.2.11.2  Tủ đông, duy trì ở âm 20 °C và tủ lạnh duy trì ở 4 °C.

A.2.11.3  Micropipet.

A.2.11.4  Máy vortex.

A.2.11.5  Ống nghiệm, dung tích 0,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.

A.2.11.6  Đầu hút và đầu hút lọc cho micropipet.

A.2.11.7  Giá, để các ống phản ứng.

A.2.11.8  Găng tay vinyl hoặc latex.

A.2.11.9  Máy hút chân không, phù hợp để làm khô các hạt ADN, tùy chọn.

A.2.11.10  Hệ thống real-time PCR với các lọ nhựa phản ứng phù hợp để đo huỳnh quang.

...

...

...

A.2.11.12  Các khay phản ứng quang học 96 giếng, MicroAmp^®^1) (Applied Biosystems Part No N801-0560^1^)).

A.2.11.13  Miếng phủ quang học, MicroAmp^®1) (Applied Biosystems Part No 4311971^1)).

A.2.11.14  Các nắp quang học, MicroAmp^®1) (Applied Biosystems Part No 801-0935^1^)).

A.2.12  Vật liệu và thuốc thử

A.2.12.1  Yêu cầu chung

Trừ khi có quy định khác, chỉ sử dụng thuốc thử phù hợp với các đặc điểm kỹ thuật của TCVN 7608 (ISO 24276) và dùng nước cất hoặc nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

A.2.12.2  Chiết tách ADN

A.2.12.2.1  Cetyltrimethylammonium bromua (CTAB), cấp độ siêu tinh khiết.

A.2.12.2.2  Tris-(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (tris), cấp độ sinh học phân tử.

...

...

...

A.2.12.2.4  Etanol, φ[CH₃CH₂OH], ít nhất 96 % phần thể tích.

A.2.12.2.5  Isopropanol, φ[CH₃CH(OH)CH₃], ít nhất 99,7 % phần thể tích.

A.2.12.2.6  Chloroform, φ(CHCI₃), ít nhất 99 % phần thể tích.

A.2.12.2.7  Natri clorua, w(NaCI), ít nhất 99 % phần khối lượng

A.2.12.2.8  Natri hydroxit, khan, w(NaOH), ít nhất 98 % phần khối lượng.

A.2.12.2.9  Dung dịch RNase A, 10 mg/ml.

A.2.12.2.10  Dung dịch Proteinase K, 20 mg/ml.

A.2.12.2.11  Đệm pha loãng: tris (A.2.12.2.2), 10 mmol/l, pH 9,0.

A.2.12.2.12  Axit clohydric,

...

...

...

A.2.12.3  Real-time PCR định lượng.

TaqMan^®1) universal PCR master mix (1x) hoặc tương đương phù hợp.

A.2.13  Thu thập mẫu, vận chuyển, bảo quản và lưu mẫu

Dung dịch ADN có thể được giữ ở 4 °C trong tối đa 1 tuần, hoặc ở âm 20 °C để lưu trữ lâu hơn (A.2.11.2). Để chuẩn bị cho real-time PCR định lượng, thuốc thử PCR phải được rã đông ở 1 °C đến 4 °C trong đá lạnh.

A.2.14  Chuẩn bị mẫu thử

Đảm bảo rằng mẫu thử nghiệm là đại diện cho mẫu phòng thử nghiệm, ví dụ: bằng cách nghiền hoặc đồng nhất. Các bước đo và thao tác được tiến hành như mô tả chi tiết trong TCVN 7606 (ISO 21571). Đối với nghiên cứu cộng tác, tổng cộng 1 g mì gạo nghiền đã được sử dụng.

A.2.15  Hiệu chuẩn thiết bị

Các thiết bị, ví dụ: máy chu trình nhiệt và pipet phải được hiệu chuẩn, ví dụ: theo TCVN ISO/IEC 17025^[61]

A.2.16  Các bước phân tích

...

...

...

A.2.16.1.1  Chuẩn bị ADN để dựng đường chuẩn

Mỗi mẫu ADN gạo có nồng độ 50 ng/μl được pha loãng thành 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0,1 ng/μl, 0,01 ng/μl, 0,002 ng/μl sử dụng dung dịch pha loãng ADN được cung cấp bởi tổ chức phát triển phương pháp và real-time PCR dựng đường chuẩn bằng cách sử dụng 5 μl mỗi mẫu ADN pha loãng.

Đối với các yêu cầu cụ thể, xem TCVN 7606 (ISO 21571).

A.2.16.1.2  Thuốc thử PCR

A.2.16.1.3  Hỗn hợp gốc PCR

Xem A.2.12.3

A.2.16.1.4  Mồi và đoạn dò

Xem Bảng A.6.

A.2.16.2  Quy trình

...

...

...

Phương pháp PCR định lượng gen gạo SPS có tổng thể tích hỗn hợp phản ứng là 25 μl.

Rã đông, trộn nhẹ nhàng và li tâm hỗn hợp gốc real-time PCR định lượng và các mẫu ADN cần phải phân tích. Giữ các thuốc thử rã đông ở nhiệt độ 1 °C đến 4 °C trong đá lạnh.

Phân phối 20 μl hỗn hợp gốc PCR vào mỗi ống phản ứng PCR 200 μl (A.2.11.5). Thêm 5 μl các mẫu dung dịch ADN, kiểm chứng dương gạo, kiểm chứng âm và kiểm chứng trắng (H₂O) vào các ống, tương ứng.

Trộn nhẹ nhàng các ống PCR và li tâm trong máy li tâm (A.2.11.1) ở 1000g trong 10 s.

Chạy PCR với điều kiện chu trình real-time PCR định lượng.

A.2.16.2.2  Kiểm chứng PCR

Xem A.2.6.

A.2.16.2.3  Chuẩn bị các chuẩn

Dựng các đường chuẩn bằng cách vẽ các giá trị Ct đối với logarit số lượng ADN đích, bằng nanogam. Thực hiện bằng cách sử dụng bảng tính [ví dụ: Microsoft Excel] hoặc trực tiếp bằng các tùy chọn sẵn có với phần mềm hệ thống phát hiện trình tự (A.2.11.11).

...

...

...

A.2.16.2.4  Chương trình thời gian-nhiệt độ (PCR)

Phép thử PCR đã được tối ưu để sử dụng cho hệ thống phát hiện trình tự ABI Prism^®1) 7700 và hệ thống real-time PCR Rotor Gene 3000A^1) (A.2.11.10). Có thể sử dụng các hệ thống phát hiện trình tự khác. Trong những trường hợp này, các điều kiện có thể cần phải điều chỉnh. Chương trình thời gian- nhiệt độ cho real-time PCR định lượng được nêu ra trong Bảng A.7.

Bảng A.7 - Chương trình thời gian-nhiệt độ cho real-time PCR định lượng

STT

Giai đoạn

T

°C

Thời gian

s

...

...

...

Chu kì

1

Biến tính và hoạt hóa ADN polymerase

95

900

Không

1 x

2

Khuếch đại

...

...

...

95

15

Không

40 x

3

Gắn mồi và kéo dài

60

45

Đo lường

...

...

...

A.2.16.2.5.1  Chấp nhận và tiến hành các tiêu chuẩn mô tả trong Tài liệu tham khảo [60].

Sử dụng các yêu cầu tiến hành phương pháp để đánh giá các kết quả từ nghiên cứu cộng tác được nêu trong A.2.16.2.5.2 đến A.2.16.2.5.4.

A.2.16.2.5.2  Dải động học của phương pháp gồm ít nhất năm nồng độ đích có độ pha loãng 1/10. Nồng độ đích dự kiến là ngưỡng liên quan với yêu cầu luật pháp.

A.2.16.2.5.3  Hệ số biến thiên của độ tái lập phải ở mức dưới 35 % nồng độ đích và trên toàn dải động học. C_V,R< 50 % được chấp nhận khi nồng độ dưới 0,2 %.

A.2.16.2.5.4  Độ đúng cần nằm trong khoảng ± 25 % giá trị chuẩn được chấp nhận trên toàn dải động học.

A.2.16.2.6  Xác định

Sử dụng đoạn dò TaqMan^®1) cho phép xác định chính xác các sản phẩm PCR.

A.2.17  Xác định mẫu

Xem A.2.6.

...

...

...

Sau khi kết thúc real-time PCR định lượng, định vị ngưỡng trong vùng có dữ liệu khuếch đại song song (giai đoạn PCR theo hàm số mũ - kiểu logarit) và không có hiệu ứng chéo giữa các lần lặp lại của cùng một mẫu. Xác định số chu kì mà tại đó ngưỡng đi qua đường cong khuếch đại đầu tiên và thiết lập đường nền trước giá trị ngưỡng 3 chu kì. Xuất tất cả các dữ liệu cho các tính toán tiếp theo.

Sau khi xác định một giá trị ngưỡng trong giai đoạn khuếch đại logarit như mô tả trên, giá trị Ct của mỗi phản ứng được tính toán bằng cách sử dụng phần mềm thiết bị. Dựng đường chuẩn theo các giá trị Ct ở ngưỡng và theo các giá trị logarit thập phân của lượng ADN khuôn mẫu ban đầu.

Sau đó, sử dụng các đường chuẩn để ước lượng hàm lượng ADN trong mẫu ADN mù bằng cách nội suy từ các đường chuẩn.

A.2.19  Lưu giữ hồ sơ

Lưu trữ hồ sơ phải phù hợp với các yêu cầu của TCVN ISO/IEC 17025 ^[^61].

A.2.20  Báo cáo

Báo cáo phải tuân thủ các yêu cầu của TCVN 7608 (ISO 24276) và TCVN ISO/IEC 17025 ^[^61^].

A.2.21  Các biện pháp an toàn

Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608 (ISO 24276).

...

...

...

Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608 (ISO 24276).

A.3  Phương pháp đặc hiệu taxon đích để phát hiện các thành phần có nguồn gốc từ cà chua (Lycopersicon esculentum)

A.3.1  Nguyên tắc

Gen LAT52 mã hoá một protein giàu cysteine, gắn cacbonhydrate, ổn định nhiệt, cần thiết cho sự phát triển của phấn cà chua. Phương pháp phát hiện LAT52 phù hợp dùng làm gen nội chuẩn trong việc xác định và định lượng cà chua GM (Tài liệu tham khảo [62]). Phòng thử nghiệm Phát hiện GMO của Trường Đại học Tổng hợp Jiao Tong Thượng Hải (GMDL-SJTU) đã tổ chức thử nghiệm cộng tác để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phát hiện gen LAT52 ở cà chua làm gen nội chuẩn cho phép phân tích định lượng cà chua biến đổi gen (GM) hoặc không biến đổi gen (non-GM). Nghiên cứu gồm 13 phòng thử nghiệm từ Mỹ, Singapore, Hàn Quốc, Lithuania, Slovenia, Na Uy, Ý và Trung Quốc. Các kết quả có trong Tài liệu tham khảo [63], Phụ lục 1 và 2.

Quy trình nghiên cứu cộng tác bao gồm các mô-đun sau:

- Real-time PCR định lượng để dựng đường chuẩn định lượng bằng cách sử dụng các mẫu ADN cà chua từ bốn giống cà chua khác nhau.

- Real-time PCR định lượng để định lượng các mẫu ADN cà chua làm mù bằng cách sử dụng các đường chuẩn đã được xây dựng.

Thử nghiệm vòng được thực hiện theo các hướng dẫn được quốc tế chấp nhận, bao gồm:

- TCVN 6910 (ISO 5725)^[^51^]-[5^6^] được xem xét đặc biệt liên quan đến độ chính xác (độ lặp lại và độ tái lập) và độ đúng;

...

...

...

A.3.2  Phạm vi áp dụng

Phương pháp này dùng cho phát hiện ADN cà chua bằng PCR định lượng.

Phương pháp đã được tối ưu đối với hạt cà chua, quả cà chua, nước sốt cà chua và nước ép cà chua, chứa hỗn hợp cà chua và các nền mẫu khác như ngô và đậu tương. Khả năng áp dụng của gen LAT52 đã được kiểm tra thông qua thử nghiệm cộng tác sử dụng các mẫu ADN chiết tách từ hạt cà chua.

A.3.3  Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và các tiêu chí thực hiện

A.3.3.1  Độ mạnh của phương pháp

Độ mạnh của phương pháp real-time PCR định lượng LAT52 đã được thử nghiệm bởi tổ chức phát triển phương pháp với ba chương trình thời gian-nhiệt độ khác nhau (hai bước và ba bước; với ba nhiệt độ gắn mồi khác nhau, gồm 58 °C, 59 °C và 60 °C), trên ba mẫu ADN khác nhau chứa tổng số ADN cà chua biết trước (10 ng, 1 ng, 0,1 ng các mẫu ADN bộ gen cà chua và mỗi mẫu lặp lại ba lần). Phương pháp real-time PCR định lượng có độ mạnh mong muốn ở các chương trình thời gian-nhiệt độ và ở ba nồng độ mẫu ADN cà chua.

Phương pháp PCR định lượng gen LAT52 cũng được thử nghiệm trên các thiết bị real-time PCR khác nhau [Rotor gene 3000A,^1) Corbett Research và ABI7700^1)], với ba thể tích phản ứng khác nhau (20 μl, 25 μl, và 30 μl, và ba lần lặp lại trên một thể tích). Các phương pháp real-time PCR định lượng cho thấy độ mạnh dự kiến phù hợp khi sử dụng với các thiết bị real-time PCR khác nhau với các thể tích phản ứng khác nhau.

A.3.3.2  Thử nghiệm nội bộ

Gen LAT52 của cà chua đã được xác nhận sử dụng làm gen nội chuẩn trong xác định và định lượng cà chua GM (Tài liệu tham khảo [62]). Phương pháp PCR LAT52 cũng được thử nghiệm bởi ba đơn vị của GMDL-SJTU sử dụng ADN bộ gen cà chua và có kết quả khả quan; đặc biệt trong PCR định lượng, độ chệch thấp hơn 25 % trong toàn dải động học (tức là 0,05 ng đến 1,00 ng).

...

...

...

Các kết quả thử nghiệm cộng tác được tóm tắt và báo cáo trong Tài liệu tham khảo [63], Tóm lại, để chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu cộng tác, tất cả các mẫu ADN được chiết tách bằng GMDL-SJTU sử dụng phương pháp CTAB được thông qua trong A.3 của TCVN 7606 (ISO 21571). Định lượng quang phổ lượng ADN chiết tách được bằng phương pháp trong B.1 của TCVN 7606 (ISO 21571). Sau khi định lượng ADN, tiến hành phân tích real-time PCR định lượng để cung cấp dữ liệu về sự ức chế PCR có thể xảy ra. Sau đó gửi đến mỗi phòng thử nghiệm tham gia các mẫu ADN đã được chuẩn bị.

Dựng các đường chuẩn bằng cách sử dụng các mẫu ADN pha loãng từ bốn giống hạt cả chua bằng phương pháp PCR định lượng: hiệu suất PCR trung bình của phương pháp PCR gen LAT52 là 96,6 %, được tính từ độ dốc của đường chuẩn là (10^-^1/a - 1) x 100, a là độ dốc, và độ tuyến tính (hệ số hồi quy, Rc^2) trung bình là 0,997.

Các kết quả thử nghiệm cộng tác của tám mẫu ADN làm mù được tóm tắt trong Bảng A.8. Các yêu cầu về tiến hành phương pháp, được thiết lập bởi Mạng lưới các Phòng thử nghiệm GMO Châu Âu (ENGL) và được thông qua bởi các Phòng thử nghiệm Chuẩn Liên minh Châu Âu (EURL) (Tài liệu tham khảo [60]) được sử dụng để đánh giá các dữ liệu này. Sau khi loại bỏ các giá trị số lạc thông qua khoảng tin cậy 95 % theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2)^[52^] độ lặp lại và độ tái lập của mỗi nồng độ cà chua được nêu trong Bảng A.8.

Bảng A.8 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp real-time PCR gen LAT52

Thông số

Tổng số ADN đích cà chua chưa biết

0,5 ng

0,05 ng

Zhongsu5

...

...

...

Zaofeng

Lichun

Zhongsu5

R144

Zaofeng

Lichun

Số phòng thử nghiệm có kết quả gửi trả

13

13

...

...

...

13

13

13

13

13

Số mẫu/ phòng thử nghiệm

4

4

4

...

...

...

4

4

4

4

Dữ liệu bị loại trừ

2

5

4

4

...

...

...

8

7

10

Lý do loại trừ

Dữ liệu không nằm trong khoảng tin cậy 95 %

Giá trị trung bình

0,446 8

0,480 6

0,487 5

...

...

...

0,045 9

0,049 0

0,049 8

0,045 7

Độ lệch chuẩn lặp lại

0,120

0,122

0,109

0,133

...

...

...

0,015

0,014

0,011

Hệ số biến thiên lặp lại, %

26,76

25,41

22,46

27,12

32,06

...

...

...

29,00

24,73

Độ lệch chuẩn tái lập

0,084

0,077

0,073

0,091

0,007

0,009

...

...

...

0,004

Hệ số biến thiên tái lập, %

18,751

15,99

15,04

18,68

15,00

18,61

14,21

...

...

...

Độ chệch, giá trị tuyệt đối

0,053

0,019

0,012

0,011

0,004

0,001

0,000

0,004

...

...

...

10,64

3,88

2,50

2,29

8,26

1,92

0,43

8,68

A.3.3.4  Chọn lọc phân tử

...

...

...

Phương pháp này nhằm vào gen LAT52 có mặt ổn định với một bản sao đơn cho mỗi bộ gen đơn bội của các giống cà chua khác nhau. Các mồi và đoạn dò đích của đoạn ADN LAT52 có độ dài 92bp được nêu ra trong Bảng A.9.

Bảng A.9 - Các trình tự mồi và đoạn dò oligonucleotit

Tên

Trình tự ADN oligonucleotit (5’ đến 3’)

Trình tự mồi và đoạn dò real-time PCR định lượng

Mồi F LAT52

AgACCACgAGAACgATATTTgC

Mồi R LAT52

TTCTTgCCTTTTCATATCCAgACA

...

...

...

HEX-CTCTTTgCAgTCCTCCCTTgggCT-BHQ

A.3.3.4.2  Thực nghiệm

Mẫu ADN chiết tách từ 11 vật liệu thực vật khác nhau (bao gồm cà chua) được phân tích bằng phương pháp PCR gen LAT52 (Tài liệu tham khảo [62]). Trong số 11 mẫu, chỉ có ADN cà chua cho kết quả dương tính, 10 mẫu còn lại, như cà tím, khoai tây, dã yên thảo, ớt, ngô, đậu tương, cải dầu, gạo, thuốc lá và Arabidopsis cho kết quả âm tính.

Các mẫu ADN chiết tách từ 12 giống cà chua khác nhau có nguồn gốc địa lý và phát sinh loài khác nhau, ví dụ: Shengnong 2, Jifan4, Zhongsu5, Yashu6, Jiafen1, Shenfeng2, Hongza9, R144, Nongyou30, Dongnong70, Lichun và Zaokui đã được phân tích bằng PCR gen LAT52 theo phương pháp đã được phát triển. Tất cả 12 mẫu đều cho kết quả dương tính.

A.3.3.4.3  Lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của mồi và đoạn dò LAT52 được phân tích bằng cách tìm kiếm tương đồng bằng chương trình BLASTN 2.0MP-WashU (Tài liệu tham khảo [64], ngày tìm kiếm: 20-01-2010). Trình tự 92 bp của LAT52 được sử dụng làm chuỗi truy vấn là một phần của mã số tiếp cận NCBI X15855 (nucleotit 1385-1476), và kết quả phân tích trên BLAST đã xác nhận sự tương đồng hoàn toàn của trình tự truy vấn với các trình tự gen LAT52 đặc hiệu bao phấn cà chua.

A.3.4  Nguyên tắc

Phương pháp này là một quy trình real-time PCR định lượng sử dụng TaqMan^®1) để định lượng trình tự đích LAT52 ở cà chua. Định lượng các sản phẩm PCR bằng tín hiệu huỳnh quang trong mỗi chu kì PCR bằng cách sử dụng đoạn dò oligonucleotít đặc hiệu LAT52 đánh dấu với hai thuốc nhuộm huỳnh quang: HEX là thuốc nhuộm phát huỳnh quang ở đầu 5' và TAM RA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang ở đầu 3'. Giá trị Ct được sử dụng để tính toán hàm lượng ADN cà chua, và giá trị Ct là chu kì ngưỡng với tín hiệu huỳnh quang quan sát vượt qua một giá trị ngưỡng sau một số chu kì nhất định.

Để định lượng số bản sao gen LAT52 ở cà chua trong mẫu chưa biết, giá trị Ct của mẫu được xác định. Sử dụng bốn điểm chuẩn để dựng đường chuẩn và tính số bản sao tương ứng của các mẫu phân tích ADN.

...

...

...

Trong Điều này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa của TCVN 6910-1 (ISO 5725-1)^[51] và TCVN 7608 (ISO 24276).

A.3.6  Số lượng và loại mẫu

Bốn mẫu ADN từ các giống cà chua khác nhau, như R144, Zhongsu5, Zaofeng và Lichun, 50 ng/μl, pha loãng 30 μl mỗi giống để dựng các đường chuẩn.

Tám mẫu ADN cà chua chưa biết từ 4 giống cà chua khác nhau với các nồng độ khác nhau (0 ng/μl đến 50 ng/μl) và các nồng độ GM khác nhau được sử dụng, mỗi mẫu 50 μl.

A.3.7  Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), phạm vi áp dụng

LOQ tuyệt đối của phương pháp PCR định lượng là 0,01 ng mỗi phản ứng, tương ứng với khoảng 11 bản sao ADN bộ gen cà chua đơn bội. LOD của phương pháp PCR định lượng không được đánh giá trong thử nghiệm cộng tác.

A.3.8  Ước tính độ không đảm bảo đo

Công bố độ không đảm bảo đo chung của phương pháp từ các kết quả thử nghiệm cộng tác (xem A.3.3.3).

