TIÊU
CHUẨN QUỐC GIA
TCVN
12613:2019
ISO 21570:2005
THỰC
PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ
NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN ĐỊNH LƯỢNG AXIT NUCLEIC
Foodstuffs -
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products - Quantitative
nucleic acid based methods
Lời nói đầu
TCVN 12613:2019 hoàn toàn tương đương
với ISO 21570:2005 và Sửa đổi 1:2013;
TCVN 12613:2019 do Viện Kiểm nghiệm an
toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn
Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Lời giới thiệu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
TCVN 7605 (ISO 21569) Thực phẩm -
Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc
biến đổi gen -
Phương pháp dựa trên định tính axit nucleic
TCVN 12613 (ISO 21570) Thực phẩm -
Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc
biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định lượng axit nucleic.
Các thông tin về yêu cầu chung và định
nghĩa kể cả các bước nói trên được nêu trong:
TCVN 7608 (ISO 24276) Thực phẩm -
Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn
gốc biến đổi gen - Yêu cầu
chung và định nghĩa.
THỰC PHẨM - PHƯƠNG
PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN
SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN -
PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN ĐỊNH LƯỢNG AXIT NUCLEIC
Foodstuffs -
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products -
Quantitative nucleic acid based methods
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này cung cấp khung tổng thể
các phương pháp định lượng để phát hiện các sinh vật biến đổi gen (GMO) trong
thực phẩm bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các hướng dẫn, các yêu cầu tối thiểu
và tiêu chí thực hiện được quy định trong tiêu chuẩn này là để đảm bảo các kết
quả thu được từ các phòng thử nghiệm khác nhau là chính xác, lặp lại và so sánh
được.
Tiêu chuẩn này được thiết lập cho các
nền mẫu thực phẩm, nhưng cũng có thể được áp dụng cho các nền mẫu khác, ví dụ,
thức ăn chăn nuôi và các mẫu thực vật lấy ngoài môi trường.
Các ví dụ cụ thể của các phương pháp
được nêu ra trong các Phụ lục A đến Phụ lục D.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần
thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban
hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm
ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu
có).
TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005), Thực
phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản
phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định tính axit
nucleic
TCVN 7606 (ISO 21571), Thực phẩm -
Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi
gen - Tách chiết axit nucleic
TCVN 7608 (ISO 24276), Thực phẩm -
Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc
biến đổi gen - Yêu cầu chung và định nghĩa
TCVN 8891 (ISO Guide 32), Hiệu chuẩn
trong hóa phân tích và sử dụng mẫu chuẩn được chứng nhận.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trong tiêu chuẩn này, áp dụng các thuật
ngữ và định nghĩa trong TCVN 7608 (ISO 24276).
4 Nguyên tắc
4.1 Khái quát
Phép phân tích định lượng bao gồm định
lượng các trình tự ADN đích trong mẫu thử nghiệm. Mỗi phương pháp quy định các
trình tự đích cụ thể.
Phép phân tích định lượng có thể được
tiến hành bằng phương pháp PCR cạnh tranh [1],[2] hoặc phương
pháp PCR tức thời (real-time PCR)[3],[4].
Phép phân tích định lượng phải thể hiện
rõ số lượng yếu tố gen đích, liên quan đến số lượng các phép kiểm chứng, hiệu
chuẩn thích hợp và tham chiếu (chuẩn) đặc hiệu nằm trong dải động học của
phương pháp phân tích được sử dụng và phần mẫu thử được phân tích.
Phép phân tích nói chung bao gồm:
- Khuếch đại của một hay nhiều trình tự
đích đặc hiệu,
- Phát hiện và khẳng định tính đặc hiệu
của các sản phẩm PCR, và
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH Trong trường
hợp phân tích real-time PCR, việc khuếch đại, phát hiện và khẳng định xảy ra đồng thời.
4.2 Khuếch đại,
phát hiện và khẳng định các sản phẩm PCR
Xem TCVN 7605 (ISO 21569) về nguyên tắc
khuếch đại, phát hiện và khẳng định các trình tự ADN.