A.3.9  Các yếu tố gây nhiễu

...

...

...

A.3.10  Các điều kiện vật lý và môi trường

Các quy trình cần phải thực hiện trong điều kiện vô trùng.

Duy trì các không gian làm việc riêng biệt cho việc chiết tách ADN, chuẩn bị PCR và khuếch đại.

Bất kỳ ADN tồn dư cần phải loại bỏ khỏi thiết bị trước khi sử dụng.

Để tránh ô nhiễm, sử dụng đầu hút lọc (A.3.11.6) để bảo vệ khỏi khí dung.

Chỉ sử dụng găng tay không bột (A.3.11.8) và thường xuyên thay mới.

Bàn thí nghiệm và thiết bị cần phải được làm sạch định kỳ bằng dung dịch natri hypochlorite (Clo hoạt động 10 %) (thuốc tẩy).

Pipet nên được kiểm tra độ chính xác và thường xuyên hiệu chỉnh.

A.3.11  Thiết bị và dụng cụ

...

...

...

A.3.11.1  Máy li tâm.

A.3.11.2  Tủ đông bảo quản ở âm 20 °C và tủ lạnh duy trì ở 4 °C.

A.3.11.3  Micropipet.

A.3.11.4  Máy vortex.

A.3.11.5  Ống nghiệm, dung tích 0,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.

A.3.11.6  Đầu hút và đầu hút lọc cho micropipet.

A.3.11.7  Giá để các ống phản ứng.

A.3.11.8  Găng tay vinyl hoặc latex.

A.3.11.9  Máy hút chân không phù hợp để làm khô hạt ADN, tùy chọn.

...

...

...

A.3.11.11  Các ống phản ứng real-time PCR hoặc các giếng và các nắp quang học hoặc các miếng phủ quang học, nếu phù hợp.

A.3.11.12  Phần mềm: Sequence DeteCtion System^1) phiên bản 1.7 (Applied Biosystems Part No 4311876^1)) hoặc các phiên bản tương đương.

A.3.12  Vật liệu và thuốc thử

Trừ khi có quy định khác, chỉ sử dụng thuốc thử phù hợp với các đặc điểm kỹ thuật của TCVN 7608 (ISO 24276) và chỉ sử dụng nước cất vô trùng hoặc nước khử khoáng vô trùng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

A.3.12.1  Hỗn hợp gốc real-time PCR

A.3.12.2  Oligonucleotit (mồi và đoạn dò).

A.3.13  Thu thập mẫu, vận chuyển, bảo quản và lưu mẫu

Các dung dịch ADN cần được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C trong thời gian tối đa một tuần hoặc ở âm 20 °C khi cần bảo quản lâu hơn (A.3.11.2). Để chuẩn bị cho real-time PCR định lượng, thuốc thử PCR phải được rã đông ở nhiệt độ 1 °C đến 4 °C trong đá lạnh.

A.3.14  Chuẩn bị mẫu thử

...

...

...

A.3.15  Hiệu chuẩn thiết bị

Thiết bị, ví dụ: máy chu trình nhiệt và pipet phải được hiệu chuẩn theo TCVN ISO/IEC 17025.^[^61^]

A.3.16  Các bước phân tích

A.3.16.1  Yêu cầu chung

A.3.16.1.1  Chuẩn bị ADN để dựng đường chuẩn

ADN được chiết tách, định lượng và gửi đến tất cả các phòng thử nghiệm tham gia như được nêu trong A.3.3.3.

Mỗi mẫu ADN cà chua có nồng độ 50 ng/μl được pha loãng đến 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0,1 ng/μl, 0,01 ng/μl, 0,002 ng/μl bởi 0,1 x TE, tương ứng.

A.3.16.1.2  Thuốc thử PCR

A.3.16.1.3  Hỗn hợp gốc real-time PCR

...

...

...

A.3.16.1.4  Mồi

Xem Bảng A.9.

A.3.16.2  Quy trình

A.3.16.2.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị PCR cho PCR định lượng đích là gen LAT52 ở cà chua được phát triển với tổng thể tích hỗn hợp phản ứng 25 μl.

Rã đông, trộn nhẹ nhàng và li tâm hỗn hợp gốc real-time PCR định lượng và các mẫu ADN cần thiết để phân tích. Rã đông thuốc thử ở nhiệt độ 1°C đến 4°C trong đá lạnh.

Phân phối 20 μl hỗn hợp gốc vào mỗi ống phản ứng PCR 200 μl (A.3.11.7). Thêm 5 μl các mẫu dung dịch ADN, kiểm chứng dương cà chua, kiểm chứng âm và kiểm chứng trắng (H₂O) vào các ống tương ứng.

Trộn dung dịch trong ống PCR nhẹ nhàng và li tâm nhanh trong máy li tâm (A.3.11.1).

Đặt khay vào thiết bị.

...

...

...

A.3.16.2.2  Kiểm chứng PCR

Kiểm chứng dương và kiểm chứng âm cần được tiến hành theo TCVN 7608 (ISO 24276).

A.3.16.2.3  Chuẩn bị các chuẩn

Dựng các đường chuẩn bằng cách vẽ các giá trị Ct đối với logarit tổng số ADN đích, bằng nanogam. Có thể được thực hiện điều này bằng cách sử dụng bảng tính [ví dụ: Microsoft Excel^1^)], hoặc trực tiếp bằng các tùy chọn sẵn có với phần mềm phát hiện trình tự (A.3.11.11).

Khối lượng tính bằng nanogam, đo cho mẫu ADN chưa biết có được bằng phép nội suy từ đường chuẩn.

A.3.16.2.4  Chương trình thời gian-nhiệt độ (PCR)

Phép thử PCR được tối ưu để sử dụng cho hệ thống phát hiện trình tự ABI Prism^®1^) 7700 và hệ thống real-time PCR Rotor Gene 3000A^1^) (A.3.11.10). Các thiết bị khác có thể được sử dụng. Trong các trường hợp này, các điều kiện chu trình nhiệt có thể phải điều chỉnh. Chương trình thời gian-nhiệt độ cho real-time PCR định lượng được nêu ra trong Bảng A.10.

Bảng A.10 - Chương trình thời gian-nhiệt độ real-time PCR định lượng

STT

...

...

...

T

°C

Thời gian

s

Tín hiệu

Chu kì

1

Biến tính và hoạt hóa ADN polymerase

95

...

...

...

Không

1 x

2

Khuếch đại

Biến tính

95

15

Không

40 x

...

...

...

Gắn mồi và kéo dài

60

45

Đo lường

A.3.16.2.5  Chấp nhận hoặc từ chối các tiêu chí

A.3.16.2.5.1  Sử dụng các yêu cầu tiến hành phương pháp để đánh giá các kết quả từ nghiên cứu cộng tác được nêu trong A.3.16.2.5.2 đến A.3.16.2.5.4.

A.3.16.2.5.2  Dải động học của phương pháp gồm ít nhất năm nồng độ đích có độ pha loãng 1/10. Nồng độ đích cần được dự kiến là ngưỡng liên quan với yêu cầu luật pháp.

A.3.16.2.5.3  Hệ số biến thiên của độ tái lập phải ở mức dưới 35 % nồng độ đích và trên toàn dải động học. C_v.R< 50 % được chấp nhận khi nồng độ dưới 0,2 %.

A.3.16.2.5.4  Độ đúng cần nằm trong khoảng ± 25 % giá trị chuẩn được chấp nhận trên toàn dải động.

...

...

...

Sử dụng đoạn dò TaqMan^®1) cho phép xác định chính xác các sản phẩm PCR.

A.3.17  Xác định mẫu

Xem A.3.6.

A.3.18  Diễn giải và tính kết quả

Sau khi kết thúc real-time PCR định lượng, xác định ngưỡng trong vùng có dữ liệu khuếch đại song song (giai đoạn PCR theo hàm số mũ - kiểu logarit) và không có hiệu ứng chéo giữa các lần lặp lại của cùng một mẫu. Xác định số chu kì mà tại đó ngưỡng đi qua đường cong khuếch đại đầu tiên và thiết lập đường nền trước giá trị ngưỡng 3 chu kì. Xuất tất cả các dữ liệu cho các tính toán tiếp theo.

Sau khi xác định một giá trị ngưỡng trong giai đoạn khuếch đại logarit như mô tả trên, giá trị Ct của mỗi phản ứng được tính toán bằng phần mềm thiết bị.

Dựng đường chuẩn theo các giá trị Ct ở ngưỡng và các giá trị logarit thập phân của số lượng ADN khuôn mẫu ban đầu.

Sau đó, sử dụng các đường chuẩn để tính toán hàm lượng ADN trong mẫu ADN chưa biết bằng cách nội suy từ các đường chuẩn.

A.3.19  Lưu giữ hồ sơ

...

...

...

A.3.20  Báo cáo

Báo cáo phải tuân thủ các yêu cầu của TCVN 7608 (ISO 24276) và TCVN ISO/IEC 17025 ^[^61^]

A.3.21  Các biện pháp an toàn

Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608 (ISO 24276).

A.3.22  Ngăn ngừa ô nhiễm và xử lý chất thải

Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608 (ISO 24276).

Phụ lục B

(Tham khảo)

...

...

...

B.1  Phương pháp sàng lọc để định lượng tương đối ADN promoter 35S ở đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử dụng real-time PCR

B.1.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu để phát hiện một gen đậu tương đặc hiệu taxon (gen lectin, le1) và phát hiện ADN promoter 35S có nguồn gốc từ virút khảm súp lơ để định lượng tổng số ADN promoter 35S trong thành phần đậu tương chứa đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 (Roundup Ready^®).

Các hạn chế, xem B.1.8.

B.1.2  Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng

B.1.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp được tối ưu cho mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM IRMM-410) 7)^[18] gồm có bột đậu tương khô chứa hỗn hợp đậu tương GTS 40-3-2 và đậu tương thông thường.

Đã kiểm tra độ tái lập của các phương pháp mô tả trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng những mẫu chưa biết (các mẫu được gắn nhãn từ SA đến SE, xem Bảng B.1) là các hỗn hợp của các mẫu chuẩn kể trên ^[^19]. Ngoài ra, các thực phẩm thương mại sẵn có cũng đã được kiểm tra ^[^20].

Số bản sao của mỗi trình tự đích trong bộ gen chưa được đánh giá chi tiết ^[21^],[^22^].

...

...

...

B.1.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Năm mẫu chưa biết chứa các nồng độ trong khoảng từ 0,7 % đến 3 % (theo khối lượng) bột đậu tương khô có nguồn gốc từ dòng GTS 40-3-2 được phân tích bởi 11 phòng thử nghiệm tham gia.

Phương pháp phát hiện đặc hiệu promoter 35S có kết quả độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 17 % đến 34 % (xem Bảng B.1). Trong các thực nghiệm ban đầu của thử nghiệm cộng tác, đã xác định CRM đậu tương 1 % không nhất quán với giá trị cho trước. Các nghiên cứu công bố rằng các mẫu chuẩn khác nhau được sản xuất sử dụng các quy trình thực hiện khác nhau tại các thời điểm khác nhau, dẫn đến sự phân hủy ADN ở các mức độ khác nhau. Các đơn vị tham gia thử nghiệm cộng tác được khuyến cáo trong suốt quy trình thử nghiệm cộng tác cần sử dụng CRM 2 % và pha loãng ADN để có được dung dịch ADN đối chứng 1 % dùng trong định lượng.

Đối với tách chiết ADN, sử dụng quy trình mô tả trong Tài liệu tham khảo [23]. Theo đó, ly giải 200 mg mẫu trong 1 ml guanidium hydrochloride//đệm proteinase K (0,5 mol/l//0,8 mg/ml) ở 56°C trong 3 h. Sau bước xử lý RNase, trộn 500 μl dịch chiết đã được làm trong với 1 ml hạt silica của Wizard^® 8) và thu hồi hạt nhựa cùng ADN bám quanh bằng cách cho đi qua cột lọc Wizard^®^8). Sau khi rửa bằng isopropanol, tách rửa ADN ra khỏi nhựa silica trong 10 mmol/l đệm Tris pH 9,0 ở 70°C. Nồng độ ADN được ước tính bằng đo OD ở bước sóng 260 nm và được điều chỉnh về 20 μg/ml. Để phân tích PCR, 200 ng ADN từ mỗi mẫu đã được phân tích trong hai phản ứng độc lập.

Các mẫu được phân tích lặp lại hai lần.

Vì các mẫu gắn nhãn từ SA đến SE được trộn lẫn với các mẫu chuẩn khác nhau, nên các kết quả thu được với các mẫu này không thể được sử dụng cho việc đánh giá độ đúng của phương pháp real-time PCR được áp dụng. Tuy nhiên, các kết quả có thể được sử dụng cho đánh giá độ chính xác của phương pháp được áp dụng, theo đó các trường hợp nêu trên phản ánh tình huống xấu nhất dẫn đến một ước lượng thấp về độ chính xác của phương pháp real-time PCR áp dụng^[19^].

Việc loại ra các phòng thử nghiệm dựa trên thiết bị real-time PCR được sử dụng và dựa trên tính toán thống kê của các giá trị số lạc. Phương pháp đã phát triển cho các máy chu trình nhiệt khối. Do đó, hai phòng thử nghiệm đang sử dụng một hệ thống LightCycler^®8) đã bị loại trừ trước khi tính toán các giá trị số lạc. Lý do cho sự loại trừ loại máy PCR cụ thể là việc quan sát cho thấy rằng phương pháp được áp dụng cần được điều chỉnh thích hợp và tối ưu hóa cẩn thận nếu chạy trên thiết bị real-time PCR khác với các thiết bị đã được quy định cụ thể trong phương pháp này. Ngoài ra, các phòng thử nghiệm được giữ lại được kiểm tra các giá trị số lạc theo Grubbs [24]. Tuy nhiên, không xác định được giá trị số lạc nào. Chi tiết về các thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng B.1.

Bảng B.1 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng để phát hiện GMO đặc hiệu promoter-35S

...

...

...

SA

SB

SC

SD

SE

Năm thử nghiệm liên phòng

1999

1999

1999

...

...

...

1999

Số phòng thử nghiệm báo cáo kết quả

11

11

11

11

11

Số mẫu cho mỗi phòng thử nghiệm

1

...

...

...

1

1

1

Số phòng thử nghiệm bị loại trừ

2

2

2

2

2

...

...

...

9

9

9

9

9

Số mẫu đã được chấp nhận

9

9

9

...

...

...

9

Giá trị dự kiến (% GMO)

1,4

1,8

3

0,7

1

Giá trị trung bình (% GMO)

1,63

...

...

...

4,04

0,88

1,73

Giá trị trung vị (% GMO)

1,62

1,70

3,46

1,00

1,60

...

...

...

0,28

0,39

1,36

0,21

0,35

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)

17

22

34

...

...

...

20

Giới hạn tái lập R(R = 2,8 S_R)

0,80

1,08

3,82

0,58

0,97

Ngoài ra, bốn mẫu thực phẩm thương mại có sẵn chưa biết chứa khoảng 0,3 % và 36 % (theo khối lượng) (các giá trị trung bình) của đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 đã được phân tích bởi bốn đơn vị tham gia. Phương pháp phát hiện đặc hiệu promoter-35S cho kết quả với độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 17 % đến 28 %^[20].

B. 1.2.3  Đặc hiệu phân tử

...

...

...

Phương pháp này được thiết kế dựa vào một trình tự được mô tả tại cơ sở dữ liệu GenBank^®9) với mã số tiếp cận V00141.

Danh mục cây trồng biến đổi gen chứa promoter-35S của CaMV được cung cấp trong Tài liệu tham khảo [25].

Kết quả dương tính giả có thể xảy ra do trình tự được khuếch đại có nguồn gốc từ virút khảm súp lơ lây nhiễm cho cây súp lơ và các thành viên khác của họ Brassicaceae (Cruciferae) cũng như Resedaceae và Solanaceae ^[^26],[27]. Vì vậy, các kết quả dương tính với Brassicaceae, Resedaceae và Solanaceae cần được xử lý cẩn thận. Các kết quả dương tính có thể chỉ ra sự có mặt của một sản phẩm có nguồn gốc thực vật biến đổi gen nhưng không được coi là bằng chứng về sự có mặt của các sản phẩm có nguồn gốc thực vật biến đổi gen mà không cần xác nhận bổ sung.

Để phân biệt giữa mẫu bị nhiễm virút và mẫu biến đổi gen, có thể sử dụng các phương pháp để phát hiện virút khảm súp lơ^[28].

B.1.2.3.2  Đặc hiệu lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ ^9) bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit như chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3 ^9) [ngày 24 tháng tư năm 2002]. Kết quả của việc tìm kiếm xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

B.1.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Tính đặc hiệu thực nghiệm của phương pháp đã được đánh giá bằng phân tích CRM IRMM-410 từ bột đậu tương khô IRMM chứa từ 0 % đến 5 % đậu tương dòng GTS 40-3-2 và các mẫu chuẩn từ Hiệp hội Quốc tế Nghiên cứu Thực phẩm Leatherhead 9) gồm bột đậu tương chưa tách dầu (Lot No.2/99-01) chứa 0 %, 0,3 %, 1,25 % và 2 % đậu tương GTS 40-3-2, tương ứng.

Các nền mẫu thực phẩm thương mại đã được thử nghiệm là bột đậu tương, protein tách chiết từ đậu tương, thực phẩm tổng hợp chứa bột đậu tương và protein đậu tương.

...

...

...

Tối ưu hóa được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^® 7700 ^9^) sử dụng hóa chất TaqMan^®9)

Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express^® (Applied Biosystems)^9).

B.1.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

Vì là phương pháp định lượng, nên LOD đã không được đánh giá cụ thể. LOD dự kiến là tốt hơn hoặc bằng với giới hạn định lượng; ví dụ 50 bản sao bộ gen của đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000 bản sao bộ gen của đậu tương thông thường.

B.1.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ đã được đánh giá bằng cách đo các dãy pha loãng ADN đích theo Tài liệu tham khảo [20],

Theo các phòng thử nghiệm phân tích, LOQ là 50 bản sao gen đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000 bản sao bộ gen đậu tương thông thường. Đối với giá trị 1C, xem Tài liệu tham khảo [20]. Điều này cho ước lượng LOQ tương đối là 0,06 (= 50 bản sao/82 000 bản sao x 100 %).

Các nồng độ được kiểm tra trong thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng B.1.

CHÚ THÍCH: Số lượng bản sao không được xác định trong thử nghiệm cộng tác.

...

...

...

Chưa có thông tin cụ thể.

B.1.4  Nguyên tắc

Đoạn ADN có chiều dài 82 bp của trình tự promoter-35S CaMV được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai mồi đặc hiệu promoter-35S. Các sản phẩm PCR được đo trong mỗi chu trình PCR (real-time) bằng một đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu promoter-35S được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^®10) được sử dụng.

Đoạn ADN có chiều dài 81 bp của trình tự gen lectin đậu tương được khuếch đại bằng PCR trong một phản ứng real time PCR riêng biệt sử dụng hai mồi đặc hiệu gen lectin đậu tương, và các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan^® đặc hiệu gen lectin ở đậu tương ^10).

Phép định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng hoặc phương pháp ΔΔCt hoặc phương pháp đường chuẩn kép (xem B.1.9).

B.1.5  Thuốc thử

B. 1.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

B.1.5.2  Nước

...

...

...

B.1.5.4  Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l

B.1.5.5 Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (mỗi loại)

B.1.5.6  Các oligonucleotit

Chi tiết của các oligonucleotit được liệt kê trong Bảng B.2.

Bảng B.2 - Các oligonucleotit

Tên

Trình tự ADN oligonucleotit

Nồng độ cuối trong PCR

Trình tự đích gen đối chứng

...

...

...

5’-TCC ACC CCC ATC CAC ATT T-3'

900 nmol/l

Lectin- R

5'-ggC ATA gAA ggT gAA gTT gAA ggA-3'

900 nmol/l

Lectin- TMP

5'-FAM-AAC Cgg TAg CgT TgC CAg CTT Cg-TAMRA-3'a

100 nmol/l

Trình tự đích GMO

...

...

...

5'-gCC TCT gCC gAC AgT ggT-3'

900 nmol/l

35S-R

5’-AAg ACg Tgg TTg gAA CgT CTT C-3’

900 nmol/l

35S-TMP

5’-FAM-CAA AgA Tgg ACC CCC ACC CAC g-TAMRA-3’a

100 nmol/l

^a FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.

...

...

...

B.1.5.7  Enzym ADN Polymerase chịu nhiệt

Enzym ADN Polymerase của AmpliTaq Gold^®11)

B.1.5.8  Uracil N-glycosylase (tùy chọn)

B.1.6  Thiết bị, dụng cụ

B.1.6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

B.1.6.2  Máy chu trình nhiệt

Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được thử nghiệm ban đầu với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS và GeneAmp^® 5700 SDS (Applied Biosystems)^11). Các hệ thống phát hiện real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp các điều kiện phản ứng.

B.1.6.3  Các ống phản ứng

...

...

...

B.1.7  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

B.1.7.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích gen đối chứng và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt.

Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.

Phương pháp được quy định cho tổng thể tích PCR 50 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với các thành phần như được liệt kê trong Bảng B.3.

Bảng B.3 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng

Trình tự đích gen đối chứng

Tổng thể tích

50 μl

...

...

...

10 μl

ADN polymerase

AmpliTaq Gold^®

1,25 U

Hệ thống khử nhiễm

dUTP

400 μmol/l

AmpErase^® uracil N-glycosylase

0,5 U

...

...

...

Đệm A của TaqMan^® (chứa chuẩn thụ động ROX)^a

1 x

MgCl₂

5 mmol/l

Mồi

Lectin-F và Lectin-R (xem Bảng B.2)

Xem Bảng B.2

dNTP

...

...

...