4.3 Định lượng
các sản phẩm PCR
Các nguyên tắc định lượng thường là để
xác định tỉ lệ (thể hiện là phần trăm) của hai trình tự ADN đích; ví dụ: một
trình tự đại diện cho sinh vật biến đổi gen quan tâm và một trình tự đặc hiệu-taxon
đích
(nội
sinh). Tuy nhiên trong một số trường hợp, việc định lượng cũng có thể được tiến
hành với một lượng nền mẫu thực phẩm cụ thể (ví dụ khi phát hiện vi sinh vật biến
đổi gen trong thực phẩm).
Các chất chuẩn (các vật liệu chuẩn) được
sử dụng để định lượng phải là những mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM), nếu có sẵn.
Nếu không có sẵn, nên sử dụng các mẫu chuẩn thích hợp khác. Ví dụ được nêu
trong tham khảo [5]. Thông tin về
các nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và độ không đảm
bảo đo đã được thu thập từ các nghiên cứu quốc tế [6], [7], [8], [9].
5 Thuốc thử
Tất cả các thuốc thử và các vật liệu
được sử dụng trong phân tích phải giống nhau, hoặc tương đương theo quy định
trong phương pháp này. Mặt khác, tất cả các thuốc thử và các vật liệu phải là loại dùng
cho sinh học phân tử. Các thuốc thử phải được bảo quản và sử dụng theo khuyến
cáo của nhà cung cấp hoặc theo các quy định đảm bảo chất lượng phòng thử nghiệm.
Đối với danh mục các thuốc thử, xem phụ lục cụ thể.
6 Thiết bị, dụng cụ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7 Hướng dẫn liên
quan đến quy trình
7.1 Tổng quan
Những lưu ý chung về khuếch đại PCR để
phát hiện GMO được nêu ra trong TCVN 7605 (ISO 21569).
Phụ lục A đến Phụ lục D quy định các
phương pháp PCR phát hiện cùng với những chi tiết về phạm vi áp dụng. Các đặc
tính hiệu năng của từng phương pháp được mô tả chi tiết.
Nồng độ của trình tự ADN quan tâm cần
nằm trong dải động học của phương pháp.
CHÚ THÍCH: Cần thực hiện
theo dõi đặc hiệu taxon đích để xác định khuôn mẫu ADN có đủ về chất lượng
hay không (chiều dài và tính toàn vẹn cấu
trúc), độ tinh khiết và chất lượng để cho phép phát hiện và định lượng GMO theo
taxon đích. Điều này có thể liên quan đặc biệt khi ADN được chiết từ nền mẫu hỗn
hợp hoặc nền mẫu đã qua nhiều khâu xử lý.
ADN đã chiết ra khỏi phần mẫu thử cần
được phân tích ít nhất 2 lần lặp lại.
Thử nghiệm phải bao gồm các phép kiểm
chứng thích hợp, xem Bảng 1 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
7.2 Sự ổn định
trình tự đích
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.3 Hiệu chuẩn
phép phân tích
Phải áp dụng số lượng các điểm chuẩn
thích hợp và lặp lại trên toàn dải định lượng (ví dụ: 4 điểm hiệu chuẩn với 2 lần
lặp lại (tổng 4x2 giá trị) hoặc sáu điểm hiệu chuẩn với mỗi phép đo tại một điểm
đo (tổng cộng là 6 giá trị). Chất lượng hiệu chuẩn ảnh hưởng đến độ
không đảm bảo đo [9].
Để thay thế cho các vật liệu so sánh
chuẩn là ADN bộ gen, ví dụ, có thể
thay bằng dãy plasmid pha
loãng hoặc các sợi đôi ADN tổng hợp chứa trình tự đích, miễn là nó được chứng
minh tương đương về hiệu năng so với ADN bộ gen của mẫu chuẩn và ADN bộ gen được
tách ra từ mẫu phân tích.
7.4 Các xem xét định
lượng
Các phương pháp PCR cần được thiết kế
phù hợp để giảm thiểu sự biến thiên.
CHÚ THÍCH: Tùy thuộc vào phương pháp sử
dụng và/hoặc vật liệu được phân tích, sự có mặt của nhiều gen chuyển có thể dẫn tới sự ước
lượng cao hơn hàm lượng GMO thực có.
Đối với phép xác định giới hạn định lượng
(LOQ), xem TCVN 7608 (ISO 24276).
Việc tính hàm lượng GMO dựa vào số lượng
bản sao của các trình tự đích
trên bộ gen đơn bội bị ảnh hưởng bởi sự đồng hợp tử và dị hợp tử của loài khảo
sát. Chi tiết, xem Phụ lục A đến Phụ lục D.
Việc sử dụng phương pháp ΔΔCt (chu kì
ngưỡng) chỉ có giá trị khi các hiệu quả khuếch đại của thử nghiệm đặc hiệu
taxon đích và thử nghiệm đặc hiệu GMO là tương tự nhau.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tính nhất quán giữa các phép đo nhằm đạt
được các ước lượng tin cậy về số lượng trình tự đích. Tuy nhiên, cần thiết lập độ lệch
chuẩn tương đối lặp lại của phương pháp để xem xét các giá trị đo có nhất quán
hay không [xem chi tiết bộ TCVN 6910 (ISO 5725)]. Để tính toán độ
lệch chuẩn tương đối lặp lại, số lượng các phép đo riêng rẽ trên từng mẫu phòng
thử nghiệm có thể vượt quá khả năng về chi phí có thể chấp nhận được. Do đó, nếu
một ADN có nguồn gốc GMO xác định được báo cáo lại (theo phần trăm), thì một giải
pháp linh hoạt được yêu cầu như sau:
a) tính nhất quán của một phần mẫu thử
- thông qua loại bỏ các phép đo <
LOQ, và
- thông qua độ lệch cực đại quan sát
được giữa các độ pha loãng của các phép đo riêng rẽ bằng giá trị dự kiến từ hệ
số pha loãng tương ứng ± 33 %;
b) tính nhất quán giữa các phần mẫu thử
- nồng độ ADN có nguồn gốc GMO từ a)
được ước tính tương đối cho mỗi phần thử nghiệm phải nằm trong khoảng -50 % đến
+100 % giá trị định lượng ước tính (bằng ΔCt của 1 lần chạy real-time PCR) (nghĩa là: đối
với 2 phần mẫu thử, các giá trị đo 1,0 % và 2,0 % là có thể chấp nhận và các
giá trị đo 0,9 % và 2,1 % là không được chấp nhận).
Để đảm bảo tính chính xác của các phép
đo, mẫu chuẩn (RM), tốt nhất là mẫu chuẩn đã được chứng nhận (CRM), để định lượng
các dòng có liên quan, với một mức độ thích hợp của độ tin cậy đo lường và với
nền mẫu phù hợp tương tự phải được chọn và phân tích. Trong trường hợp không có
CRM, mẫu chuẩn nội bộ có thể được chuẩn bị theo quy trình đã được chứng minh sự
ổn định, tính đồng nhất và có thể truy xuất nguồn gốc, bảo đảm không có độ chệch.
Độ không đảm bảo của phép định lượng được phải đáp ứng độ không đảm bảo đo của
chất chuẩn [xem TCVN 8891 (ISO Guide 32)].
8 Diễn giải kết quả
Kết quả PCR sẽ là a) hoặc b):
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- kết quả dương tính theo TCVN
7605:2007 (ISO 21569:2005, 8.1);
- sự ức chế phản ứng có thể quan sát
được là không đáng kể;
- phép phân tích có một giá trị đo rõ
ràng;
- hàm lượng trình tự đích nằm trong dải
động học của phương pháp;
- phép phân tích được hiệu chuẩn (xem
7.3), hoặc
b) Không phù hợp cho định lượng trình
tự đích nếu các điều kiện nêu ra ở a) không được đáp ứng.
Diễn giải các kết quả của độ đảm bảo
đo trong cùng một phần thử nghiệm: trong trường hợp các kết quả +/- ở hai lần lặp
lại, PCR lặp lại 2 lần cho phần thử nghiệm. Nếu hai lần lặp lại mới này cho kết quả +/-
hoặc -/-, các phần thử
nghiệm được coi là âm tính.
Diễn giải các kết quả độ không đảm bảo
đo giữa hai phần thử nghiệm: trong trường hợp các kết quả +/- ở hai phần mẫu thử
của một mẫu, cần tiến hành
chiết tách và phân tích hai phần thử nghiệm mới. Nếu các kết quả vẫn là +/-, mẫu
được coi là âm tính theo 6.3 của TCVN 7608 (ISO 24276).
Độ không đảm bảo đo phải đủ nhỏ để cho
phép các phòng thử nghiệm đưa ra các kết luận thích hợp.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nếu hàm lượng trình tự đích biến đổi
gen (GM) hoặc hàm lượng trình tự đích đặc hiệu taxon thấp hơn giới hạn định lượng,
thì kết quả cần phải được biểu thị dưới dạng định tính.