200 μmol/l mỗi loại

Đoạn dò

Lectin-TMP (xem Bảng B.2)

xem Bảng B.2

Trình tự đích GMO

Tổng thể tích

50 μl

Khuôn ADN (lượng lớn nhất 200 ng)

10 μl

...

...

...

AmpliTaq Gold™

1,25 U

Hệ thống khử nhiễm

dUTP

400 μmol/l

AmpErase^® uracil N-glycosylase

0,5 U

Đệm phản ứng

Đệm A của TaqMan^® (chứa chuẩn thụ động ROX)^a

...

...

...

MgCl₂

5 mmol/l

Mồi

35S-F và 35S-R (xem Bảng B.2)

Xem Bảng B.2

dNTP

dATP, dCTP, dGTP

200 μmol/l mỗi loại

...

...

...

35S-TMP (xem Bảng B.2)

xem Bảng B.2

^a ROX = carboxy-X-rhodamine.

B.1.7.2  Các kiểm chứng PCR

Các mẫu chuẩn được chứng nhận GTS 40-3-2 (vật liệu chứa từ 0,1 % đến 5 % đậu tương biến đổi gen) được sản xuất bởi IRMM, Geel, Bỉ (dãy IRMM-410)^12) có thể sử dụng làm kiểm chứng dương và làm vật liệu so sánh chuẩn ^[^18].

Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

B.1.7.3  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian-nhiệt độ như được nêu trong Bảng B.4 đã được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^® 7700 (Applied Biosystems) 12). Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng, chương trình được sử dụng kết hợp với ADN polymerase của AmpliTaq Gold^® 12). Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu những điều chỉnh thích hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.

Bảng B.4 mô tả các điều kiện phản ứng.

...

...

...

Thời gian, s

Nhiệt độ, °C

Tiền PCR: khử nhiễm

120

50

Tiền PCR: hoạt hóa ADN polymerase và biến tính khuôn mẫu ADN

600

95

...

...

...

Bước 1

Biến tính

15

95

Bước 2

Gắn mồi và kéo dài

60

...

...

...

B.1.8  Các hạn chế và diễn giải các kết quả

Vì các GMO khác với dòng đậu tương GTS 40-3-2 cũng chứa các trình tự ADN promoter 35S, nên phương pháp này chỉ phù hợp cho định lượng ADN GTS 40-3-2 khi không có mặt các GMO khác. Trong tất cả các trường hợp khác, phương pháp này chỉ có thể được áp dụng cho các mục đích sàng lọc và kiểm soát.

Phương pháp này phù hợp để đo tỉ lệ giữa ADN promoter-35S với ADN đậu tương khi không có mặt GMO khác và các virút khảm súp lơ. Tỉ lệ này phản ánh lượng đậu tương GTS 40-3-2 trong thành phần đậu tương của thực phẩm nghiên cứu. Hàm lượng đậu tương GTS 40-3-2 1 % có thể được xác định nếu tổng số thành phần đậu tương vượt quá 5 % trong thực phẩm nghiên cứu.

CHÚ THÍCH: Nếu chế biến thực phẩm dẫn đến sự phân hủy hoặc loại bỏ ADN (ví dụ: dầu đậu tương tinh luyện, các lecithin đậu tương tinh luyện) thì phương pháp này không cho các kết quả đáng tin cậy.

B.1.9  Hiệu chuẩn và tính kết quả

Sau khi xác định một giá trị ngưỡng (ví dụ: giá trị trong khoảng 0,01 đến 0,1 của thuốc nhuộm phát huỳnh quang được chuẩn hóa (Rn)), hệ thống phát hiện trình tự tính toán các giá trị Ct (chu kì ngưỡng) cho mỗi PCR (phương pháp ΔΔCt). Sự khác biệt giữa các giá trị Ct đặc hiệu lectin và các giá trị Ct đặc hiệu 35S của các mẫu (ΔC_t,sam) và của các mẫu chuẩn (ΔC_t,ref) được tính toán. Lượng tương đối của ADN 35S trong mẫu, w, theo phần trăm, có liên quan chặt với mẫu chuẩn được tính theo (B.1).

w = 2 ^- (Δ^Ct^,^sam^- Δ^Ct^,^ref^) x c_ref

(B.1)

Trong đó c_ref là nồng độ của mẫu chuẩn (mẫu đối chứng).

...

...

...

Để tính kết quả của quy trình thay thế này, điều quan trọng là lượng tuyệt đối của ADN khuôn (ng) là như nhau cho mỗi PCR được sử dụng trong hiệu chuẩn.

Một quy trình thực hiện thay thế khác được mô tả trong C.2.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Các phương pháp đặc hiệu cấu trúc

C.1  Phương pháp đặc hiệu cấu trúc để định lượng ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử dụng real-time PCR (phương pháp 1)

C.1.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và phát hiện một gen đậu tương đặc hiệu taxon (gen lectin, Ie1) và phát hiện ADN có nguồn gốc từ cấu trúc gen đặc hiệu có mặt trong đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2. Phương pháp này thích hợp để định lượng tổng số ADN có nguồn gốc từ đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 trong thành phần đậu tương chứa đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 (Roundup Ready^®13)).

...

...

...

C.1.2  Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng

C.1.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp được tối ưu hóa cho các mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM IRMM-410 ^13)) ^[^18^] gồm bột đậu tương khô chứa hỗn hợp GTS 40-3-2 và đậu tương thông thường.

Đã kiểm tra độ tái lập của các phương pháp mô tả trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết (từ SA đến SE, xem Bảng C.1) là các hỗn hợp của các mẫu chuẩn đã đề cập ở trên ^[19]. Ngoài ra, các thực phẩm thương mại sẵn có đã được kiểm tra ^[20].

Các số bản sao của mỗi trình tự đích trong bộ gen chưa được đánh giá chi tiết ^[^21]^,^[22^].

Phương pháp được công bố trong Tài liệu tham khảo [23].

C.1.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Năm mẫu chưa biết chứa các nồng độ trong khoảng 0,7 % và 3 % (theo khối lượng) bột đậu tương khô có nguồn gốc từ dòng GTS 40-3-2 được phân tích bởi 11 phòng thử nghiệm tham gia.

Phương pháp phát hiện đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 có kết quả độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 16 % đến 28 % (xem Bảng C.1). Trong các thí nghiệm ban đầu của thử nghiệm cộng tác, đã xác định đậu tương CRM 1 % không nhất quán với giá trị cho trước.

...

...

...

Đối với tách chiết ADN, sử dụng quy trình mô tả trong Tài liệu tham khảo [23], Theo đó, ly giải 200 mg mẫu trong 1 ml guanidium hydrochloride//đệm proteinase K (0,5 mol/l//0,8 mg/ml) ở 56 °C trong 3 h. Sau bước xử lý RNase, trộn 500 μl dịch chiết đã được làm trong với 1 ml hạt silica của Wizard^®14) và thu hồi hạt nhựa có ADN bám quanh bằng cách cho đi qua một cột lọc Wizard ^® 14). Sau khi rửa bằng isopropanol, tách rửa ADN ra khỏi nhựa silica trong 10 mmol/l đệm Tris pH 9,0 ở 70 °C. Nồng độ ADN được ước tính bằng cách đo OD ở bước sóng 260 nm và được điều chỉnh về 20 μg/ml. Để phân tích PCR, 200 ng ADN từ mỗi mẫu đã được phân tích trong hai phản ứng độc lập.

Các mẫu được phân tích lặp lại hai lần.

Vì các mẫu gắn nhãn từ SA tới SE là hỗn hợp của các mẫu chuẩn khác nhau, nên các kết quả thu được với các mẫu này không được sử dụng cho việc đánh giá độ đúng của phương pháp real-time PCR. Tuy nhiên, các kết quả có thể được sử dụng cho đánh giá độ chính xác của phương pháp được áp dụng, theo đó các trường hợp nêu trên phản ánh tình huống xấu nhất dẫn đến một ước lượng thấp thấp về độ chính xác của phương pháp real-time PCR áp dụng ^[19^].

Việc loại ra các phòng thử nghiệm được dựa trên các thiết bị real-time PCR sử dụng và dựa trên tính toán thống kê của các giá trị số lạc. Phương pháp đã được phát triển cho các máy chu trình nhiệt khối. Do đó, hai phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống LightCycler^®^14) (Roche Diagnostics) bị loại trừ trước khi tính toán các giá trị số lạc. Lý do loại trừ một thiết bị PCR cụ thể là do quan sát thấy phương pháp cần điều chỉnh phù hợp và tối ưu hóa cẩn thận nếu chạy trên thiết bị real-time PCR khác với các thiết bị PCR được quy định trong phương pháp này. Các phòng thử nghiệm giữ lại được kiểm tra thêm về các số lạc theo Grubbs ^[2^4]. Các chi tiết của thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.1.

Bảng C.1 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng để phát hiện GMO đặc hiệu promoter-35S

Mẫu

SA

...

...

...

SC

SD

SE

Năm thử nghiệm liên phòng

1999

1999

1999

1999

1999

...

...

...

11

11

11

11

11

Số lượng mẫu cho mỗi phòng thử nghiệm

1

1

1

...

...

...

1

Số lượng phòng thử nghiệm bị loại trừ

3

2

3

3

3

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại

8

...

...

...

8

8

8

Số mẫu đã được chấp nhận

8

9

8

8

8

...

...

...

1,4

1,8

3

0,7

1

Giá trị trung bình (% GMO)

1,7

1,89

3,65

...

...

...

1,58

Giá trị trung vị (% GMO)

1,71

1,90

3,68

0,85

1,49

Độ lệch chuẩn tái lập S_R (% GMO)

0,27

...

...

...

0,57

0,15

0,38

Độ lệch chuấn tương đối tái lập (%)

16

28

16

17

24

...

...

...

0,77

1,48

1,6

0,42

1,06

Ngoài ra, bốn mẫu thực phẩm thương mại có sẵn chưa biết chứa khoảng 0,3 % và 36 % (theo khối lượng) (các giá trị trung bình) đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 đã được phân tích bởi bốn đơn vị tham gia. Phương pháp phát hiện đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 cho kết quả với độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 23 % đến 36 % ^[^20].

C.1.2.3  Đặc hiệu phân tử

C.1.2.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này được thiết kế dựa vào một trình tự được mô tả tại cơ sở dữ liệu GenBank^®15), mã số tiếp cận AX033493.

...

...

...

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ^15) bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit như chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3^15) [ngày 24, tháng tư, 2002], Kết quả của việc tìm kiếm xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

C.1.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Tính đặc hiệu thực nghiệm của phương pháp đã được đánh giá bằng phân tích CRM IRMM-410, từ bột đậu tương khô IRMM chứa từ 0 % đến 5 % đậu tương dòng GTS 40-3-2 và các mẫu chuẩn từ Hiệp hội Nghiên cứu Thực phẩm Quốc tế Leatherhead ^15) gồm bột đậu tương chưa tách dầu (Lot No. 2/99-01) chứa 0 %, 0,3 %, 1,25 % và 2 % đậu tương dòng GTS 40-3-2, tương ứng.

Các nền mẫu thực phẩm thương mại đã được thử nghiệm là bột đậu tương, protein tách chiết từ đậu tương, thực phẩm tổng hợp chứa bột đậu tương và protein đậu tương.

C.1.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^® 7700^15) sử dụng hóa chất TaqMan^®15).

Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express^® (Applied Biosystems)^15).

C.1.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

Vì là phương pháp định lượng nên giới hạn phát hiện không được đánh giá cụ thể. Giới hạn phát hiện được dự kiến tốt hơn hoặc bằng giới hạn định lượng; ví dụ: 50 bản sao bộ gen của đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000 bản sao bộ gen của đậu tương thông thường.

...

...

...

Giới hạn định lượng được đánh giá bằng cách đo dãy pha loãng ADN đích theo Tài liệu tham khảo [20].

Theo các phòng thử nghiệm phân tích, giới hạn định lượng là 50 bản sao bộ gen đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000 bản sao bộ gen đậu tương thông thường. Đối với giá trị 1C, xem Tài liệu tham khảo [20],

LOQ tương đối được ước tính là 0,06 (= 50 bản sao/82 000 bản sao x 100 %).

Các nồng độ được kiểm tra trong thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.1

CHÚ THÍCH: Số lượng bản sao không được xác định trong thử nghiệm cộng tác.

C.1.3  Điều chỉnh

Chưa có thông tin cụ thể.

C.1.4  Nguyên tắc

Đoạn gen chuyển có chiều dài 83 bp được sử dụng cho cấu trúc dòng đậu tương GTS 40-3-2 được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai mồi đặc hiệu cho gen CTP từ Petunia hybrids (RRS-F, xem Bảng C.2) và đặc hiệu cho promoter-35S (RRS-R, xem Bảng C.2). Các sản phẩm PCR được đo trong mỗi chu trình PCR (real-time) bằng một đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu cho vùng nối giữa gen CTP và promoter-35S (RRS-TMP, xem Bảng C.2). Đoạn dò oligonucleotit này được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^® 16) được sử dụng.

...

...

...

Phép định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng hoặc phương pháp ΔΔCt hoặc phương pháp đường chuẩn kép (xem C.1.8).

C.1.5  Thuốc thử

C.1.5.1  Tổng quát

Đối với chất lượng của thuốc thử đã được sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.1.5.2  Nước.

C.1.5.3  Đệm PCR (không có MgCl₂), 10 x

C.1.5.4  Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

C.1.5.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (mỗi loại).

C.1.5.6  Các oligonucleotit

...

...

...

Bảng C.2 - Các oligonucleotit

Tên

Trình tự ADN oligonucleotit

Nồng độ cuối trong PCR

Trình tự đích gen đối chứng

Lectin-F

5’-TCC ACC CCC ATC CAC ATT T-3'

900 nmol/l

Lectin-R

...

...

...

900 nmol/l

Lectin-TMP

5’-FAM-AAC Cgg TAg CgT TgC CAg CTT Cg-TAMRA-3' a

100 nmol/l

Trình tự đích GMO

RRS-F

5'-gCC ATg TTg TTA ATT TgT gCC AT-3’

900 nmol/l

RRS-R

...

...

...

900 nmol/l

RRS-TMP

5-FAM-CTT gAA AgATCT gCT AgA gTC AgC TTg TCA gCg-TAMRA-3' a

100 nmol/l

a FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.

Chiều dài sản phẩm PCR của gen lectin là 81 bp; chiều dài sản phẩm PCR của gen RRS là 83 bp.

C.1.5.7  Enzym ADN Polymerase chịu nhiệt

Enzym ADN polymerase của AmpliTaq Gold^® 17).

C.1.5.8  Uracil N-glycosylase (tùy chọn).

...

...

...

C.1.6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

C.1.6.2  Máy chu trình nhiệt

Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được thử nghiệm đầu tiên với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS ^17) và GeneAmp^® 5700 SDS (Applied Biosystems) ^17). Các hệ thống phát hiện realtime PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp với các điều kiện phản ứng.

C.1.6.3  Các ống phản ứng

Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch đại PCR cho từng máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng ABI PRISM^®, hoặc các nắp quang học MicroAmp^® (8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems) ^17).

C.1.6.4  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích gen đối chứng và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.

Phương pháp quy định tổng thể tích PCR 50 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với các thành phần như được liệt kê trong Bảng C.3.

...

...

...

Trình tự đích gen đối chứng

Tổng thể tích

50 μl

ADN khuôn (lượng lớn nhất 200 ng)

10 μl

ADN Polymerase

AmpliTaq Gold ^®

1,25 U

Phương pháp khử nhiễm

...

...

...

AmpErase uracil N-glycosylase

400 μmol/l

0,5 U

Đệm phản ứng

Đệm A của TaqMan^® (chứa chuẩn thụ động ROX)^a

1 x

MgCl₂

5 mmol/l

...

...

...

Lectin-F và Lectin-R (xem Bảng C.2)

Xem Bảng C.2

dNTP

dATP, dCTP, dGTP

200 μmol/l mỗi loại

Đoạn dò

Lectin-TMP (xem Bảng C.2)

xem Bảng C.2

Trình tự đích GMO

...

...

...

50 μl

ADN khuôn (lượng lớn nhất 200 ng)

10 μl

ADN Polymerase

AmpliTaq Gold ^®

1,25 U

Phương pháp khử nhiễm

dUTP

...

...

...

400 gmol/l

0,5 U

Đệm phản ứng

Đệm A của TaqMan^® (chứa chuẩn thụ động ROX)^a

1 x

MgCl₂

5 mmol/l

Mồi

...

...

...

Xem Bảng C.2

dNTP

dATP, dCTP, dGTP

200 μmol/l mỗi loại

Đoạn dò

RRS-TMP (xem Bảng C.2)

xem Bảng C.2

^a ROX = carboxy-X-rhodamine.

C.1.6.5  Các kiểm chứng PCR

...

...

...

Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.1.6.6  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian-nhiệt độ như được nêu trong Bảng C.4 đã được tối ưu hóa cho hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^® 7700 ^18) (Applied Biosystems). Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng, chương trình được sử dụng kết hợp với ADN polymerase của AmpliTaq Gold^® 18). Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu những điều chỉnh thích hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.

Bảng C.4 mô tả các điều kiện phản ứng.

Bảng C.4 - Quy trình thực hiện: Các điều kiện phản ứng

Thời gian s

Nhiệt độ °C

Tiền-PCR: khử nhiễm

...

...

...

50

Tiền-PCR: hoạt hóa ADN polymerase và biến tính khuôn ADN

600

95

PCR (45 chu trình)

Bước 1

Biến tính

...

...

...

95

Bước 2

Gắn mồi và kéo dài

60

60

C.1.7  Các hạn chế và diễn giải các kết quả

Vì các GMO khác với dòng đậu tương GTS 40-3-2 có thể chứa một phần của gen chuyển được sử dụng để tạo dòng đậu tương GTS 40-3-2, đặc biệt promoter-35S, trình tự CTP từ Petunia hybrida và vùng nối đặc hiệu giữa hai yếu tố gen này, nên phương pháp này thích hợp cho định lượng ADN GTS 40-3-2 khi không có mặt GMO khác, như đã được nêu cụ thể ở trên.

Phương pháp này thích hợp để đo tỉ lệ giữa ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 với ADN đậu tương. Tỉ lệ này phản ánh lượng đậu tương GTS 40-3-2 trong thành phần đậu tương của thực phẩm nghiên cứu.

Nếu tổng số thành phần đậu tương ít hơn 5 % trong thực phẩm nghiên cứu, hàm lượng 1 % đậu tương GTS 40-3-2 không chắc xác định được.

...

...

...

C.1.8  Hiệu chuẩn và tính kết quả

Sau khi xác định một giá trị ngưỡng (ví dụ: giá trị trong khoảng 0,01 đến 0,1 của thuốc nhuộm phát huỳnh quang được chuẩn hóa (Rn)), hệ thống phát hiện trình tự tính toán các giá trị Ct (chu kì ngưỡng) cho mỗi PCR (phương pháp ΔΔCt). Sự khác biệt giữa các giá trị Ct đặc hiệu lectin và các giá trị Ct đặc hiệu RRS của các mẫu (ΔC_t,sam) vả của các mẫu chuẩn (ΔC_t,ref) được tính toán. Lượng tương đối của ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong mẫu, w, theo phần trăm, có liên quan chặt với mẫu chuẩn được tính toán theo phương trình (C.1):

w = 2 ^- (^ΔCt^,^sam^-^ΔCt,ref^) x c_ref

(C.1)

Cách khác, một đường chuẩn được tính (log [c] đối với Ct) bằng hệ thống phát hiện trình tự dựa trên các chuẩn là các hỗn hợp GMO có nồng độ đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 xác định (ví dụ: 0,1 %; 0,5 %, 1 %, 2 % và 5 %), hoặc các chuẩn là các pha loãng thích hợp của các dung dịch kiểm tra thu được từ các hỗn hợp GMO có nồng độ GTS 40-3-2 xác định (ví dụ: 5 %) (phương pháp đường chuẩn kép). Đường chuẩn này được sử dụng để xác định nồng độ dòng GTS 40-3-2 của các mẫu chưa biết. Vì ADN mẫu có thể bị phân hủy do quá trình chế biến thực phẩm hoặc vì mẫu có thể chứa các thành phần khác với đậu tương, nồng độ GTS 40-3-2 tính toán phải được chuẩn hóa với tổng số ADN đậu tương có thể khuếch đại có mặt ở trong mẫu. Tổng số ADN đậu tương có trong mẫu được xác định bằng phương pháp real-time PCR đặc hiệu gen lectin đậu tương qua việc sử dụng các hỗn hợp ADN chuẩn có nồng độ ADN đậu tương xác định [ví dụ 100 % (theo khối lượng), 50 % (theo khối lượng), 25 % (theo khối lượng), 10 % (theo khối lượng) và 1 % (theo khối lượng)]. Hỗn hợp ADN chuẩn có nồng độ ADN đậu tương ở trên được chuẩn bị bằng cách pha loãng ADN đậu tương từ dãy IRMM 410 hoặc 410R 19) với ADN mang thích hợp. Để chuẩn hóa, chia lượng ADN của GTS 40-3-2 đo được cho lượng ADN đo được của đậu tương.

Để tính kết quả của quy trình thay thế này, điều quan trọng là lượng tuyệt đối của ADN khuôn (ng) là như nhau cho mỗi PCR được sử dụng trong hiệu chuẩn.

Một quy trình thay thế khác được mô tả trong C.2.

C.2  Phương pháp đặc hiệu cấu trúc để định lượng ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử dụng real-time PCR (phương pháp 2)

C.2.1  Giới thiệu

...

...

...

Các hạn chế, xem C.2.8.

C.2.2  Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng

C.2.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp đã được tối ưu hóa cho các thiết bị real-time PCR sử dụng các mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM IRMM-410R ^20)) ^[^18^] gồm bột đậu tương khô chứa các hỗn hợp của GTS 40-3-2 và đậu tương thông thường.