CHÚ THÍCH: Việc tuyên bố hàm lượng ADN
có nguồn gốc GMO dưới LOQ thực tế kèm theo đặc điểm kỹ thuật của LOQ được xem là biểu thị kết
quả định tính.
9 Biểu thị kết quả
Kết quả phải nêu rõ số lượng trình tự
đích GM so với trình tự đặc hiệu taxon đích. Các kết quả cần cung cấp các giá
trị về độ không đảm bảo đo như độ lệch chuẩn hoặc hệ số biến thiên.
Ngoài ra, cần báo cáo LOD và LOQ của phương pháp và LOD, LOQ thực tế. Kết quả
chỉ rõ cần báo cáo các đích GMO. Trong trường hợp phân tích sàng lọc định lượng
đối với các nền mẫu phức tạp, có thể xuất hiện các tín hiệu GMO từ
các taxon không phải đích.
Trình tự đích có thể phát hiện được hoặc
không phát hiện được hoặc số lượng ít nhất của một trong hai trình tự (trình
tự đặc hiệu taxon đích và/hoặc trình tự đích biến đổi gen) dưới giới hạn định
lượng. Bảng 1 mô tả 4 trường hợp khác nhau và biểu thị kết quả tương ứng cần được
ghi vào báo cáo thử nghiệm.
Các hàm lượng ADN có nguồn gốc GMO
cũng có thể được báo cáo lớn hơn hoặc nhỏ hơn một giá trị cụ thể, có tính đến độ không
đảm bảo đo.
10 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải phù hợp với
TCVN 7608 (ISO 24276) và TCVN 7605 (ISO 21569) và phải có ít nhất các thông tin
sau:
a) LOQ của phương pháp và nền mẫu đã
dùng để thiết lập LOQ;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
c) viện dẫn phương pháp đã được sử dụng
để tách chiết ADN;
d) viện dẫn các phương pháp đã được sử
dụng để khuếch đại các trình tự đích ADN;
e) mẫu chuẩn đã sử dụng;
f) các kết quả biểu thị theo quy định
tại Điều 9
g) các đích PCR là “đặc hiệu sự kiện”,
hoặc “đặc hiệu cấu trúc” hoặc “sàng lọc”
h) định nghĩa độ không đảm bảo đo được
sử dụng.
CHÚ THÍCH: Đối với g) hoặc
h) các thông tin số có thể ở tài liệu khác (ví dụ: xem xét hợp đồng, bảng dữ liệu
kỹ thuật).
Bảng 1 - Biểu thị kết
quả
Kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trình tự đặc
hiệu taxon đích không phát hiện được
“Đối với loài X, ADN không phát hiện
được”
Trình tự đặc
hiệu taxon đích phát hiện được nhưng trình tự đích GM không phát hiện được
Theo TCVN 7605 (ISO 21569)
“Đối với mẫu X, trình tự đích biến đổi
gen Y không phát hiện được”.
LOD của phương pháp là x % được xác
định với ABC (mẫu chuẩn)
Nếu không thể mô tả cỡ mẫu thử nghiệm
và tổng số ADN đích trong PCR đủ để áp dụng LOD, thì câu sau đây cần được
thêm vào:
“Tuy nhiên, tổng số ADN đích được
chiết từ loài X có thể là/ không đủ để LOD có thể được áp dụng đối với
mẫu này. LOD mẫu là x %”. (Chỉ rõ đơn vị sử
dụng)
CHÚ THÍCH: LOD mẫu được xác định bởi số lượng
ADN của loài có trong ống phân tích (số bản sao) và tỉ lệ
tương đối so với LOD tuyệt đối của đích GM (số bản sao), và trong trường
hợp các hạt, số hạt tỉ lệ với phần
được nghiền.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đối với mỗi GMO, nêu rõ:
“ADN có nguồn gốc GMO (chỉ rõ GMO) được
xác định bởi sự phát hiện (chỉ rõ trình tự đích) có nguồn gốc (chỉ rõ loài)
được phát hiện, dưới LOQ thực tế”.
Ngoài ra, nếu có thể “LOQ thực tế là
x %”
(Chỉ rõ đơn vị sử dụng)
Phát hiện được cả hai trình tự đặc
hiệu taxon đích và trình tự đích GM và số lượng cả 2 trình tự đích cao hơn
LOQ.
Đối với mỗi GMO, nêu rõ:
“Hàm lượng ADN có nguồn gốc GMO (chỉ
rõ GMO) được xác định bằng phát hiện (chỉ rõ trình tự đích) có nguồn gốc từ
(chỉ rõ loài) là x ± Umeas
%” trong đó Umeas là độ không đảm bảo đo. (Chỉ rõ đơn vị sử
dụng)
Phụ
lục A
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các phương pháp đặc hiệu taxon-đích
A.1 Phương pháp đặc
hiệu taxon đích để định lượng tuyệt đối ADN gen adh1 của ngô sử dụng real-time
PCR
A.1.1 Giới
thiệu
Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại
đặc hiệu và định lượng gen adh1 (mã hóa alcohol dehydrogenase 1) ở ngô (Zea
mays) đặc hiệu taxon để xác định hàm lượng ADN ngô, hoặc để kiểm tra sự có
mặt/ không có mặt các chất ức chế PCR có thể phát hiện được trong các dung dịch
ADN tách chiết từ các sản phẩm có chứa ADN có nguồn gốc từ ngô, ví dụ: thực phẩm.
Các hạn chế, xem A.1.8.
A.1.2 Xác nhận
giá trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng
A. 1.2.1 Yêu cầu chung
Phương pháp được tối ưu cho ADN được
tách chiết từ ngô hạt nghiền tinh khiết, lá ngô và các mẫu chuẩn được chứng nhận
(dãy IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413[10])[11].
Kiểm tra độ tái lập của phương pháp
trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết (U1 tới U6) gồm
có ADN ngô hoang dại với số bản sao tương ứng khác nhau của trình tự đích (xem
A.1.2.2), và trong các thử nghiệm cộng tác khác kết hợp với các phương pháp đặc
hiệu cho các sự kiện ngô biến đổi gen, ví dụ Bt11 (xem D.1).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tính ổn định alen (allelic)
của trình tự đích đã được thiết lập[11].
A.1.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Phương pháp đã được xác nhận giá trị sử
dụng trong một thử nghiệm cộng tác do Trung tâm Nghiên cứu chung của Ủy ban
Châu Âu (EC-JRC), Viện Sức khỏe và Bảo vệ Người tiêu dùng (IHCP) tổ chức, phù hợp
với các quy định được hài hòa ở cấp quốc tế [12].
Sáu mẫu ADN (S1-S6) của ngô hoang dại
được tách chiết từ lá [13] chứa các số bản sao biết trước (183 486,
61 162, 20 387, 6 796, 2 265, 755) của các bộ gen ngô đơn bội được sử dụng để
thiết lập đường chuẩn để định lượng tuyệt đối các bộ gen ngô đơn bội trong các
mẫu chưa biết, số lượng bản sao tuyệt đối trong các mẫu đã biết được xác định bằng
cách chia khối lượng ADN trong mẫu (được xác định bởi định lượng huỳnh quang của
sợi đôi ADN với PicoGreen, Molecular Probes, Cat. Number P-7589) cho giá trị 1C
trung bình được công bố ở các bộ gen ngô (2 725 pg) [14].
Sáu mẫu (U1-U6) của ADN ngô dại (được
tách chiết từ lá [13]) được sử dụng
làm các mẫu chưa biết. Các số bản sao dự kiến trong các mẫu chưa biết đã được
xác định theo cùng một cách giống như xác định cho các mẫu đã biết.
Các kết quả xác nhận giá trị sử dụng của
phương pháp trong thử nghiệm cộng tác được tóm tắt trong Bảng A.1.
Phương pháp cũng được xác nhận giá trị
sử dụng kết hợp với các phương pháp đặc hiệu-sự kiện cho một vài loại ngô biến
đổi gen, ví dụ: ngô ngọt Bt11. Xem các Tài liệu tham khảo [15] và [16]
và D.1 để biết chi tiết trong thử nghiệm kết hợp (định lượng tương đối).