Đã kiểm tra độ tái lập và độ chính xác của phương pháp trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết là các mẫu chuẩn được đề cập ở trên. Ngoài ra, một loại mẫu chuẩn đã qua xử lý là bột đậu nành tách béo (TVP) đã được kiểm tra.

Số lượng bản sao của mỗi trình tự đích trong bộ gen chưa được đánh giá chi tiết.

C.2.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Sáu mẫu chưa biết chứa khoảng 0,1 % và 5 % (theo khối lượng) các mẫu chuẩn đã được chứng nhận nêu trên (CRM IRMM-410R ^20)) và mẫu TVP chứa 2 % (theo khối lượng) đậu tương dòng GTS 40-3-2 được phân tích bởi

- 14 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống ABI PRISM^® 7700 SDS,

...

...

...

- 12 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống LightCycler^® ^20^) (Roche Diagnostics).

Số lượng đơn vị tham gia cũng như số lượng mẫu được tuân thủ các tiêu chí của bộ TCVN 6910 (ISO 5725).

Kết quả phát hiện đặc hiệu-cấu trúc GTS 40-3-2 cho độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng từ 27 % đến 44 % khi sử dụng hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS và ABI GeneAmp^® 5700 SDS, tương ứng, và trong khoảng từ 27 % đến 64 % khi sử dụng hệ thống LightCycler^® ^20) (Roche Diagnostics).

Để tách chiết ADN, các quy trình thực hiện được mô tả trong A.3 của TCVN 7606 (ISO 21571) đã được sử dụng.

Đối với mỗi mẫu, thực hiện song song hai tách chiết ADN. Phân tích mỗi mẫu lặp lại ba lần.

Độ chụm, độ chính xác và giới hạn định lượng của phương pháp được xác định bằng thử nghiệm cộng tác. Dữ liệu về độ đặc hiệu, tuyến tính và giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng được xác định trước thử nghiệm cộng tác. Hàm lượng ADN của các mẫu thử nghiệm bao phủ được các giá trị này.

Một bản tóm tắt các dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng về độ đúng và độ chính xác được nêu trong Bảng C.5 và C.6.

Bảng C.5 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng cho ABI PRISM^® 7700 SDS và GeneAmp^® 5700 SDS21)

...

...

...

0,10%

± 0,03 %

Mẫu 2

0,50 %

± 0,06 %

Mẫu 3

1,0 %

± 0,1 %

Mẫu 4

...

...

...

± 0,2 %

Mẫu 5

5,0 %

± 0,2 %

Mẫu 6

2 %TVP

Năm thử nghiệm liên phòng

2000

2000

...

...

...

2000

2000

2000

Số lượng phòng thử nghiệm

19

19

19

19

19

...

...

...

Số các số lạc^a

0

2

1

0

1

0

Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại

19

...

...

...

18

19

18

19

Giá trị trung bình

0,11

0,49

1,00

2,27

...

...

...

1,71

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r

0,04

0,12

0,21

0,25

0,53

0,48

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)

...

...

...

24

21

11

10

28

Giới hạn lặp lại r(r = 2,8 s_r)

0,10

0,33

0,59

...

...

...

1,48

1,34

Độ lệch chuẩn tái lập s_R

0,05

0,3

0,28

0,71

1,38

0,55

...

...

...

44

27

28

32

27

32

Giới hạn tái lập R(R = 2,6 s_R)

0,13

0,37

...

...

...

2,00

3,87

1,54

^a Giá trị số lạc được xác định với các kiểm định Grubbs và Cochran.^[24]

Bảng C.6 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng cho hệ thống LightCycler^® 22)

Mẫu 1

0,10 %

± 0,03 %

...

...

...

0,50 %

± 0,06 %

Mẫu 3

1,0 %

± 0,1 %

Mẫu 4

2,0 %

± 0,2 %

Mẫu 5

...

...

...

± 0,2 %

Mẫu 6

2 % TVP

Năm thử nghiệm liên phòng

2000

2000

2000

2000

2000

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm

7

7

7

7

7

5

Số giá trị số lạc^a

1

...

...

...

0

0

0

1

Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại

6

7

7

7

...

...

...

4

Giá trị trung bình (%)

0,13

0,55

0,95

2,01

5,43

1,82

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r

...

...

...

0,23

0,28

0,56

1,10

0,20

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lạl (%)

55

42

30

...

...

...

20

11

Giới hạn lặp lại r (r = 2,8 s_r)

0,19

0,66

0,79

1,57

3,07

0,56

...

...

...

0,08

0,31

0,34

0,64

1,94

0,50

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)

64

55

...

...

...

32

36

27

Giới hạn tái lập R(R = 2,8 s_R)

0,22

0,86

0,95

1,79

5,43

...

...

...

^a Giá trị số lạc được xác định với các kiểm định Grubbs và Cochran. ^[24]

Các kết quả liệt kê trong Bảng C.6 minh họa sự biến thiên quan sát được đối với hệ thống LightCycler^®22^) (Roche Diagnostics). Lưu ý số phòng thử nghiệm gửi trả kết quả không đủ theo TCVN 6910 (ISO 5725).

C.2.2.3  Đặc hiệu phân tử

C.2.2.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp được thiết kế dựa vào một trình tự được mô tả tại cơ sở dữ liệu GenBank^®^22), mã số tiếp cận AY596948.

C.2.2.3.2  Đặc hiệu lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ^22) bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit như là các chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3^22) [ngày 24, tháng tư, 2002]. Kết quả của việc tìm kiếm xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

C.2.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Các mẫu bột đậu nành khô CRM IRMM-410R ^22) chứa từ 0 % đến 5 % đậu tương GTS 40-3-2 đã được xác định. Các nền mẫu thực phẩm thương mại được kiểm tra là bột đậu tương và các tách chiết protein đậu tương.

...

...

...

Các alen và sự ổn định số bản sao của gen đối chứng đậu tương được đánh giá sử dụng ít nhất tám giống khác nhau của đậu tương.

C.2.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa nồng độ chất phản ứng được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^® 7700 và trên thiết bị LightCycler^® sử dụng hóa chất TaqMan^® 23) ^[3]. Không cần phải tối ưu hóa thêm khi thực hiện trên thiết bị GeneAmp^®5700 vì chu trình nhiệt của thiết bị này giống với chu trình nhiệt của hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 ^23).

Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express^® (Applied Biosystems)^23^).

C.2.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện không được đánh giá trong thử nghiệm cộng tác.

Giới hạn phát hiện cho PCR được tính toán bằng cách đo dãy pha loãng ADN đích. Theo phòng thử nghiệm phân tích, LOD đã được xác định là 5 bản sao trình tự đích (được xác định với các plasmid).

C.2.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

Các giới hạn định lượng đã được đánh giá bằng cách đo các dãy pha loãng liên tiếp ADN đích.

...

...

...

Các nồng độ được kiểm tra trong thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.5 và C.6.

CHÚ THÍCH  Số lượng bản sao không được xác định trong thử nghiệm cộng tác.

C.2.3  Điều chỉnh

Chưa có thông tin cụ thể.

C.2.4  Nguyên tắc

Đoạn ADN của trình tự đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 có chiều dài 74 bp được khuếch đại bằng PCR sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho GTS 40-3-2. Các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM như một loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA như một loại thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Vì mục đích đó, hóa chất TaqMan^®23^) được sử dụng.

Đoạn ADN của gen lectin đậu tương đặc hiệu taxon (Ie1) có chiều dài 74 bp được khuếch đại bằng PCR trong một lần chạy real-time PCR riêng biệt sử dụng hai mồi đặc hiệu gen Ie1 đậu tương và các sản phẩm PCR được đo trong mỗi chu trình PCR bằng một đoạn dò TaqMan^® đặc hiệu Ie1^23)

Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng các ADN được tách chiết từ mẫu kiểm tra chưa biết.

CHÚ THÍCH: Trước khi phân tích PCR định lượng, các dung dịch ADN được tách chiết đã được phân tích bằng việc sử dụng một chương trình PCR định tính trên máy real-time PCR. Chương trình chạy PCR định tính (“chạy giám sát”) được tiến hành để xác định “chu kì ngưỡng” (giá trị Ct) của mỗi mẫu mã không tồn tại một kinh nghiệm thực nghiệm. Bằng cách kiểm tra hai độ pha loãng khác nhau của axit nucleic được tách chiết (ví dụ: độ pha loãng 1:10 và 1:40 của dung dịch ADN) trong chạy giám sát, sự hiện diện có thể có của chất ức chế khuếch đại có thể được xác định. Ngoài ra, một độ pha loãng thích hợp của chất chiết axit nucleic thu được từ mẫu kiểm tra phù hợp với dải hiệu chuẩn của phân tích định lượng có thể được xác định.

...

...

...

C.2.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.2.5.2  Nước.

C.2.5.3  Đệm PCR (không có MgCI₂), 10x

C.2.5.4  Dung dịch MgCl₂, c(MgCI₂) = 25 mmol/l.

C.2.5.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 25 mmol/l

C.2.5.6  Các oligonucleotit

Chi tiết của các oligonucleotit được liệt kê trong Bảng C.7.

Bảng C.7 - Các oligonucleotit

...

...

...

Trình tự ADN oligonucleotit

Nồng độ cuối trong PCR

Trình tự đích gen đối chứng

GM1-F

5'-CCA gCT TCg CCg CTT CCT TC-3'

600 nmol/l

GM1-R

5'-gAA ggC AAg CCC ATC TgC AAg CC-3’

600 nmol/l

...

...

...

5'-FAM-CTT CAC CTT CTA TgC CCC TgA CAC-TAMRA-3'^a

120 nmol/l

Trình tự đích GMO

RR1-F

5-CAT TTg gAg Agg ACA CgC TgA-3'

600 nmol/l

RR1-R

5'-gAg CCA TgT TgT TAA TTT gTg CC-3'

600 nmol/l

...

...

...

5'-FAM-CAA gCT gAC TCT AgC AgA TCT TTC-TAMRA-3'^a

125 nmol/l

^a FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.

Chiều dài sản phẩm PCR của gen lectin và chiều dài sản phẩm PCR của gen GTS 40-3-2 là 74 bp.

C.2.5.7  Enzym ADN Polymerase chịu nhiệt

Enzyme ADN polymerase của AmpliTaq Gold^® 24).

C.2.5.8  Uracil N-glycosylase (tùy chọn).

C.2.6  Thiết bị, dụng cụ

C.2.6.1  Yêu cầu chung

...

...

...

C.2.6.2  Máy chu trình nhiệt

Các hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được thử nghiệm đầu tiên với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS hoặc GeneAmp^® 5700 SDS (Applied Biosystems), hệ thống LightCycler^® (Roche Diagnostics)^2^5). Các máy real-time PCR khác có thể cũng được sử dụng nếu chúng có thể được chỉ ra được kết quả tương đương hoặc tốt hơn.

C.2.6.3  Các ống phản ứng

Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch đại PCR cho từng máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng ABI PRISM^®, hoặc các nắp quang học MicroAmp^® (8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems) và các ống mao dẫn LightCycler^® (Roche Diagnostics)25).

C.2.7  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

C.2.7.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích gen đối chứng và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.

Trước khi "chạy định lượng", một chương trình real-time PCR được thực hiện với ít nhất hai độ pha loãng của ADN được tách chiết từ các mẫu kiểm tra cho cả hai hệ thống PCR để giám sát khả năng khuếch đại. Dữ liệu thu được từ “chạy giám sát” được sử dụng để kiểm soát chất lượng của ADN (ức chế). Các giá trị Ct thu được từ hai độ pha loãng tuyến tính phải tỉ lệ với một khác biệt giá trị Ct xác định (ΔCt), ví dụ: một độ pha loãng một phần tư có giá trị ΔCt xấp xỉ 2. Một giá trị ΔCt nhỏ hơn chỉ ra sự khuếch đại không tuyến tính mà có thể bị gây ra bởi các chất ức chế PCR. Giá trị Ct của một ADN chưa biết được xác định trong một lần chạy giám sát cũng cung cấp thông tin về số lượng của ADN đích. Bằng cách này, một nồng độ ADN thích hợp của mẫu kiểm tra chưa biết được lựa chọn phải nằm trong phạm vi của đường chuẩn.

Phương pháp được quy định tổng thể tích PCR 50 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với các thành phần như được liệt kê trong Bảng C.8 và C.9.

...

...

...

Tổng thể tích phản ứng

50 μl

Khuôn ADN thêm vào (1,7 ng đến 108 ng ADN đậu tương)

5 μl

Polymerase ADN

ADN polymerase của AmpliTaq Gold^® ^a

1,25 U

Hệ thống khử nhiễm

dUTP

...

...

...

400 μmol/l 0,5 U

Đệm phản ứng

Đệm A của TaqMan^® (chứa chuẩn thụ động ROX)^a

1 X

MgCl₂

4,5 mmol/l mỗi loại

Mồi

GM1-F và GM1-R (xem Bảng C.7)

...

...

...

dNTP

dATP, dCTP, dGTP

200 μmol/l mỗi loại

Đoạn dò

GM1 (xem Bảng C.7)

Xem Bảng C.7

H₂O (loại dùng cho sinh học phân tử)

Thêm đến 50 μl

...

...

...

^b ROX = carboxy-X-rhodamine.

Bảng C.9 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng của trình tự đích GMO

Tổng thể tích phản ứng

50 μl

Khuôn ADN thêm vào (1,7 ng đến 108 ng ADN đậu tương)

5 μl

Polymerase ADN

ADN polymerase của AmpliTaq Gold^® ^a

1,25 U

...

...

...

dUTP

400 μmol/l

uracil N-glycosylase

0,5 U

Đệm phản ứng

Đệm A của TaqMan^® (chứa chuẩn thụ động ROX)^a

1 x

MgCI₂

...

...

...

Mồi

RR1-F và RR1-R (xem Bảng C.7)

Xem Bảng C.7

dNTP

dATP, dCTP, dGTP

200 μmol/l mỗi loại

Đoạn dò

RR1 (xem Bảng C.7)

Xem Bảng C.7

...

...

...

Thêm đến 50 μl

^a Khi sử dụng hệ thống LightCycler^®, đệm thay thế và Taq polymerase được khuyên dùng, ví dụ Platinum Taq hoặc FastStart Taq trong đệm phản ứng của các nhà sản xuất.

^b ROX = carboxy-X-rhodamine.

C.2.7.2  Các kiểm chứng PCR

Các mẫu chuẩn được chứng nhận của đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 được sản xuất bởi IRMM, Geel, Bỉ (dãy IRMM-410 26)) có thể được sử dụng làm kiểm chứng dương ^[18^].

Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.2.7.3  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian-nhiệt độ như được nêu trong Bảng C.10 đã được tối ưu hóa cho hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^®7700 (Applied Biosystems) và hệ thống LightCycler^® (Roche Diagnostics) ^26). Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng, chương trình được sử dụng kết hợp với ADN polymerase của AmpliTaq Gold^®^26). Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu những điều chỉnh thích hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.

...

...

...

Bảng C.10 - Quy trình thực hiện: Các điều kiện phản ứng

Thời gian

s

Nhiệt độ

°C

Tiền-PCR: khử nhiễm

120

50

...

...

...

600

95

PCR (45 chu trình)

Bước 1

Biến tính

15^a/5^b

95

...

...

...

Gắn mồi và kéo dài

60^a/25^b

60

^a Được tối ưu hóa cho ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems) với phiên bản phần mềm 1.6.3.

^b Được tối ưu hóa cho hệ thống LightCycler^®. Thông số huỳnh quang trong LightCycler^® là channel 1 (gain 4) và thu được duy nhất trong suốt quy trình biến tính với phần mềm phiên bản 3.

C.2.8  Các hạn chế và diễn giải các kết quả

Vì các GMO khác với dòng đậu tương GTS 40-3-2 có thể chứa một phần của cấu trúc gen được sử dụng để cấu trúc nên dòng đậu tương GTS 40-3-2, đặc biệt là vùng nối đặc hiệu giữa promoter-35S và trình tự tín hiệu CTP từ các yếu tố Petunia hybrids, nên phương pháp này chỉ thích hợp cho định lượng ADN GTS 40-3-2 khi không có mặt các GMO khác, như đã được nêu cụ thể ở trên.

Phương pháp này phù hợp để đo tỉ lệ giữa ADN đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 và ADN đậu tương. Tỉ lệ này phản ánh lượng tương đối GTS 40-3-2 trong thành phần đậu tương ở thực phẩm được nghiên cứu.

Phương pháp này đã xác nhận giá trị sử dụng cho bột đậu tương và protein thực vật đã tách béo.

...

...

...

C.2.9  Hiệu chuẩn và tính kết quả

Các đường chuẩn riêng biệt với mỗi bộ mồi/đoạn dò thu được trong cùng lần chạy khuếch đại phân tích. Các đường chuẩn bao gồm bốn độ pha loãng ADN được tách chiết từ 5 % CRM IRMM-410R 27). Tại mỗi điểm trong số bốn điểm chuẩn, thực hiện các phản ứng lặp lại (trên hệ thống ABI PRISM®7700 SDS ^27) và GeneAmp^® 5700) ^27) hoặc phản ứng đơn (trên hệ thống LightCycler^® ^27). Thực hiện các phản ứng ba lần lặp lại tại một độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu thử trên hệ thống ABI, trong khi thực hiện các phản ứng đơn tại hai độ pha loãng khác nhau của ADN mẫu thử trên hệ thống LightCycler^®27)

Dựng đường chuẩn dựa vào các giá trị Ct đối với logarit số bản sao đích của các điểm chuẩn. Điều này có thể được thực hiện, ví dụ: bằng cách sử dụng bảng tính của Microsoft Excel ^27^) hoặc trực tiếp bởi các tùy chọn có sẵn của phần mềm hệ thống phát hiện trình tự.

Các số bản sao của ADN mẫu chưa biết có được bằng cách nội suy từ các đường chuẩn. Để xác định số lượng ADN GTS 40-3-2 trong mẫu chưa biết, lấy số bản sao đích GTS 40-3-2 chia cho số bản sao gen lectin và nhân với 100, sau đó được biểu thị dưới dạng tỉ lệ phần trăm.

C.3  Phương pháp đặc hiệu cấu trúc để định lượng ADN ngô dòng Event176 sử dụng real-time PCR

C.3.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và phát hiện gen (hmg) mã hóa protein nhóm dễ biến đổi đặc hiệu taxon ở ngô (Zea mays) và phát hiện phần đặc hiệu của gen tổng hợp cry1A(b) có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis (cry1A(b) tổng hợp) có mặt trong bộ gen của ngô biến đổi gen Event176 (Bt176, Maximizer™) để định lượng lượng tương đối ADN Event176.

Các hạn chế, xem C.3.8.

C.3.2  Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng

...

...

...

Phương pháp đã được tối ưu cho các mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM IRMM 411 28)) gồm bột ngô khô chứa các hỗn hợp của Event176 và ngô thông thường.

Đã kiểm tra độ tái lập và độ chính xác của phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết của CRM IRMM 411 ^28) từ 0,1 % đến 5 % Event176 trong ngô thông thường, cũng như sử dụng các mẫu chuẩn được sản xuất từ ngô hạt đã qua khử trùng bằng nhiệt (HSK) chứa 2 % ngô Event176 trong ngô thông thường.

Số lượng bản sao của các gen đích trong bộ gen chưa được đánh giá chi tiết.

C.3.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Thử nghiệm cộng tác đã được tổ chức bởi Viện Bảo vệ Sức khỏe Người tiêu dùng và Thuốc Thú y Liên bang trước đây (BgVV nay là BfR, Đức) cùng với GeneScan Châu Âu (Teltow, Đức), số lượng phòng thử nghiệm tham gia cũng như số lượng mẫu được tuân thủ các tiêu chí của bộ TCVN 6910 (ISO 5725).

Nghiên cứu được thực hiện với 10 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS ^28) và 7 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống ABI GeneAmp^® 5700 SDS ^[28^].

Để tách chiết ADN, sử dụng quy trình thực hiện mô tả trong A.3 của TCVN 7606 (ISO 21571).

Với mỗi mẫu, thực hiện song song 2 tách chiết ADN. Mỗi mẫu thử nghiệm được phân tích lặp lại 3 lần.

Mỗi phòng tham gia nhận được sáu mẫu chưa biết. Các mẫu bao gồm 4 mẫu chuẩn đã được chứng nhận: CRM IRMM 411 trong khoảng 0,1 % đến 2 % ngô Event176 trong bột ngô (theo khối lượng), một mẫu bột ngô chứa hỗn hợp (theo khối lượng) gồm 50 % đậu tương dòng GTS 40-3-2 (Roundup ready), 49 % ngô (không biến đổi gen) và 1 % ngô Event176 (được dán nhãn Hỗn hợp A) và một mẫu bột khô được sản xuất từ ngô hạt đã khử trùng bằng nhiệt (được dán nhãn HSK) chứa 2 % ngô Event 176 trong ngô không biến đổi gen.

...

...

...

Tóm tắt dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng đối với độ đúng và độ chính xác nêu ra trong Bảng C.1.1.

Bảng C.11 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng cho định lượng đặc hiệu cấu trúc Bt176

Mẫu 1

0,100 %

± 0,002 %

Mẫu 2

0,50 %

± 0,01 %

...

...

...

1,00%

± 0,02 %

Mẫu 4

2,00 %

± 0,04 %

Mẫu 5

Hỗn hợp A (2 %)

Mẫu 6

2 % HSK

...

...

...

2000

2000

2000

2000

2000

2000

Số lượng phòng thử nghiệm

17

17

...

...

...

17

17

17

Số lượng số lạc^a

1

0

0

0

2

...

...

...

Số phòng thử nghiệm được giữ lại

16

17

17

17

15

15

Giá trị trung bình (%)

0,13

...

...

...

1,47

2,27

2,04

0,75

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r

0,03

0,13

0,28

0,45

...

...

...

0,21

Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối (%)

22,28

19,48

18,83

19,88

18,22

27,71

Giới hạn lặp lại r(r = 2,8 s_r)

...

...

...

0,37

0,78

1,26

1,04

0,58

Độ lệch chuẩn tái lập s_R

0,05

0,26

0,55

...

...

...

0,85

0,25

Độ lệch chuẩn tái lập tương đối (%)

36,13

39,23

37,19

40,72

41,62

32,90

...

...

...

0,13

0,74

1,54

2,59

2,38

0,69

^a Số lạc được xác định với các kiểm định Grubbs và Cochran

C.3.2.3  Đặc hiệu phân tử

C.3.2.3.1  Yêu cầu chung

...

...

...

C.3.2.3.2  Đặc hiệu lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ29) bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit như là các chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.4. ^29) [ngày 8 tháng 12 năm 2002], Kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

C.3.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

CRM bột ngô khô IRMM-411 ^29) chứa từ 0,1 % đến 5 % ngô Event176 đã được xác định.

Với bộ mồi/đoạn dò đặc hiệu Event176, không có các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ ADN của 20 dòng ngô khác nhau (giống Zea mays), hoặc gạo (Oryza sativa), lúa mạch đen (Secale cereal), lúa mì (Triticum aestivum), lúa mạch (Hortium vulgare), kê (Panicum miliaceum), đậu lăng (Lens culinaris), đậu trắng (Phaseolus vulgaris), đậu xanh (Phaseolus aureus), đậu lupin (Lupinus tuteus), teosinte (Zea mays ssp. mexicana), cà chua (Lycopersicum esculentum), khoai tây (Solatium tuberosum ssp. Tuberosum), lúa miến (Sorghum vulgare), ngô (Zea mays), cải dầu (Brassica napus), yến mạch (Avena sativa), lúa mì (Triticum spelta), cây gai (Linum usitatissimum), kiều mạch (Fagopyrum sculentum), vừng (Sesamum spp.), người (Homo sapiens sapiens), cá hồi (Salmo salar), bò (Bos taurus). Hơn nữa, không có phản ứng chéo được quan sát thấy ở đậu tương biến đổi gen sự kiện GTS 40-3-2 hoặc các sự kiện ngô biến đổi gen sau: Bt11, T25, MON810, CBH351, DBT418 và GA21.

Đối với bộ mồi/đoạn dò của gen hmg đặc hiệu cho ngô, các sản phẩm khuếch đại đã được phát hiện với ADN từ các dòng ngô không biến đổi gen khác nhau và với ADN được tách chiết từ CRM IRMM- 1130), nhưng không phát hiện thấy một trong các loài nêu trên, ngoại trừ teosinte (Zea may, ssp. mexicana), có họ hàng gần với ngô.

C.3.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS ^30) sử dụng hóa chất TaqMan ^[^30^]. Không cần phải tối ưu hóa thêm khi thực hiện PCR trên thiết bị GenAmp^® 5700 ^30) vì chu trình nhiệt của thiết bị này giống với chu trình nhiệt của hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^®7700 SDS^30).

Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express (Applied Biosystems)^30)

...

...

...

Giới hạn phát hiện không được đánh giá trong thử nghiệm cộng tác.

Giới hạn phát hiện cho PCR được tính toán bằng cách đo các dãy pha loãng liên tiếp ADN đích.

Theo các phòng thử nghiệm phân tích, giới hạn phát hiện LOD đã được xác định là 5 bản sao trình tự đích (được xác định với các plasmid).

C.3.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn định lượng cho giai đoạn PCR đã được tính toán bằng cách đo các dãy pha loãng liên tiếp ADN đích.

Giới hạn định lượng tính toán bởi nhà cung cấp phương pháp là 50 bản sao bộ gen ngô dòng Event 176 trong 82 000 bản sao bộ gen dựa vào kích thước bộ gen lý thuyết là 2725 pg cho mỗi bộ gen đơn bội ^[14]

Các nồng độ được kiểm tra trong thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.1.1.

CHÚ THÍCH: Số lượng các bản sao không được xác định trong thử nghiệm cộng tác.

C.3.3  Điều chỉnh

...

...

...

C.3.4  Nguyên tắc

Đoạn ADN có chiều dài 129 bp của gen tổng hợp cry1A (b) được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time) bằng một đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu gen tổng hợp cry1A(b) được đánh dấu bằng 2 loại thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Vì mục đích đó, hóa chất TaqMan^®^30) được sử dụng.

Đoạn ADN cố chiều dài 79bp của gen hmg đặc hiệu cho ngô được khuếch đại bằng PCR trong một real-time PCR riêng biệt sử dụng các mồi đặc hiệu và đo các sản phẩm PCR trong suốt mỗi chu trình PCR bằng một đoạn dò oligonuclotit đặc hiệu gen hmg được đánh dấu bằng 2 loại thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang.

CHÚ THÍCH: Ngô Event176 (Maximizer™) có chứa 2 bản sao của một gen tổng hợp cry1A(b) dưới sự kiểm soát của promoter của gen calcium dependent protein kinase (CDPK6) ở ngô và promoter của gen phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) ở ngô, tương ứng.

Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng các ADN được tách chiết từ mẫu kiểm tra chưa biết. Các đường chuẩn riêng biệt của mỗi bộ mồi/đoạn dò thu được trong cùng lần khuếch đại phân tích. Các đường chuẩn gồm bốn độ pha loãng ADN tách chiết từ CRM IRMM-411 5 %, được sử dụng làm vật liệu chuẩn cho hiệu chuẩn. Tại mỗi điểm của bốn điểm chuẩn, thực hiện phân tích lặp lại hai lần. Thực hiện phản ứng lặp lại ba lần cho mỗi hai lần tách chiết ADN của mẫu kiểm tra chưa biết, sử dụng các độ pha loãng ADN thích hợp.

Trước khi “chạy định lượng”, thực hiện một lần chạy real-time PCR với ít nhất 2 độ pha loãng ADN được tách chiết từ các mẫu kiểm tra (ví dụ: độ pha loãng 1:10 và 1:40 của dung dịch ADN) để giám sát khả năng khuếch đại. Dữ liệu thu được bởi “chạy giám sát” được sử dụng để xác định sự có mặt của bất kỳ chất ức chế PCR nào. Các giá trị Ct thu được từ hai độ pha loãng tuyến tính phải tỉ lệ với một khác biệt giá trị Ct xác định (ΔCt), ví dụ: một độ pha loãng một phần tư cho ra giá trị ΔCt xấp xỉ 2. Một giá trị ΔCt nhỏ hơn chỉ ra sự khuếch đại không tuyến tính mà có thể bị gây ra bởi các chất ức chế PCR. Giá trị Ct của ADN chưa biết được xác định trong chạy giám sát cũng cung cấp thông tin về số lượng ADN đích. Bằng cách này, nồng độ ADN mẫu thử thích hợp được xác định phải nằm trong dải động học của đường chuẩn.

C.3.5  Thuốc thử

C.3.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

...

...

...

C.3.5.3  Đệm PCR (không có MgCl₂), 10 x

C.3.5.4  Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

C.3.5.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (mỗi loại).

C.3.5.6  Các oligonucleotit

Chi tiết của các oligonucleotit được liệt kê trong Bảng C.12.

Bảng C.12 - Các oligonucleotit

Tên

Trình tự ADN oligonucleotit

Nồng độ cuối trong PCR

...

...

...

ZM1-F

5’-TTg gAC TAg AAA TCT CgT gCT gA-3’

300 nmol/l

ZM1-R

5’-gCT ACA TAg ggA gCC TTg TCC T-3’

300 nmol/l

Đoạn dò ZM1

5’-FAM-CAA TCC ACA CAA ACg CAC gCg TA-TAMRA-3’a

160 nmol/l

...

...

...

CRY2-F

5’-CCC ATC gAC ATC AgC CTg AgC-3’

300 nmol/l

CRY2-R

5'-CAg gAA ggC gTC CCA CTg gC-3’

300 nmol/l

Đoạn dò BTSYN

5’-FAM-ATg TCC ACC Agg CCC AgC ACg -TAMRA-3’a

160 nmol/l

...

...

...

Chiều dài sản phẩm PCR của gen đặc hiệu taxon là 79 bp, chiều dài sản phẩm PCR của gen đặc hiệu Event176 là 129 bp.

C.3.5.7  Enzym ADN polymerase chịu nhiệt

Enzym ADN polymerase của AmpliTaq Gold^® 31).

C.3.5.8 Uracil N-glycosylase (tùy chọn).

C.3.6  Thiết bị, dụng cụ

C.3.6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

C.3.6.2  Máy chu trình nhiệt

Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được thử nghiệm đầu tiên với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^®7700 SDS và GeneAmp^® 5700 SDS, Applied Biosystems ^31). Các hệ thống phát hiện real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp các điều kiện phản ứng.

...

...

...

Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch đại PCR cho từng máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng ABI PRISM^® hoặc các nắp quang học MicroAmp^® (Applied Biosystems ^31)).

C.3.7  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

C.3.7.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích gen đối chứng và trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hoặc xác nhận giá trị sử dụng.

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR 25 μl cho mỗi phản ứng với các thành phần như được liệt kê trong Bảng C.13 và C.14.

Bảng C.13 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng của trình tự taxon đích

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

Khuôn ADN (2,3 ng tới 150 ng ADN ngô)

...

...

...

ADN polymerase

ADN polymerase của AmpliTaq Gold^®

1,25 U

Hệ thống khử nhiễm

dUTP

Uracil N-glycosylase (tùy chọn)

400 μmol/l

0,5 U

Đệm phản ứng

...

...

...

1 x

MgCl₂

4,5 mmol/l

Mồi

ZM1-F và ZM1-R (xem Bảng C.12)

xem Bảng C.3.5.6

dNTP

dATP, dCTP, dGTP

...

...

...

Đoạn dò

Đoạn dò ZM1 (xem Bảng C.12)

xem Bảng C.3.5.6

^a ROX = carboxy-X- rhodamine

Bảng C.14 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng của trình tự đích GMO

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

Khuôn ADN (2,3 ng tới 150 ng ADN ngô)

5 μl

...

...

...

ADN polymerase của AmpliTaq Gold^®

1,25 U

Hệ thống khử nhiễm

dUTP

Uracil N-glycosylase (tùy chọn)

400 μmol/l

0,5 U

Đệm phản ứng

Đệm A của TaqMan^® (chứa chuẩn thụ động ROX)^a

...

...

...

MgCl₂

4,5 mmol/l

Mồi

CRY2-F và CRY2-R (xem Bảng C.12)

xem C.3.5.6

dNTP

dATP, dCTP, dGTP

200 μmol/l mỗi loại

...

...

...

Đoạn dò BTSYN (xem Bảng C.12)

xem C.3.5.6

^a ROX = carboxy - X- rhodamine

C.3.7.2  Các kiểm chứng PCR

Các mẫu chuẩn được chứng nhận của vật liệu Event176 được sản xuất bởi IRMM, Geel, Bỉ (dãy IRMM-411 ^32^)) có thể được sử dụng làm kiểm chứng dương^[5].

Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.3.7.3  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian- nhiệt độ như được nêu trong Bảng C.15 đã được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 (SDS) 32) (Applied Biosystems). Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng, chương trình được sử dụng kết hợp với ADN polymerase của AmpliTaq Gold^®32). Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu những điều chỉnh thích hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.

Bảng C.15 Mô tả các điều kiện phản ứng.

...

...

...

Thời gian s

Nhiệt độ °C

Tiền-PCR: Khử nhiễm

120

50

Tiền-PCR: Hoạt hóa ADN polymerase và biến tính ADN khuôn mẫu

600

95

...

...

...

Bước 1

Biến tính

15

95

Bước 2

Gắn mồi và kéo dài

60

60

...

...

...

Phương pháp này phù hợp để đo tỉ lệ giữa ADN đặc hiệu cấu trúc Event176 với ADN ngô. Tỉ lệ này phản ánh lượng tương đối Event176 trong thành phần ngô ở thực phẩm được nghiên cứu.

CHÚ THÍCH: Nếu ADN ngô bị loại bỏ hoặc bị phân hủy nhiều trong suốt quá trình chế biến thực phẩm (ví dụ: dầu tinh luyện) hoặc nếu ngô chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong mẫu phân tích, thì tổng số các bản sao đặc hiệu GM và/hoặc tổng số các bản sao đối chứng ở ngô sẽ bằng hoặc dưới giới hạn định lượng và các phương pháp này mô tả sẽ không áp dụng được.

C.3.9  Hiệu chuẩn và tính kết quả

Các đường chuẩn riêng biệt với mỗi bộ mồi/đoạn dò thu được trong cùng lần chạy khuếch đại phân tích. Các đường chuẩn bao gồm 4 độ pha loãng ADN được tách chiết từ dãy 5 % CRM IRMM-411 33). Tại mỗi điểm trong số 4 điểm chuẩn, thực hiện phản ứng lặp lại 2 lần (trên hệ thống ABI PRISM®7700 SDS và GeneAmp^® 5700) ^33^). Sử dụng dãy pha loãng một phần tư với nồng độ ban đầu là 40 000 bản sao bộ gen (giả định một bộ gen ngô đơn bội tương quan với 2 725 pg ^[4]). Thực hiện các phản ứng lặp lại 3 lần tại độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu thử trên hệ thống ABI.

Dựng đường chuẩn dựa vào các giá trị Ct với logarit số bản sao đích của các điểm chuẩn. Điều này có thể thực hiện được, ví dụ: bằng cách sử dụng bảng tính của Microsoft Excel^33), hoặc trực tiếp bằng các tùy chọn có sẵn với phần mềm hệ thống phát hiện trình tự.

Các số bản sao của ADN mẫu chưa biết có được bằng cách nội suy từ các đường chuẩn. Để xác định lượng ADN Event176 trong mẫu chưa biết, lấy số bản sao đích Event176 chia cho số bản sao của gen hmg sau đó nhân với 100 và biểu thị kết quả dưới dạng tỉ lệ phần trăm.

C.4  Phương pháp đặc hiệu cấu trúc để định lượng ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử dụng real-time PCR

C.4.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp phát hiện và định lượng gen đặc hiệu taxon của đậu tương (gen lectin, Ie1) và vùng ADN đặc hiệu nối giữa trình tự peptit vận chuyển trong lục lạp của Petunia hybrids và trình tự gen tổng hợp 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (epsps) của Agrobacterium có mặt trong đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 [đậu tương Roundup Ready^® (RRS)]. Phương pháp dựa vào real-time PCR sử dụng Plasmid pMulSL2 làm mẫu chuẩn để định lượng tương đối GTS 40-3-2 trong đậu tương thông qua sử dụng hệ số chuyển đổi (Cf) là tỉ lệ của các số bản sao giữa các trình tự ADN đặc hiệu GTS 40-3-2 với các trình tự ADN đặc hiệu taxon trong các hạt đậu tương đại diện cho dòng GTS 40-3-2 thuần chủng.

...

...

...

Các hạn chế, xem c.4.8.

C.4.2  Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng

C.4.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này được tối ưu cho máy real-time PCR ABI PRISM^® 7700 SDS ^33) sử dụng plasmid pMulSL2 làm chuẩn ^[33]. Plasmid pMulSL2 trong các sản phẩm PCR riêng biệt được khuếch đại từ các hệ thống PCR để khuếch đại đặc hiệu trình tự taxon đậu tương (Le1), và trình tự đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2.

CHÚ THÍCH  Plasmid được sử dụng làm chuẩn để xác định các hàm lượng biến đổi gen được tính từ các số bản sao tương đối của trình tự ADN đặc hiệu GM và trình tự ADN đặc hiệu taxon.

Đã kiểm tra độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng mẫu chuẩn và bột đậu tương khô chưa biết là hỗn hợp của GTS 40-3-2 và đậu tương thông thường ^[34^].

Số bản sao của các trình tự đặc hiệu taxon (Le1) trong bộ gen được đánh giá cho 10 giống đậu tương đại diện.

Phương pháp được công bố trong các tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản và Hàn Quốc ^[35],[36^]^,[37]^,^[38^]

C.4.2.2  Thử nghiệm cộng tác

...

...

...

CHÚ THÍCH  Các mẫu chưa biết của hỗn hợp bột đậu tương dùng cho xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp đã được chuẩn bị là 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột đậu tương khô có nguồn gốc từ dòng GTS 40-3-2. Độ đồng nhất của các mẫu ở mỗi mức độ được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp định lượng này theo quy trình thực hiện của AOAC^[39^].

Phương pháp này đã được xác nhận giá trị sử dụng cho GTS 40-3-2 trong một thử nghiệm cộng tác theo quy trình của AOAC ^[34^],^[39]. Thử nghiệm cộng tác được tổ chức bởi Viện Nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (NFRI, Tsukuba, Nhật Bản) cùng với Trung tâm cấp nhãn hiệu Chất lượng Thực phẩm và Dịch vụ Người tiêu dùng, Saitama, Nhật Bản và Viện Khoa học Sức khỏe Quốc gia, Nhật Bản. Mười lăm đơn vị tham gia bao gồm các phòng thử nghiệm của Nhật Bản, Hàn Quốc và Mỹ thực hiện các thử nghiệm cộng tác sử dụng hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems) 34) trong hai giai đoạn riêng biệt. Tất cả các đơn vị tham gia được yêu cầu phải tuân theo các quy trình tách chiết ADN và PCR định lượng. Giai đoạn đầu nhằm xác định Cf của GTS 40-3-2. Tất cả các phòng tham gia được nhận các bộ mồi, đoạn dò, mẫu chuẩn và các ADN được tách chiết từ các hạt GTS 40-3-2, được chuẩn bị bởi Qiagen DNA Eeasy Plant Maxikit^34). Các ADN đã được sử dụng để đo các số bản sao của trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc và trình tự ADN đặc hiệu taxon ở đậu tương. Tất cả các phép đo trong giai đoạn này được lặp lại 3 lần. Tổng cộng 135 bộ dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm tham gia. Các tương quan của các đường chuẩn trong dữ liệu thu được từ tất cả các đơn vị tham gia có thể chấp nhận được (r > 0,990). Theo quy trình thực hiện của AOAC ^[^39], các phòng thử nghiệm có số lạc bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran (p <0,025) và kiểm định Grubbs (p <0,025). Không có các số lạc nào quan sát được ở một trong hai kiểm định, như trình bày trong Bảng C.16.

Bảng C.16 - Tóm tắt Cf cho GTS 40-3-2

Trình tự đích

Đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

15

Số lượng số lạc Cochran

0

...

...

...

0

Số phòng thử nghiệm được giữ lại

15

Cf^a

0,95 ±0,02

^a Trình bày dạng trung bình ± khoảng tin cậy (α = 0,05)

Người phân tích có thể xác định lại Cf bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn đậu tương dòng GTS 40-3-2 thích hợp.

Giai đoạn thứ hai thực hiện các thử nghiệm mù. Các mẫu bột đậu tương chưa biết được thiết kế thành sáu cặp mù đôi, gồm 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 dạng khô trong đậu tương thông thường. Mẫu trắng 0 % đậu tương dòng GTS 40-3-2 được sử dụng để loại bỏ các phòng thử nghiệm không hợp lệ trước khi phân tích thống kê. Các phòng thử nghiệm tham gia được chỉ dẫn tách chiết ADN từ các mẫu bằng cách sử dụng Qiagen kit. Dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm được giữ lại bởi các kiểm định số lạc được sử dụng để tính toán giá trị trung bình và khoảng tin cậy (α = 0,05). Các giá trị trung bình được xác định là Cf dùng cho tính toán hàm lượng biến đổi gen (%) trong các thử nghiệm mù. Giá trị trung bình của Cf cho định lượng đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 là 0,95.

Mười ba phòng thử nghiệm tham gia trong giai đoạn thứ hai đã phân tích 156 mẫu bằng cách khuếch đại trình tự Le1 và trình tự đặc hiệu cấu trúc. Các phòng thử nghiệm không báo cáo mẫu trắng là 0 % bị coi là không hợp lệ và tất cả các dữ liệu của các phòng thử nghiệm này bị loại ra trước khi tiến hành các kiểm định số lạc. Trong tất cả các thí nghiệm, các tương quan của các đường chuẩn đã có thể chấp nhận được (r > 0,990). Các phòng thử nghiệm có giá trị bất thường trong cặp mù đôi ở mỗi mức độ GTS 40-3-2 bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran ^[40] và Grubbs ^[41^], tương ứng, trước khi phân tích thống kê độ chính xác và độ chụm. Không có số lạc Cochran và một số lạc Grubbs được phát hiện trong dữ liệu. Giá trị trung bình, độ chệch, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%) và độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) ở mỗi mức độ trộn được trình bày trong Bảng C.17.

...

...

...

Bảng C.17 - Tóm tắt xác nhận giá trị sử dụng cho định lượng đậu tương GTS 40-3-2 đặc hiệu cấu trúc

Mức độ trộn (%)

0,1

0,5

1

5

10

Số lượng các phòng thử nghiệm tham gia

...

...

...

13

13

13

13

Số lượng các phòng thử nghiệm không hợp lệ

1

1

1

1

...

...

...

Số lượng số lạc Cochran

0

0

0

0

0

Số lượng số lạc Grubbs

1

0

...

...

...

0

0

Số lượng các phòng thử nghiệm được giữ lại

11

12

12

12

12

Trung bình hàm lượng GMO (%)

...

...

...

0,6

1,2

5,8

11,7

Độ chệch của giá trị đúng (%)

+8,1

+14,3

+16,1

+ 15,1

...

...

...

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r^a

0,015

0,068

0,129

0,435

0,993

Giới hạn lặp lại r^a (r = 2,8 s_r)

0,041

0,191

...

...

...

1,219

2,779

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)^b

13,4

12,0

11,2

7,6

8,5

Độ lệch chuẩn tái lập s_R^a

...

...

...

0,091

0,161

0,660

1,246

Giới hạn tái lập R^a (R = 2,8 x s_R)

0,041

0,255

0,451

1,849

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)b

13,4

15,9

13,9

11,5

10,6

Dưới 20 bảo sao^c (giới hạn phát hiện tuyệt đối trong phương pháp này)

4/22

0/24

...

...

...

0/24

0/24

^a Được biểu thị theo đơn vị % GMO

^b Được biểu thị là tỉ lệ % của giá trị trung bình

^c Được biểu thị là tỉ lệ của số lượng dữ liệu dưới 20 bản sao được giữ lại với tổng số dữ liệu được giữ lại.

C.4.2.3  Đặc hiệu phân tử

C.4.2.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này được mô tả trong Tài liệu tham khảo [33], Thông tin về cấu trúc di truyền đưa vào bộ gen đậu tương sẵn có trong Tài liệu tham khảo [33] và [22], Các trình tự ADN của phương pháp này thu được từ DDBJ 35) database với mã số tiếp cận X04879, từ một báo cáo [42] và từ bằng sáng chế Mỹ số 5633435.

Nếu cấu trúc ADN đưa vào GTS 40-3-2 được sử dụng cho các sự kiện GM khác, thì có thể thu được kết quả dương tính giả do trình tự được khuếch đại bắt nguồn từ cấu trúc này.

...

...

...

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu DDBJ^35) (ngày 3 tháng 12 năm 1999) và các tài liệu đánh giá sự an toàn được công bố bởi Bộ Y tế, Lao động và Phúc lợi Nhật Bản và bởi Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Nhật Bản, sử dụng các trình tự nucleotit như là chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3 36). Các kết quả tìm kiếm đã xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với trình tự đích dự kiến.

C.4.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Kiểm tra các mẫu bột đậu tương khô chứa 0 % đến 10 % (theo khối lượng, được chuẩn bị bởi NFRI) đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 bằng khuếch đại ADN với mồi và đoạn dò đã thu được các sản phẩm PCR dự kiến ^[33^],[34].

Các kiểm tra đặc hiệu trước khi thử nghiệm cộng tác cho thấy không có phản ứng chéo giữa bộ mồi/đoạn dò với các loài/mẫu không phải đích sau: lúa (Oryza sativa), lúa mì (Triticum aestivum) và lúa mạch (hordeum vulgare). Không quan sát thấy phản ứng chéo ở các dòng ngô biến đổi gen sau: MON810, Event176, Bt11, GA21 và T25.

C.4.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa của thuốc thử được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems) sử dụng hóa chất TaqMan^® ^36^)^[43^].

Thiết kế mồi và đoạn dò được thực hiện bằng phần mềm Primer Express^® (Applied Biosystems).

C.4.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn ^[^33^]

...

...

...

C.4.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn.

LOQ tương đối được xác nhận giá trị sử dụng trong các thử nghiệm cộng tác: 0,1 % GTS 40-3-2.

C.4.3  Điều chỉnh

Chưa có thông tin cụ thể.

C.4.4  Nguyên tắc

Đoạn trình tự đặc hiệu cấu trúc có chiều dài 121 bp của GTS 40-3-2 được khuếch đại bằng PCR sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho GTS 40-3-2. Các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (realtime) bằng một đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu GTS 40-3-2 được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^®37^) được sử dụng.

Đoạn trình tự đặc hiệu taxon có chiều dài 118 bp của gen lectin (Le1) đậu tương được khuếch đại bằng PCR trong một phản ứng real-time PCR riêng biệt bằng cách sử dụng hai mồi đặc hiệu Le1 đậu tương, và các sản phẩm PCR được đo trong mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan^®37) đặc hiệu Le1.

Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng số bản sao ADN được tách chiết từ mẫu chưa biết. Các đường chuẩn riêng biệt của mỗi bộ mồi/đoạn dò được tạo thành trong cùng một lần chạy khuếch đại phân tích. Các đường chuẩn gồm năm nồng độ chứa 20, 125, 1 500, 20 000, 250 000 bản sao ADN plasmid pMulSL2. Tại mỗi điểm của năm điểm chuẩn, phép đo được thực hiện ba lần. Các phản ứng lặp lại ba lần bằng cách sử dụng độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu thử, và đo trên thiết bị ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems)37) trong cùng lần chạy phân tích.

...

...

...

C.4.5  Thuốc thử

C.4.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.4.5.2  Nước

C.4.5.3  TaqMan® Universal Master Mix ^37), 2 x.

C.4.5.4  Mẫu chuẩn (Plasmid)

Mẫu chuẩn sử dụng để xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là plasmid pMulSL2 ^[33] có trong plasmid phát hiện đậu tương GM (RRS) (Fasmac No. PS-2 và Nippon Gene No. 310-04981)^3^7).

C.4.5.5  Các Oligonucleotit

Các trình tự của các mồi và đoạn dò của các gen đặc hiệu cấu trúc cho đậu tương dòng GTS 40-3-2 và gen đặc hiệu taxon được liệt kê trong Bảng C.18.

...

...

...

Tên

Trình tự ADN oligonucleotit

Nồng độ cuối trong PCR

Trình tự đích gen đặc hiệu taxon

Le1n02-5'

5’-gCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3’

500 nmol/l

Le1n02-3’

5’-gCC CAT CTg CAA gCC TTT TT-3’

...

...

...

Le1-Taq

5’-FAM-AgC TTC gCC gCT TCC TTC AAC TTC AC-TAMRA-3’^a

200 nmol/l

Trình tự đích GMO

RRS 01-5’

5-CCT TTA ggATTT CAg CAT CAg Tgg-3'

500 nmol/l

RRS01-3’

5’-gAC TTg TCg CCg ggA ATg-3’

...

...

...

RRS-Taq

5’-FAM-CgC AAC CgC CCg CAA ATC C -TAMRA-3’3

200 nmol/l

^a FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.

Chiều dài sản phẩm PCR của gen lectin là 118 bp, của gen GTS 40-3-2 là 121 bp.

C.4.6  Thiết bị, dụng cụ

C.4.6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

C.4.6.2  Máy chu trình nhiệt

...

...

...

C.4.6.3  Khay và các nắp ống phản ứng

Khay và các nắp ống phản ứng phải phù hợp để khuếch đại PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng ABI PRISM^®, hoặc các nắp quang học MicroAmp^® (Applied Biosystems)^38^), tương ứng.

C.4.7  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

C.4.7.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích Le1 đặc hiệu taxon và cho trình tự đích đặc hiệu GTS 40-3-2 phải được thực hiện trong các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR 25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với thuốc thử như được liệt kê trong Bảng C.19 cho Le1 và trong Bảng C.20 cho GTS 40-3-2.

Bảng C.19 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại trình tự Le1 đặc hiệu taxon ở thể tích cuối cho mỗi ống phản ứng

Tổng thể tích

25 μl

...

...

...

2,5 μl

Đệm phản ứng (ADN polymerase và dNTP)

TaqMan^® Universal PCR Master Mix (ABI)

12,5 μl

Mồi

Le1n02-5' và Le1n02-3' (xem Bảng C.18)

xem Bảng C.18

Đoạn dò

Le1-Taq (xem Bảng C.18)

...

...

...

Bảng C.20 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại trình tự đặc hiệu GTS 40-3-2 ở thể tích cuối cho mỗi ống phản ứng

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen đậu tương)

2,5 μl

Đệm phản ứng (ADN polymerase và dNTP)

TaqMan^® Universal PCR Master Mix (ABI)

12,5 μl

Mồi

...

...

...

xem Bảng C.18

Đoạn dò

RRS-Taq (xem Bảng C.18)

xem Bảng C.18

C.4.7.2  Các kiểm chứng PCR

Các dãy thử nghiệm phải bao gồm các kiểm chứng như quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

Nếu các kiểm chứng không cho các kết quả dự kiến, thì phải hủy kết quả và phân tích phải được lặp lại.

Ít nhất hai phương án lựa chọn thay thế nên sẵn có để làm kiểm chứng dương/vật liệu so sánh chuẩn, như sau.

a) ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng cao được tách chiết từ đậu tương, có thể sử dụng nếu số lượng ADN được biết, trên cơ sở tính toán các số bản sao trình tự đích từ kích thước bộ gen đậu tương.

...

...

...

Theo các yêu cầu đảm bảo chất lượng, các kiểm chứng dương tốt hơn không nên là các vật liệu so sánh chuẩn.

C.4.7.3  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian-nhiệt độ được nêu trong Bảng C.21 được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems) ^3^9).

Trong thử nghiệm cộng tác, chương trình được sử dụng kết hợp với TaqMan^® Universal Master Mix ^39). Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu điều chỉnh phù hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại Master Mix được sử dụng.

Bảng C.21 - Quy trình: Các điều kiện phản ứng

Thời gian s

Nhiệt độ °C

Tiền-PCR: khử nhiễm

...

...

...

50

Tiền-PCR: hoạt hóa ADN polymerase và biến tính ADN khuôn

600

95

PCR (40 chu trình)

Bước 1

Biến tính

...

...

...

95

Bước 2

Gắn mồi và kéo dài

60

59

C.4.8  Các hạn chế và diễn giải các kết quả

Nếu đậu tương biến đổi gen khác với GTS 40-3-2 chứa cùng các trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc, thì phương pháp chỉ phù hợp cho định lượng ADN GTS 40-3-2 khi không có mặt các GMO khác.

Phương pháp này chỉ phù hợp cho định lượng dòng đậu tương GTS 40-3-2 khi không có mặt các sự kiện GM khác chứa cùng cấu trúc này. Tỉ lệ này phản ánh lượng GTS 40-3-2 trong các đậu tương được nghiên cứu. Phương pháp này chỉ xác nhận giá trị sử dụng cho đậu tương.

Thử nghiệm cộng tác là một nguồn dữ liệu giá trị để hỗ trợ cho việc ước lượng độ không đảm bảo đo. Cần xác định bất kỳ nguồn không đảm bảo đo nào mà không được bao gồm trong dữ liệu thử nghiệm cộng tác, như lấy mẫu và những vấn đề khác, theo yêu cầu quốc tế ^[^44^],[^45].

...

...

...

Người phân tích phải xác định giá trị ngưỡng để xác định chu kì ngưỡng (Ct).

Ví dụ về các thủ tục sau khi phân tích PCR có sẵn trong Hướng dẫn của nhà sản xuất Bộ plasmid phát hiện đậu tương biến đổi gen (RRS) (Fasmac No. PS-2 và Nippon Gene No. 310-04981). Xem Tài liệu tham khảo [33].

Hệ số chuyển đổi (Cf) cho định lượng đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 và plasmid chuẩn được sử dụng trong thử nghiệm cộng tác là 0,95. Tính lượng RRS trong đậu tương, w, bằng phương trình sau:

w =

Trong đó:

N_GM là số của các bản sao của trình tự đích đặc hiệu GM trong ADN mẫu thử nghiệm;

N_TX là số của các bản sao của trình tự đích đặc hiệu taxon trong ADN mẫu thử nghiệm.

C.5  Phương pháp đặc hiệu cấu trúc để định lượng ADN ngô dòng MON 810 sử dụng real-time PCR

C.5.1  Giới thiệu

...

...

...

CHÚ THÍCH: Cf được sử dụng để tính toán hàm lượng GMO (% khối lượng) từ số bản sao ADN GMO của trình tự đặc hiệu đích và trình tự đặc hiệu taxon. Cf có thể được đo bằng tỉ lệ giữa số bản sao trình tự đặc hiệu đích với trình tự đặc hiệu taxon từ một mẫu chuẩn thích hợp.

Các hạn chế, xem C.5.8.

C.5.2  Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng

C.5.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này được tối ưu trên thiết bị real-time PCR ABI PRISM^® 7700 SDS 40) sử dụng plasmid PMul5 ^40) làm chuẩn ^[33^]. plasmid pMul5 trong các sản phẩm PCR riêng biệt được khuếch đại từ các hệ thống PCR để khuếch đại đặc hiệu trình tự taxon ở ngô (zSSIIb), trình tự promoter 35S (p35S) của vi rút khảm súp lơ, trình tự kết thúc của nopaline synthase (tNOS), và trình tự đặc hiệu cấu trúc của MON 810, Event 176, Bt11, GA21 và T25.

CHÚ THÍCH: plasmid được sử dụng làm chuẩn để xác định các hàm lượng GM được tính từ số bản sao tương đối của các trình tự ADN đặc hiệu GM và các trình tự ADN đặc hiệu taxon.

Đã kiểm tra độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng mẫu chuẩn và bột ngô khô chưa biết là hỗn hợp của ngô MON 810 và ngô thông thường ^[34^].

Số bản sao của các trình tự đặc hiệu taxon (zSSIIb) trong bộ gen được đánh giá cho 20 giống ngô đại diện.

Phương pháp được công bố trong các tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản và Hàn Quốc^[35^],^[36^],[^37^],[^38^].

...

...

...

Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia thử nghiệm trên tổng số 12 mẫu ngô chưa biết có chứa khoảng 0 % đến 10 % (theo khối lượng) bột ngô khô có nguồn gốc từ dòng MON 810.

CHÚ THÍCH  Các hạt ngô giống MON 810 đại diện dị hợp tử đối với tính trạng GM được sử dụng để xác định các giá trị Cf và để chuẩn bị các mẫu chưa biết cho các thử nghiệm cộng tác. Chuẩn bị các mẫu chưa biết của các hỗn hợp bột ngô dùng cho xác nhận giá trị sử dụng ở các mức độ 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột ngô của giống ngô trên. Độ đồng nhất của các mẫu tại mỗi mức độ được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp định lượng này theo các quy trình của AOAC ^[34],[39].

Phương pháp này đã được xác nhận giá trị sử dụng cho ngô MON 810 trong một thử nghiệm cộng tác theo quy trình của AOAC ^[39^] Thử nghiệm cộng tác được tổ chức bởi Viện Nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (NFRI, Tsukuba, Nhật Bản) cùng với Trung tâm cấp nhãn hiệu Chất lượng Thực phẩm và Dịch vụ Người tiêu dùng, Saitama, Nhật Bản và Viện Khoa học Sức khỏe Quốc gia, Tokyo, Nhật Bản. Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia bao gồm các phòng thử nghiệm của Nhật Bản, Hàn Quốc và Mỹ thực hiện các thử nghiệm cộng tác sử dụng hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM®7700 SDS (Applied Biosystems) trong hai giai đoạn riêng biệt41). Tất cả các phòng tham gia được yêu cầu phải tuân theo các quy trình tách chiết ADN và PCR định lượng.

Giai đoạn đầu nhằm xác định Cf của MON 810. Tất cả các phòng tham gia được nhận các bộ mồi, đoạn dò, mẫu chuẩn và các ADN được tách chiết từ các hạt ngô giống MON 810, được chuẩn bị bởi Qiagen DNeasy Plant Maxi kít ^41) và sự thích hợp đã được kiểm tra tại NFRI trước cuộc thử nghiệm. Các ADN đã được sử dụng để đo các số bản sao của trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc MON 810 và trình tự ADN zSSIIb đặc hiệu taxon ở ngô. Tất cả các phép đo trong giai đoạn này được lặp lại 3 lần. Tổng cộng 90 bộ dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm tham gia. Các tương quan của các đường chuẩn thu được từ các phòng thử nghiệm tham gia có thể chấp nhận được (r > 0,990). Theo quy trình thực hiện của AOAC ^[^39^], các phòng thử nghiệm có số lạc bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran (p <0,025) và kiểm định Grubbs (p <0,025). Sau hai kiểm định, phát hiện một phòng thử nghiệm có một số lạc Cochran ở tỉ lệ giữa trình tự MON 810 đặc hiệu cấu trúc với trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon. Không có số lạc quan sát được ở các tỉ lệ khác, như được trình bày trong Bảng C.22

Bảng C.22 - Tóm tắt Cf cho MON 810

Trình tự đích

Đặc hiệu cấu trúc MON 810

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

15

...

...

...

1

Số lượng số lạc Grubbs

0

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại

14

Cf^a

0,38 ± 0,01

^a Cf được biểu thị dạng trung bình ± khoảng tin cậy (α =0,05).

Người phân tích có thể xác định lại Cf bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn ngô MON 810 thích hợp.

...

...

...

Mười bốn phòng thử nghiệm tham gia trong giai đoạn hai đã phân tích 168 mẫu bằng cách khuếch đại trình tự zSSIIb và trình tự đặc hiệu cấu trúc MON 810. Các phòng thử nghiệm không báo cáo các mẫu trắng là 0 % bị coi là không hợp lệ và tất cả các dữ liệu của các phòng thử nghiệm này bị loại ra trước khi tiến hành các kiểm định số lạc. Trong tất cả các thí nghiệm, các tương quan của các đường chuẩn đã có thể chấp nhận được (r > 0,990). Các phòng thử nghiệm có giá trị bất thường trong cặp mù đôi ở mỗi mức độ MON 810 bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran và Grubbs ^[^40^],[^41], tương ứng, trước khi phân tích thống kê độ chính xác và độ chụm. Năm số lạc Cochran và một số lạc Grubbs đã được phát hiện trong dữ liệu. Giá trị trung bình, độ chệch, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%) và độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) ở mỗi mức độ trộn được trình bày trong Bảng C.23 ^[34].

CHÚ THÍCH 2  Các cộng tác viên không tính toán các kết quả cuối cùng sử dụng Cf được xác định bởi nghiên cứu cộng tác đầu tiên. Các số bản sao của mỗi trình tự đích thu được trong các xác định Cf và các thử nghiệm mù được báo cáo cho NFRI và đơn vị % GMO của các mẫu thử nghiệm mù đã được chuyển đổi về kết quả cuối cùng bằng cách sử dụng Cf.

Bảng C.23 - Tóm tắt xác nhận giá trị sử dụng cho định lượng ngô MON 810 đặc hiệu cấu trúc

Mức độ trộn (%)

0,1

0,5

1

5

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

14

14

14

14

14

Số lượng phòng thử nghiệm không hợp lệ

0

0

...

...

...

0

0

Số lượng số lạc Cochran

2

1

0

1

1

Số lượng số lạc Grubbs

...

...

...

0

0

0

0

Số phòng lượng thí nghiệm được giữ lại

11

13

14

13

...

...

...

Trung bình hàm lượng GMO (%)

0,1

0,5

1,0

4,8

9,8

Độ chệch của giá trị đúng (%)

+25,0

+9,4

...

...

...

-4,3

-1,8

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r^a

0,040

0,082

0,124

0,647

1,028

Giới hạn lặp lại r^a (r = 2,8 s_r)

...

...

...

0,231

0,347

1,813

2,879

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)^b

32,3

15,1

11,8

13,5

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập s_R^a

0,040

0,107

0,158

0,647

1,140

Giới hạn tái lập R^a (R = 2,8 x s_r)

0,113

0,301

...

...

...

1,813

3,191

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)^b

32,3

19,6

15,1

13,5

11,6

Dưới 20 bảo sao^c (Giới hạn phát hiện tuyệt đối trong phương pháp này)

...

...

...

0/26

0/28

0/26

0/26

^a Được biểu thị theo đơn vị % GMO.

^b Được biểu thị là tỉ lệ phần trăm của giá trị trung bình.

^c Được biểu thị là tỉ lệ của số lượng dữ liệu dưới 20 bản sao được giữ lại với tổng số dữ liệu được giữ lại.

C.5.2.3  Đặc hiệu phân tử

C.5.2.3.1  Yêu cầu chung

...

...

...

Nếu cấu trúc ADN đưa vào MON 810 sử dụng cho các sự kiện GM khác, thì có thể thu được kết quả dương tính giả do trình tự được khuếch đại bắt nguồn từ cấu trúc này.

C.5.2.3.2  Đặc hiệu lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu DDBJ 43) (ngày 3 tháng 12 năm 1999) và các tài liệu đánh giá sự an toàn được công bố bởi Bộ Y tế, Lao động và Phúc lợi Nhật Bản và Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Nhật Bản, sử dụng các trình tự nucleotit như là chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3 44). Các kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với trình tự đích dự kiến.

C.5.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Kiểm tra các mẫu bột ngô khô chứa 0 % đến 10 % (phần khối lượng, được chuẩn bị bởi NFRI) ngô biến đổi gen dòng MON 810 bằng khuếch đại ADN với mồi và đoạn dò đã thu được các sản phẩm PCR dự kiến ^[^33]^,[^34].

Các nền mẫu được kiểm tra là ngô hạt, bột kiều mạch ngô, bột ngô và bột ngô xay thô.

Các kiểm tra đặc hiệu trước khi thử nghiệm cộng tác cho thấy không có phản ứng chéo giữa bộ mồi/ đoạn dò của phương pháp này với các loài/mẫu không phải đích sau: lúa (Oryza sativa), lúa mì (Triticum aestivum) và lúa mạch (hordeum vulgare). Không quan sát thấy phản ứng chéo ở đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2, ở ngô biến đổi gen các dòng Event176, Bt11, GA21 và T25.

C.5.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa chất phản ứng được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (ABI)^44) sử dụng hóa chất TaqMan^®44)^[^43^].

...

...

...

C.5.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn (33).

LOD tương đối được xác nhận trong thử nghiệm cộng tác: mẫu chuẩn 0,5 % MON 810.

C.5.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn [33).

LOQ tương đối được xác nhận trong thử nghiệm cộng tác: mẫu chuẩn 0,5 % MON 810.

C.5.3  Điều chỉnh

Chưa có thông tin cụ thể.

C.5.4  Nguyên tắc

...

...

...

Đoạn trình tự đặc hiệu taxon có chiều dài 151 bp của zSSIIb được khuếch đại bằng PCR trong phản ứng real-time PCR riêng biệt sử dụng hai mồi đặc hiệu zSSIIb ở ngô, và các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR bằng một đoạn dò TaqMan^®44) đặc hiệu zSSIIb.

Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng số bản sao ADN được tách chiết từ mẫu chưa biết. Các đường chuẩn riêng biệt của mỗi bộ mồi/đoạn dò được tạo thành trong cùng một lần chạy khuếch đại phân tích. Các đường chuẩn gồm năm nồng độ chứa 20, 125, 1 500, 20 000, 250 000 bản sao ADN plasmid pMul5 45)^[33^]. Tại mỗi điểm của năm điểm chuẩn, phép đo được thực hiện ba lần. Các phản ứng lặp lại ba lần bằng cách sử dụng độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu thử và đo trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems)^45) trong cùng một lần chạy phân tích.

Các giá trị C_t (chu kì ngưỡng) xác định cho các điểm chuẩn của zSSIIb hoặc đích đặc hiệu cấu trúc MON 810, tương ứng, được vẽ đồ thị đối với logarit số bản sao ADN plasmid pMul5 ^[^33^] để thiết lập một đường chuẩn, số bản sao ADN mẫu kiểm tra có được bằng cách nội suy từ các đường chuẩn. Để xác định lượng MON 810 trong mẫu kiểm tra, lấy số bản sao của cấu trúc MON 810 chia cho số bản sao gen zSSIIb và Cf của MON 810 đặc hiệu cấu trúc, nhân với 100 để có được tỉ lệ phần trăm như mô tả trong C.5.9.

C.5.5  Thuốc thử

C.5.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.5.5.2  Nước

C.5.5.3  TaqMan^® Universal Master Mix ^45), 2 x.

C.5.5.4  Mẫu chuẩn (Plasmid)

...

...

...

C.5.5.5  Các oligonucleotit

Các trình tự của các mồi và đoạn dò của gen đặc hiệu cấu trúc MON 810 và gen đặc hiệu taxon ở ngô được liệt kê trong Bảng C.24.

Bảng C.24 - Các oligonudeotit

Tên

Trình tự ADN oligonucleotit

Nồng độ cuối trong PCR

Trình tự đích gen đặc hiệu taxon

SSIIb 1-5'

5’-CTC CCA ATC CTT TgA CAT CTg C-3'

...

...

...

SSIlb 1-3'

5'-TCg ATT TCT CTC TTg gTg ACA gg-3'

500 nmol/l

SSllb-Taq

5'-FAM-AgC AAA gTC AgA gCg CTg CAA TgC A-TAMRA-3'

200 nmol/l

Trình tự đích GMO

MON810 2- 5'

5'-gAT gCC TTC TCC CTA gTg TTg A-3'

...

...

...

MON810 2- 3'

5'-ggA TgC ACT CgT TgA TgT TTg - 3’

500 nmol/l

MON810-Taq

5'-FAM-AgA TAC CAA gCg gCC ATg gAC AAC AA -TAMRA-3'

200 nmol/l

FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.

Chiều dài sản phẩm PCR của SSIIb là 151 bp; chiều dài sản phẩm PCR của MON 810 là 113 bp.

C.5.6  Thiết bị, dụng cụ

...

...

...

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

C.5.6.2  Máy chu trình nhiệt

Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được thử nghiệm với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^®7700 SDS (Applied Biosystems) 46) trong thời gian thử nghiệm cộng tác. Các thiết bị real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh thích hợp các điều kiện phản ứng.

C.5.6.3  Khay và các nắp ống phản ứng

Khay và các nắp ống phản ứng phải phù hợp để khuếch đại PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng ABI PRISM^®, hoặc các nắp quang học MicroAmp^® (8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems) ^46), tương ứng. Các khay phản ứng khác, lọ nhỏ hoặc các nắp ống phản ứng khác cũng có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương đương hoặc tốt hơn.

C.5.7  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

C.5.7.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích zSSIIb đặc hiệu taxon và cho trình tự đích đặc hiệu MON 810 phải được thực hiện trong các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.

Phương pháp quy định tổng thể tích PCR 25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng, với các thành phần thuốc thử được nêu ra trong Bảng C.25 cho zSSIIb và trong Bảng C.26 cho MON 810.

...

...

...

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)

2,5 μl

Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase và dNTP)

TaqMan^® Universal PCR Master Mix (ABI)

12,5 μl

Mồi

SSIIb1-5' và SSIIb1-3' (xem Bảng C.24)

...

...

...

Đoạn dò

SSIIb-Taq (xem Bảng C.24)

xem Bảng C.24

Bảng C.26 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại trình tự đặc hiệu MON 810 ở thể tích cuối cho mỗi ống phản ứng.

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)

2,5 μl

Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase và dNTP)

...

...

...

12,5 μl

Mồi

MON810 2-5' và MON810 2-3' (xem Bảng C.24)

xem Bảng C.24

Đoạn dò

MON810-Taq (xem Bảng C.24)

xem Bảng C.24

C.5.7.2  Các kiểm chứng PCR

Mỗi dãy kiểm tra phải bao gồm các kiểm chứng như quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

...

...

...

Ít nhất hai phương án lựa chọn thay thế nên sẵn có để làm kiểm chứng dương/ vật liệu so sánh chuẩn, như sau.

a) ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng cao được tách chiết từ ngô hạt, có thể sử dụng nếu số lượng ADN được biết, trên cơ sở tính toán các số bản sao của trình tự đích từ kích thước bộ gen ngô MON 810.

b) Một plasmid chứa các trình tự đích có thể được bổ sung ở các nồng độ khác nhau với các số lượng bản sao đã biết. Plasmid này có trong bộ plasmid phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PS-2 và Nippon Gene No 310-04981) 47)^[33].

Theo các yêu cầu đảm bảo chất lượng, các kiểm chứng dương tốt hơn không nên là các vật liệu so sánh chuẩn.

C.5.7.3  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian-nhiệt độ được nêu trong Bảng C.27 được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems) ^47^).

Trong thử nghiệm cộng tác, chương trình sử dụng kết hợp với TaqMan^® Universal Master Mix ^47). Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu điều chỉnh phù hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại Master Mix được sử dụng.

Bảng C.27 - Các điều kiện phản ứng

...

...

...

Nhiệt độ °C

Tiền-PCR: khử nhiễm

120

50

Tiền-PCR: hoạt hóa ADN polymerase và biến tính khuôn mẫu ADN

600

95

PCR (40 chu trình)

...

...

...

Bước 1

Biến tính

30

95

Bước 2

Gắn mồi và kéo dài

60

59

C.5.8  Các hạn chế và diễn giải các kết quả

...

...

...

Phương pháp này chỉ phù hợp để đo tỉ lệ giữa trình tự đặc hiệu cấu trúc MON 810 với trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon ở ngô. Tỉ lệ này phản ánh lượng MON 810 trong ngô nghiên cứu. Phương pháp này chỉ xác nhận giá trị sử dụng cho ngô hạt.

Thử nghiệm cộng tác là một nguồn dữ liệu giá trị để hỗ trợ cho việc ước lượng độ không đảm bảo đo. Cần xác định bất kỳ nguồn không đảm bảo đo nào mà không được bao gồm trong dữ liệu của thử nghiệm cộng tác, như lấy mẫu và những vấn đề khác, theo yêu cầu quốc tế ^[44^],^[45^].

C.5.9  Hiệu chuẩn và tính kết quả

Người phân tích phải xác định giá trị ngưỡng để xác định chu kì ngưỡng (C_t).

Ví dụ về các thủ tục sau khi phân tích PCR có sẵn trong Hướng dẫn của nhà sản xuất bộ plasmid phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319-04981)^48). Xem Tài liệu tham khảo [33].

Giá trị Cf cho định lượng đặc hiệu cấu trúc MON 810 và plasmid chuẩn được sử dụng trong thử nghiệm cộng tác là 0,38. Tính lượng ngô biến đổi gen trong mẫu thử nghiệm, w, theo phương trình sau:

w =

Trong đó:

N_GM là số lượng bản sao của trình tự đích đặc hiệu GM trong ADN mẫu thử nghiệm.

...

...

...

C.6  Phương pháp đặc hiệu cấu trúc để định lượng ADN ngô dòng Event176 sử dụng real-time PCR

C.6.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp phát hiện và định lượng gen đặc hiệu taxon của ngô (gen tổng hợp tinh bột ngô llb: zSSIIb) và vùng nối cấu trúc ADN đặc hiệu giữa gen tổng hợp CrylA(b) có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis và trình tự intron No.9 mã hóa phosphoenol pyruvate carboxylase ở ngô có mặt trong ngô biến đổi gen dòng Event176, dựa trên real-time PCR sử dụng plasmid làm chuẩn để định lượng tương đối ngô dòng Event176 qua sử dụng hệ số chuyển đổi (Cf) là tỉ lệ của các số bản sao giữa các trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc với các trình tự ADN đặc hiệu taxon trong ngô hạt đại diện cho dòng Event176 thuần chủng.

CHÚ THÍCH Cf được sử dụng để tính toán hàm lượng GMO (%, theo khối lượng) từ số bản sao ADN GMO của các trình tự đặc hiệu đích và các trình tự đặc hiệu taxon. Cf có thể được đo bằng tỉ lệ giữa số bản sao trình tự đặc hiệu đích với trình tự đặc hiệu taxon từ một mẫu chuẩn thích hợp.

Các hạn chế, xem C.6.8.

C.6.2  Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng

C.6.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này được tối ưu trên thiết bị real-time PCR ABI PRISM^® 7700 SDS ^48) sử dụng plasmid pMul5 làm chuẩn ^[33^]. plasmid pMul5 trong các sản phẩm PCR riêng biệt được khuếch đại từ các hệ thống PCR để khuếch đại đặc hiệu trình tự taxon ở ngô (zSSIIb), trình tự promotor 35S ở virút khảm súp lơ (p35S), trình tự kết thúc của nopaline synthase (tNOS), và trình tự đặc hiệu cấu trúc của MON 810, Event176, Bt11, GA21 và T25.

CHÚ THÍCH plasmid được sử dụng làm chuẩn để xác định các hàm lượng GM được tính từ các số bản sao tương đối của các trình tự ADN đặc hiệu GM và các trình tự ADN đặc hiệu taxon.

...

...

...

Số bản sao của các trình tự đặc hiệu taxon (zSSIIb) trong bộ gen được đánh giá cho 20 giống ngô đại diện.

Phương pháp được công bố trong các tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản và Hàn Quốc ^[^35]^,^[36]^,^[37],[38].

C.6.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia thử nghiệm trên tổng số 12 mẫu ngô chưa biết có chứa khoảng 0 % và 10 % (theo khối lượng) bột ngô khô có nguồn gốc từ dòng Event176.

CHÚ THÍCH 1: Các hạt ngô giống Bt176 đại diện, dị hợp tử đối với tính trạng GM được sử dụng để xác định các giá trị Cf và để chuẩn bị các mẫu chưa biết cho các thử nghiệm cộng tác. Chuẩn bị các mẫu chưa biết của các hỗn hợp bột ngô dùng cho xác nhận giá trị sử dụng ở các mức độ 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột ngô của giống ngô trên. Độ đồng nhất của các mẫu tại mỗi mức độ được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp định lượng này theo các quy trình của AOAC ^[34],[39].

Phương pháp này đã được xác nhận giá trị sử dụng cho ngô Event176 trong một thử nghiệm cộng tác theo quy trình của AOAC ^[3^9]. Thử nghiệm cộng tác được tổ chức bởi Viện nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (NFRI, Tsukuba, Nhật Bản), cùng với Trung tâm cấp nhãn hiệu Chất lượng Thực phẩm và Dịch vụ Người tiêu dùng, Saitama, Nhật Bản và Viện Khoa học Sức khỏe Quốc gia, Tokyo, Nhật Bản. Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia bao gồm các phòng thử nghiệm của Nhật Bản, Hàn Quốc và Mỹ thực hiện các thử nghiệm cộng tác trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS 49) (Applied Biosystems) trong hai giai đoạn riêng biệt. Tất cả các phòng thử nghiệm tham gia được yêu cầu phải tuân theo các quy trình tách chiết ADN và PCR định lượng.

Giai đoạn đầu nhằm xác định Cf của Event176. Tất cả các phòng thử nghiệm tham gia được nhận các bộ mồi, đoạn dò, mẫu chuẩn và các ADN được tách chiết từ các hạt ngô giống Event176, được chuẩn bị bởi Qiagen DNeasy Plant Maxi kít ^49) và sự thích hợp đã được kiểm tra tại NFRI trước cuộc thử nghiệm. Các ADN đã được sử dụng để đo các số bản sao của trình tự ADN zSSIIb đặc hiệu taxon ở ngô và trình tự đặc hiệu cấu trúc Event176. Tất cả các phép đo trong giai đoạn này được lặp lại ba lần. Tổng cộng 90 bộ dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm tham gia. Các tương quan của các đường chuẩn trong dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm tham gia có thể chấp nhận được (r > 0,990). Theo quy trình thực hiện của AOAC ^[39^], các phòng thử nghiệm có số lạc bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran (p < 0,025) và kiểm định Grubbs (p < 0,025). Không có phòng thử nghiệm có số lạc được quan sát thấy trong các kiểm định này, như được trình bày trong Bảng C.28.

Bảng C.28 - Tóm tắt Cf^3 cho Event176

Trình tự đích

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

15

Số lượng số lạc Cochran

0

Số lượng số lạc Grubbs

0

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại

15

Cf^a

...

...

...

^a Cf được biểu thị dạng trung bình ± khoảng tin cậy (α = 0,05).

Người phân tích có thể xác định lại giá trị Cf bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn ngô Event176 thích hợp.

Giai đoạn hai thực hiện các thử nghiệm mù. Các mẫu bột ngô chưa biết được thiết kế thành sáu cặp mù đôi, gồm 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột ngô biến đổi gen dòng Event176 dạng khô trong ngô thông thường. Mẫu trắng Event176 0 % được sử dụng để loại bỏ các phòng thử nghiệm không hợp lệ trước khi phân tích thống kê. Các phòng tham gia được chỉ dẫn tách chiết ADN từ các mẫu bằng cách sử dụng Qiagen kít. Dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm được giữ lại bởi các kiểm định số lạc được sử dụng để tính toán giá trị trung bình và khoảng tin cậy (a = 0,05). Các giá trị trung bình được xác định là Cf dùng cho tính toán hàm lượng GMO (%) trong các thử nghiệm mù. Giá trị trung bình của Cf cho định lượng đặc hiệu cấu trúc Event176 là 2,05.

Mười bốn phòng thử nghiệm tham gia trong giai đoạn thứ hai đã phân tích 168 mẫu bằng cách khuếch đại trình tự zSSIIb và trình tự đặc hiệu cấu trúc Event176. Các phòng thử nghiệm không báo cáo các mẫu trắng là 0 % bị coi là không hợp lệ và tất cả các dữ liệu của các phòng thử nghiệm này bị loại ra trước khi tiến hành các kiểm định số lạc. Trong tất cả các thí nghiệm, các tương quan của các đường chuẩn đã có thể chấp nhận được (r > 0,990). Các phòng thử nghiệm có giá trị bất thường trong cặp mù đôi ở mỗi mức độ Event176 bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran và Grubbs [40], [41], tương ứng, trước khi phân tích thống kê độ chính xác và độ chụm. Bốn số lạc Cochran đã được phát hiện trong dữ liệu. Giá trị trung bình, độ chệch, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%) và độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) ở mỗi mức độ trộn được trình bày trong Bảng C.29.

CHÚ THÍCH 2: Các cộng tác viên không tính toán các kết quả cuối cùng sử dụng Cf được xác định bởi nghiên cứu cộng tác đầu tiên. Các số bản sao của mỗi trình tự đích thu được trong các xác định Cf và các thử nghiệm mù được báo cáo cho NFRI và đơn vị % GMO của các mẫu thử nghiệm mù được chuyển đổi về kết quả cuối cùng bằng cách sử dụng Cf.

Bảng C.29 - Tóm tắt xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng ngô Event176 đặc hiệu cấu trúc

Mức độ trộn (%)

0,1

...

...

...

1

5

10

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

14

14

14

14

14

...

...

...

1

1

1

1

1

Số lượng số lạc Cochran

1

2

0

...

...

...

1

Số lượng số lạc Grubbs

0

0

0

0

0

Số phòng thử nghiệm được giữ lại

12

...

...

...

13

13

12

Trung bình hàm lượng GMO (%)

0,1

0,5

0,9

5,0

9,6

...

...

...

+ 11,3

-1,6

-7,7

0,0

-3,8

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r^a

0,018

0,029

0,066

...

...

...

0,554

Giới hạn lặp lại r^a (r = 2,8 s_r)

0,051

0,080

0,184

1,137

1,552

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)^b

16,3

...

...

...

7,1

8,1

5,8

Độ lệch chuẩn tái lập s_R^a

0,024

0,051

0,106

0,559

0,917

...

...

...

0,066

0,142

0,296

1,565

2,566

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)^b

21,3

10,3

11,4

...

...

...

9,5

Dưới 20 bản sao^c (giới hạn phát hiện tuyệt đối trong phương pháp này)

1/24

0/22

0/26

0/26

0/24

^a Được biểu thị theo đơn vị % GMO.

^b Được biểu thị là tỉ lệ phần trăm của giá trị trung bình.

...

...

...

C.6.2.3  Đặc hiệu phân tử

C.6.2.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này được mô tả trong Tài liệu tham khảo [33]. Thông tin về cấu trúc di truyền đưa vào bộ gen ngô sẵn có trong Tài liệu tham khảo [33] và [46]. Các mồi và đoạn dò TaqMan^® 50) để phát triển phương pháp được thiết kế bằng thông tin mô tả trong Tài liệu tham khảo [46].

Nếu cấu trúc ADN đưa vào Event176 được sử dụng cho các sự kiện GM khác, thì có thể thu được kết quả dương tính giả do trình tự được khuếch đại bắt nguồn từ cấu trúc này.

C.6.2.3.2  Đặc hiệu lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu DDBJ 51) (ngày 3 tháng 12 năm 1999) và các tài liệu đánh giá sự an toàn được công bố bởi Bộ Y tế, Lao động và Phúc lợi Nhật Bản, và Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Nhật Bản, sử dụng các trình tự nucleotit như là chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3 ^50). Các kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với trình tự đích dự kiến.

C.6.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Kiểm tra các mẫu bột ngô khô chứa 0 % đến 10 % (phần khối lượng, được chuẩn bị bởi NFRI) ngô biến đổi gen Event176 bằng khuếch đại ADN với mồi và đoạn dò đã thu được các sản phẩm PCR dự kiến ^[^33^],[^34^].

Các nền mẫu được kiểm tra là ngô hạt, bột kiều mạch ngô, bột ngô và bột ngô xay thô.

...

...

...

C.6.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa chất phản ứng được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^®7700 SDS (ABI) sử dụng hóa chất TaqMan^® ^50)^[^43].

Thiết kế mồi và đoạn dò được thực hiện bằng phần mềm Primer Express^® (Applied Biosystems).

C.6.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn ^[33^].

LOD tương đối được xác nhận trong các thử nghiệm cộng tác: 0,1 % Event176.

C.6.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn [33].

LOQ tương đối được xác nhận trong các thử nghiệm cộng tác: 0,1 % Event176.

...

...

...

Chưa có thông tin cụ thể.

C.6.4  Nguyên tắc

Đoạn trình tự đặc hiệu cấu trúc có chiều dài 100 bp của Event176 được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho Event176. Sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu cho Event176 được đánh dấu bằng hai loại thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^® 52) được sử dụng.

Đoạn đặc hiệu taxon có chiều dài 151 bp của zSSIIb được khuếch đại bằng phản ứng real-time PCR riêng biệt sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho zSSIIb, và các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan^®^52) đặc hiệu zSSIIb.

Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng số bản sao ADN được tách chiết từ mẫu chưa biết. Đường chuẩn riêng biệt của mỗi bộ mồi/đoạn dò được tạo thành trong cùng một lần chạy khuếch đại phân tích. Các đường chuẩn gồm năm nồng độ chứa 20, 125, 1 500, 20 000, 250 000 bản sao ADN plasmid pMul5 ^52). Tại mỗi điểm của năm điểm chuẩn, phép đo được thực hiện ba lần. Các phản ứng lặp lại ba lần bằng cách sử dụng độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu thử và đo trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems) trong cùng một lần chạy phân tích.

Các giá trị C_t xác định cho các điểm chuẩn của zSSIIb hoặc đích đặc hiệu cấu trúc Event176, tương ứng, được vẽ đồ thị đối với logarit số bản sao ADN plasmid pMul5 ^[^33^] để thiết lập một đường chuẩn, số bản sao ADN mẫu kiểm tra có được bằng cách nội suy từ các đường chuẩn. Để xác định lượng Event176 trong mẫu kiểm tra, lấy số bản sao của cấu trúc Event176 chia cho số bản sao gen zSSIIb và Cf của Event176 đặc hiệu cấu trúc, nhân với 100 để có được tỉ lệ phần trăm như mô tả trong C.6.9.

C.6.5  Thuốc thử

C.6.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

...

...

...

C.6.5.3  TaqMan^® Universal Master Mix ^52), 2 x.

C.6.5.4  Mẫu chuẩn (Plasmid)

Mẫu chuẩn được sử dụng để xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp này là plasmid pMul5 ^[33] có trong bộ plasmid phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319- 04981) ^52^). Có thể sử dụng các mẫu chuẩn khác với điều kiện hiệu năng được chứng minh là tương đương hoặc tốt hơn.

C.6.5.5  Các oligonucleotit

Trình tự của của các mồi và đoạn dò của gen đặc hiệu cấu trúc Event176 và gen đặc hiệu taxon ở ngô được liệt kê trong Bảng C.30.

Bảng C.30 - Các oligonucleotit

Tên

Trình tự ADN oligonucleotit

Nồng độ cuối trong PCR

...

...

...

SSIIb 1-5'

5’-CTC CCA ATC CTT TgA CAT CTg C-3'

500 nmol/l

SSIIb 1-3'

5'-TCg ATT TCT CTC TTg gTg ACA gg-3'

500 nmol/l

SSIIb-Taq

5'-FAM-AgC AAA gTC AgA gCg CTg CAA TgC A-TAMRA-3'a

200 nmol/l

...

...

...

E176 2-5’

5'-TgT TCA CCA gCA gCA ACC Ag-3'

500 nmol/l

E176 2-3'

5'-ACT CCA CTT TgT gCA gAA CAg ATC T-3'

500 nmol/l

E176-Taq

5'-FAM-CCg ACg TgA CCg ACT ACC ACA TCg A -TAMRA-3’a

200 nmol/l

...

...

...

Chiều dài sản phẩm PCR của SSIIb là 151 bp; chiều dài sản phẩm PCR của Event176 là 100 bp.

C.6.6  Thiết bị, dụng cụ

C.6.6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

C.6.6.2  Máy chu trình nhiệt

Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được thử nghiệm với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems) 53) trong thời gian thử nghiệm cộng tác. Các thiết bị real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh thích hợp các điều kiện phản ứng.

C.6.6.3  Khay và các nắp ống phản ứng

Khay và các nắp ống phản ứng phải phù hợp để khuếch đại PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng ABI PRISM^®, hoặc các nắp quang học MicroAmp^® (8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems) ^53), tương ứng. Các khay phản ứng, lọ nhỏ hoặc nắp ống phản ứng khác cũng có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương đương hoặc tốt hơn.

C.6.7  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

...

...

...

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích zSSIIb đặc hiệu taxon và cho trình tự đích đặc hiệu Event176 phải được thực hiện trong các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hoặc xác nhận giá trị sử dụng.

Phương pháp quy định tổng thể tích PCR 25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng, với các thành phần thuốc thử như liệt kê trong Bảng C.31 đối với zSSIIb và trong Bảng C.32 đối với Event176.

Bảng C.31 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon ở thể tích cuối cho mỗi ống phản ứng

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)

2,5 μl

Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase và dNTP)

TaqMan^® Universal PCR Master Mix (ABI)

...

...

...

Mồi

SSIIb1-5' và SSIIb1-3' (xem Bảng C.30)

xem Bảng C.30

Đoạn dò

SSIIb-Taq (xem Bảng C.30)

xem Bảng C.30

Bảng C.32 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại trình tự đặc hiệu Event176 ở thể tích cuối cho mỗi ống phản ứng.

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

...

...

...

2,5 μl

Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase và dNTP)

TaqMan^® Universal PCR Master Mix (ABI)

12,5 μl

Mồi

E176 2-5' và E176 2-3' (xem Bảng C.30)

xem Bảng C.30

Đoạn dò

E176-Taq (xem Bảng C.30)

...

...

...

C.6.7.2  Các kiểm chứng PCR

Mỗi dãy kiểm tra phải bao gồm các kiểm chứng như quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

Nếu các kiểm chứng không cho các kết quả dự kiến, thì phải hủy kết quả và phải phân tích lặp lại.

Ít nhất hai phương án lựa chọn thay thế nên sẵn có để làm kiểm chứng dương/vật liệu so sánh chuẩn, như sau.

a) ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng cao được tách chiết từ ngô hạt có thể sử dụng nếu số lượng ADN được biết, trên cơ sở tính toán các số bản sao của trình tự đích từ kích thước bộ gen ngô Event176.

b) Một plasmid chứa các trình tự đích có thể được bổ sung ở các nồng độ khác nhau với các số lượng bản sao đã biết. Plasmid này có trong bộ Plasmid phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PS-2 và Nippon Gene No. 310-04981) 54) ^[^33^].

Theo yêu cầu đảm bảo chất lượng, các kiểm chứng dương tốt hơn không nên là các vật liệu so sánh chuẩn.

C.6.7.3  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian-nhiệt độ được nêu trong Bảng C.33 được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems) ^54^).

...

...

...

Bảng C.33 - Các điều kiện phản ứng

Thời gian s

Nhiệt độ °C

Tiền PCR: khử nhiễm

120

50

Tiền PCR: hoạt hóa ADN polymerase và biến tính khuôn mẫu ADN

600

...

...

...

PCR (40 chu trình)

Bước 1

Biến tính

30

95

Bước 2

Gắn mồi và kéo dài

...

...

...

59

C.6.8  Các hạn chế và diễn giải các kết quả

Nếu ngô biến đổi gen khác với Event176 có chứa cùng các trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc, thì phương pháp này chỉ thích hợp cho định lượng ADN Event176 khi không có mặt các GMO khác.

Phương pháp này chỉ phù hợp để đo tỉ lệ giữa trình tự đặc hiệu cấu trúc Event176 với trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon ở ngô. Tỉ lệ này phản ánh lượng Event176 trong ngô nghiên cứu. Phương pháp này chỉ xác nhận giá trị sử dụng cho ngô hạt.

Thử nghiệm cộng tác là một nguồn dữ liệu giá trị để hỗ trợ cho việc ước lượng độ không đảm bảo đo. Cần xác định bất kỳ nguồn không đảm bảo đo nào mà không được bao gồm trong dữ liệu của thử nghiệm cộng tác, như lấy mẫu và những vấn đề khác, theo yêu cầu quốc tế ^[44^],[^45].

C.6.9  Hiệu chuẩn và tính kết quả

Người phân tích phải xác định giá trị ngưỡng để xác định chu kì ngưỡng (C_t).

Các ví dụ về các thủ tục sau khi phân tích PCR có sẵn trong Hướng dẫn của nhà sản xuất bộ plasmid phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319-04.981). Xem Tài liệu tham khảo [33].

Giá trị Cf cho định lượng đặc hiệu cấu trúc Event176 và plasmid chuẩn được sử dụng trong các thử nghiệm cộng tác là 2,05. Tính lượng ngô biến đổi gen trong mẫu thử nghiệm theo phương trình sau:

...

...

...

Trong đó:

N_GM là số lượng bản sao của trình tự đích đặc hiệu GM trong ADN mẫu thử nghiệm;

N_TX là số lượng bản sao của trình tự đích đặc hiệu taxon trong ADN mẫu thử nghiệm.

C.7  Phương pháp đặc hiệu cấu trúc để định lượng ADN ngô dòng Bt11 sử dụng realtime PCR

C.7.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp phát hiện và định lượng gen đặc hiệu taxon của ngô (gen tổng hợp tinh bột ngô llb: zSSIIb) và vùng nối cấu trúc ADN đặc hiệu giữa gen tổng hợp crylA(b) có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis với trình tự intron của gen Adh1 mã hóa enzyme khử hydro của alcohol trong ngô biến đổi gen Bt11, dựa trên real-time PCR bằng cách sử dụng plasmid làm chuẩn để định lượng tương đối Bt11 qua sử dụng hệ số chuyển đổi (Cf) là tỉ lệ của các số bản sao giữa các trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc với các trình tự ADN đặc hiệu taxon trong ngô hạt đại diện cho dòng Bt11 thuần chủng.

CHÚ THÍCH Cf được sử dụng để tính toán hàm lượng GMO (%, theo khối lượng) từ số bản sao ADN GMO của các trình tự đặc hiệu đích và các trình tự đặc hiệu taxon. Cf có thể được đo bằng tỉ lệ giữa số bản sao trình tự đặc hiệu đích với trình tự đặc hiệu taxon từ một mẫu chuẩn thích hợp.

Các hạn chế, xem C.7.8.

C.7.2  Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng

...

...

...

Phương pháp này được tối ưu trên thiết bị real-time PCR ABI PRISM^® 7700 SDS 55) sử dụng plasmid pMul5 làm chuẩn ^[33]. Plasmid pMul5 trong các sản phẩm PCR riêng biệt được khuếch đại từ các hệ thống PCR để khuếch đại đặc hiệu trình tự taxon ở ngô (zSSIIb), trình tự promotor 35S ở virút khảm súp lơ (p35S), trình tự kết thúc của nopaline synthase (tNOS), và trình tự đặc hiệu cấu trúc của MON 810, Event176, Bt11, GA21 và T25.

CHÚ THÍCH plasmid được sử dụng làm chuẩn để xác định các hàm lượng GM được tính từ các số bản sao tương đối của các trình tự ADN đặc hiệu GM và các trình tự ADN đặc hiệu taxon.

Đã kiểm tra độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng mẫu chuẩn và bột ngô khô chưa biết là hỗn hợp của ngô Bt11 và ngô thông thường ^[^34^].

Số bản sao của các trình tự đặc hiệu taxon (zSSIIb) trong bộ gen được đánh giá cho 20 giống ngô đại diện.

Phương pháp được công bố trong các tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản và Hàn Quốc ^[35]^,^[36],[37],[38].

C.7.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia thử nghiệm trên tổng số 12 mẫu ngô chưa biết có chứa khoảng 0 % đến 10 % (theo khối lượng) bột ngô khô có nguồn gốc từ dòng Bt11.

CHÚ THÍCH 1 Các hạt ngô giống Bt11 đại diện, dị hợp tử đối với tình trạng GM được sử dụng để xác định các giá trị Cf và để chuẩn bị các mẫu chưa biết cho các thử nghiệm cộng tác. Chuẩn bị các mẫu chưa biết của các hỗn hợp bột ngô dùng cho xác nhận giá trị sử dụng ở các mức độ 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) của bột ngô khô có nguồn gốc từ giống ngô trên. Độ đồng nhất của các mẫu tại mỗi mức độ được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp định lượng này theo các quy trình của AOAC ^[^34^],[^39^].

Phương pháp đã được xác nhận giá trị sử dụng cho ngô Bt11 trong một thử nghiệm cộng tác theo quy trình của AOAC ^[^39]. Thử nghiệm cộng tác được tổ chức bởi Viện Nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (NFRI, Tsukuba, Nhật Bản), cùng với Trung tâm cấp nhãn hiệu Chất lượng Thực phẩm và Dịch vụ Người tiêu dùng, Saitama, Nhật Bản và Viện Khoa học Sức khỏe Quốc gia, Tokyo, Nhật Bản. Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia bao gồm các phòng thử nghiệm của Nhật Bản, Hàn Quốc và Mỹ thực hiện các thử nghiệm cộng tác trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems)^55) trong hai giai đoạn riêng biệt. Tất cả các phòng thử nghiệm tham gia được yêu cầu phải tuân theo các quy trình tách chiết ADN và PCR định lượng.

...

...

...

Bảng C.34 - Tóm tắt Cf cho Bt11

Trình tự đích

Cấu trúc đặc hiệu Bt11

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

15

Số lượng số lạc Cochran

0

Số lượng số lạc Grubbs

0

...

...

...

15

Cf^a

0,50 ±0,01

^a Cf được biểu thị dạng trung bình ± khoảng tin cậy (a = 0,05).

Người phân tích có thể xác định lại giá trị Cf bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn ngô dòng Bt11 phù hợp.

Giai đoạn hai thực hiện các thử nghiệm mù. Các mẫu bột ngô chưa biết được thiết kế thành sáu cặp mù đôi, gồm 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột ngô biến đổi gen dòng Bt11 dạng khô trong ngô thông thường. Mẫu trắng Bt11 0 % được sử dụng để loại bỏ các phòng thử nghiệm không hợp lệ trước khi phân tích thống kê. Các phòng tham gia được chỉ dẫn tách chiết ADN từ các mẫu bằng cách sử dụng Qiagen kít. Dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm được giữ lại bởi các kiểm định số lạc được sử dụng để tính toán giá trị trung bình và khoảng tin cậy (α = 0,05). Các giá trị trung bình được xác định là Cf dùng cho tính toán hàm lượng GMO (%) trong các thử nghiệm mù. Giá trị trung bình của Cf cho định lượng đặc hiệu cấu trúc Bt11 là 0,5.

Mười bốn phòng thử nghiệm tham gia trong giai đoạn thứ hai đã phân tích 168 mẫu bằng cách khuếch đại trình tự zSSIIb và trình tự đặc hiệu cấu trúc Bt11. Các phòng thử nghiệm không báo cáo các mẫu trắng là 0 % bị coi là không hợp lệ và tất cả các dữ liệu của các phòng thử nghiệm này bị loại ra trước khi tiến hành các kiểm định số lạc. Trong tất cả các thí nghiệm, các tương quan của các đường chuẩn có thể chấp nhận được (r > 0,990). Các phòng thử nghiệm có giá trị bất thường trong cặp mù đôi ở mỗi mức độ Bt11 bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran và Grubbs ^[40^],^[4^1], tương ứng, trước khi phân tích thống kê độ chính xác và độ chụm. Hai số lạc Cochran và một số lạc Grubbs đã được phát hiện trong dữ liệu. Giá trị trung bình, độ chệch, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%) và độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) ở mỗi mức độ trộn được trình bày trong Bảng C.35.

CHÚ THÍCH 2 Các cộng tác viên không tính toán các kết quả cuối cùng sử dụng Cf được xác định bởi nghiên cứu cộng tác đầu tiên. Các số bản sao của mỗi trình tự đích thu được trong các xác định Cf và các thử nghiệm mù được báo cáo cho NFRI và đơn vị % GMO của các mẫu thử nghiệm mù được chuyển đổi về kết quả cuối cùng bằng cách sử dụng Cf.

Bảng C.35 - Tóm tắt thống kê độ chính xác và độ chụm cho real-time PCR định lượng Bt11

...

...

...

Mức độ trộn (%)

0,1

0,5

1

5

10

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

Số lượng phòng thử nghiệm không hợp lệ

Số lượng số lạc Cochran

...

...

...

Số phòng thử nghiệm được giữ lại

Trung bình hàm lượng GMO (%)

Độ chệch của giá trị đúng (%)

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r^a

Giới hạn lặp lại r^a (r = 2,8 x s_r)

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)^b

Độ lệch chuẩn tái lập s_R^a

Giới hạn tái lập R^a (R = 2,8 x s_R)

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)^b

...

...

...

14

0

2

1

11

0,1

-9,0

0,020

0,057

...

...

...

0,020

0,057

22.3

21/22

14

0

0

0

14

...

...

...

+2,0

0,121

0,338

23,7

0,121

0,338

23.7

0/28

14

...

...

...

0

0

14

1,2

+14,7

0,216

0,606

18,9

0,216

...

...

...

18.9

0/28

14

0

0

0

14

6,1

+21,6

...

...

...

2.325

13,7

0,830

2.325

13.7

0/28

14

0

0

...

...

...

14

12,1

+21,1

1,258

3,524

10,4

1,389

3,889

11.5

...

...

...

^a Được biểu thị theo đơn vị % GMO.

^b Được biểu thị là tỉ lệ phần trăm của giá trị trung bình.

^c Được biểu thị là tỉ lệ của số lượng dữ liệu dưới 20 bản sao được giữ lại với tổng số dữ liệu được giữ lại.

C.7.2.3  Đặc hiệu phân tử

C.7.2.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này được mô tả trong Tài liệu tham khảo [33]. Thông tin về cấu trúc di truyền đưa vào bộ gen ngô sẵn có trong tài liệu tham khảo [33] và [46]. Các mồi và đoạn dò TaqMan^® 57) để phát triển phương pháp được thiết kế bằng thông tin mô tả trong Tài liệu tham khảo ^[46].

Nếu cấu trúc ADN đưa vào Bt11 được sử dụng cho các sự kiện GM khác, thì có thể thu được kết quả dương tính giả do trình tự được khuếch đại bắt nguồn từ cấu trúc này.

C.7.2.3.2  Đặc hiệu lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu DDBJ 58) (ngày 3 tháng 12 năm 1999) và các tài liệu đánh giá sự an toàn được công bố bởi Bộ Y tế, Lao động và Phúc lợi Nhật Bản, và Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Nhật Bản, sử dụng các trình tự nucleotit như là chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3 ^57). Các kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với trình tự đích dự kiến.

...

...

...

Kiểm tra các mẫu bột ngô khô chứa 0 % đến 10 % (phần khối lượng, được chuẩn bị bởi NFRI) ngô biến đổi gen dòng Bt11 bằng khuếch đại ADN với mồi và đoạn dò thu được sản phẩm PCR dự kiến^[^33^].

Các nền mẫu được kiểm tra là ngô hạt, bột kiều mạch ngô, bột ngô và bột ngô xay thô.

Các kiểm tra đặc hiệu trước khi thử nghiệm cộng tác cho thấy không có phản ứng chéo giữa bộ mồi/đoạn dò với các loài/mẫu không phải đích sau: lúa (Oryza sativa), lúa mì (Triticum aestivum) và lúa mạch (Hordeum vulgare). Không quan sát thấy phản ứng chéo ở đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2, ở ngô biến đổi gen các dòng MON 810, Event176, GA21 và T25.

C.7.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa chất phản ứng được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS 59) (ABI) sử dụng hóa chất TaqMan^® ^59)^[^43^].

Thiết kế mồi và đoạn dò được thực hiện bằng phần mềm Primer Express^® (Applied Biosystems)^59).

C.7.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn ^[^33^].

LOD tương đối được xác nhận trong các thử nghiệm cộng tác: 0,5 % Bt11.

...

...

...

LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn ^[33].

LOQ tương đối được xác nhận trong các thử nghiệm cộng tác: 0,5 % Bt11.

C.7.3  Điều chỉnh

Chưa có thông tin cụ thể.

C.7.4  Nguyên tắc

Đoạn trình tự đặc hiệu cấu trúc có chiều dài 127 bp của Bt11 được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho Bt11. Sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu cho Bt11 được đánh dấu bằng hai loại thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^®^59) được sử dụng.

Đoạn trình tự đặc hiệu taxon có chiều dài 151 bp của zSSIIb được khuếch đại bằng phản ứng real-time PCR riêng biệt sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho zSSIIb, và các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan^®^59) đặc hiệu zSSIIb.

Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng số bản sao ADN được tách chiết từ mẫu chưa biết. Đường chuẩn riêng biệt của mỗi bộ mồi/đoạn dò được tạo thành trong cùng một lần chạy khuếch đại phân tích. Các đường chuẩn gồm năm nồng độ chứa 20, 125, 1 500, 20 000, 250 000 bản sao ADN plasmid pMul5. Tại mỗi điểm của năm điểm chuẩn, phép đo được thực hiện ba lần. Các phản ứng lặp lại ba lần bằng cách sử dụng độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu thử và đo trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS^59) trong cùng một lần chạy phân tích.

Các giá trị C_t xác định cho các điểm chuẩn của zSSIIb hoặc đích đặc hiệu cấu trúc Bt11, tương ứng, được vẽ đồ thị đối với logarit số bản sao ADN plasmid pMul5 ^59)[33] để thiết lập một đường chuẩn, số bản sao ADN mẫu kiểm tra có được bằng cách nội suy từ các đường chuẩn. Để xác định lượng Bt11 trong mẫu kiểm tra, lấy số bản sao của cấu trúc Bt11 chia cho số bản sao gen zSSIIb và Cf của Bt11 đặc hiệu cấu trúc, nhân với 100 để có được tỉ lệ phần trăm như mô tả trong C.7.9.

...

...

...

C.7.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.7.5.2  Nước

C.7.5.3  TaqMan^® Universal Master Mix 60), 2^x.

C.7.5.4  Mẫu chuẩn (Plasmid)

Mẫu chuẩn được sử dụng để xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp này là plasmid pMul5 ^[^33] có trong bộ plasmid phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319- 04 9 81)^[^33^] ^60). Có thể sử dụng các mẫu chuẩn khác với điều kiện hiệu năng được chứng minh là tương đương hoặc tốt hơn.

C.7.5.5  Các oligonucleotit

Trình tự của các mồi và đoạn dò của gen đặc hiệu cấu trúc Bt11 và gen đặc hiệu taxon ở ngô được liệt kê trong Bảng C.36.

Bảng C.36 - Các oligonucleotit

...

...

...

Trình tự ADN oligonucleotit

Nồng độ cuối trong PCR

Trình tự đích gen đặc hiệu taxon

SSIIb 1-5'

5-CTC CCA ATC CTT TgA CAT CTg C-3'

500 nmol/l

SSIIb 1-3'

5-TCg ATT TCT CTC TTg gTg ACA gg-3’

500 nmol/l

...

...

...

5'-FAM-AgC AAA gTC AgA gCg CTg CAA TgC A-TAMRA-3' ^a

200 nmol/l

Trình tự đích GMO

Bt11 3-5'

5-AAA AgA CCA CAA CAA gCC gC-3'

500 nmol/l

Bt11 3-3'

5-CAA TgC gTT CTC CAC CAA gTA CT-3'

500 nmol/l

...

...

...

5-FAM- CgA CCA Tgg ACA ACA ACC CAA ACA TCA-TAMRA-3' ^a

200 nmol/l

^a FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.

Chiều dài sản phẩm PCR của SSIIb là 151 bp; chiều dài sản phẩm PCR của Bt11 là 127 bp.

C.7.6  Thiết bị, dụng cụ

C.7.6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

C.7.6.2  Máy chu trình nhiệt

Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được thử nghiệm với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems)61) trong thời gian thử nghiệm cộng tác. Các thiết bị real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp các điều kiện phản ứng.

...

...

...

Khay và các nắp ống phản ứng phải phù hợp để khuếch đại PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng ABI PRISM^®, hoặc các nắp quang học MicroAmp^® (8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems) ^61), tương ứng. Các khay, lọ nhỏ hoặc nắp ống phản ứng khác cũng có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương đương hoặc tốt hơn.

C.7.7  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

C.7.7.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích zSSIIb đặc hiệu taxon và cho trình tự đích đặc hiệu Bt11 phải được thực hiện trong các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hoặc xác nhận giá trị sử dụng.

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR 25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng, với các thành phần thuốc thử được nêu ra trong Bảng C.37 đối với zSSIIb và trong Bảng C.38 đối với Bt11.

Bảng C.37 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon ở thể tích cuối cho mỗi ống phản ứng.

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)

...

...

...

Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase và dNTP)

TaqMan* Universal PCR Master Mix (ABI)

12,5 μl

Mồi

SSIIb1-5' và SSIIb1-3 (xem Bảng C.36)

xem Bảng C.36

Đoạn dò

SSIIb-Taq ( xem Bảng C.36)

xem Bảng C.36

...

...

...

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

Khuôn