Bảng A.1 - Dữ
liệu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
U1
U2
U3
U4
U5
U6
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia
12
12
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
12
12
12
Số lượng phòng thử nghiệm trả kết quả
10
10
10
10
10
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số lượng phòng thử nghiệm không hợp
lệ
1
1
1
1
1
1
Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại
9
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9
9
9
9
Số lượng mẫu cho mỗi phòng thử nghiệm
4
4
4
4
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4
Số lượng số lạc Cochran
1
1
1
1
-
-
Số lượng số lạc Grubbs
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
1
1
1
1
Số lượng mẫu được chấp nhận
35
34
34
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
35
35
Giá trị số lượng bản sao dự kiến
7 339
18 349
36 697
55 046
91 743
146 788
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9 985
23 885
46 918
75 161
100 541
122 080
Độ chệch của giá trị thực (%)
36,1
30,2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
36,5
9,6
-16,8
Độ lệch chuẩn lặp lại Sra
1 318,59
1 463,60
5 796,58
4 539,57
11 306,89
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)b
13,21
6,13
12,35
6,04
11,25
12,16
Độ lệch chuẩn tái lập SRa
2 013,12
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6 145,39
6 806,85
14 592,04
17 777,70
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)b
20,16
8,72
13,10
9,06
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
14,56
a Được biểu
thị là giá trị số lượng bản
sao.
b Được biểu
thị là phần trăm của giá trị trung bình.
A.1.2.3 Đặc hiệu phân
tử
A.1.2.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp được thiết kế dựa vào một phần của
trình tự được mô tả trong EMBL/GenBank/DDBJ2) mã số tiếp cận
X04050. Trình tự này là duy nhất đối với Zea mays (ngô/ngũ cốc) và phân loài Zea
mays subsp. diploperennis (teosinte)[11].
A.1.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua một tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu
GenBank/EMBL/DDBJ 2) sử dụng các trình tự nucleotit làm các trình tự
truy vấn với chương
trình BLASTN 2) tại địa chỉ http://www.ncbi.nlm.gov.blast/ (ngày 9 tháng
10 năm 2003). Kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận sự tương đồng hoàn toàn chỉ
với các trình tự đích dự kiến.
A.1.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1.2.4 Tối ưu hóa
Tối ưu hóa được thực hiện đối với hệ
thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM 7700® 3) và hóa
chất TaqMan® 3). Thiết kế mồi và đoạn
dò được thực hiện với phần mềm Express Primer® (Applied Biosystem)3).
A.1.2.5 Giới hạn phát
hiện (LOD)
Theo các phòng thử nghiệm phân tích,
LOD tuyệt đối là 10 bản sao của trình tự đích [11].
Số lượng bản sao thấp nhất của trình tự
đích trong thử nghiệm cộng tác là 7 399.
A.1.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
Theo các phòng thử nghiệm phân tích,
LOQ tuyệt đối là 100 bản sao của trình tự đích[11].
Số lượng bản sao thấp nhất của trình tự đích
trong thử nghiệm cộng tác là 7 399.
A.1.3 Điều
chỉnh
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1.4 Nguyên
tắc
Đoạn ADN của gen adh1 có chiều
dài 134 bp được khuếch đại sử dụng hai mồi đặc hiệu adh1 của ngô (xem Bảng
A.2). Các sản phẩm PCR tích lũy đo được ở cuối mỗi chu trình PCR (real-time) bằng
đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu- adh1 của ngô (ADH1-MDO, xem Bảng A.2)
được đánh dấu với 2 thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh
quang và TAMRA là thuốc
nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan® 3) đã được sử dụng.
Tín hiệu huỳnh quang đo được vượt qua
giá trị ngưỡng, được xác định bởi người phân tích sau một số chu trình nhất định.
Con số này được gọi là giá trị Ct. Để định lượng tổng số ADN-adh1 của
ngô trong một mẫu chưa biết, giá trị Ct được chuyển đổi thành giá trị số bản
sao tương ứng bằng cách so sánh với đường chuẩn có giá trị Ct được kiên kết trực
tiếp với các số bản sao đã biết (phân tích hồi quy).
A.1.5 Thuốc
thử
A.1.5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử đã sử
dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276)
A.1.5.2 Nước.
A.1.5.3 Dung dịch đệm
PCR (không có MgCI2), 10 x.
A.1.5.4 Dung dịch MgCI2, c(MgCI2)
= 25 mmol/l.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1.5.6 Các
oligonucleotit
Chi tiết của các
oligonucleotit được liệt kê trong Bảng A.2.
Bảng A.2 -
Các oligonucleotit
Tên
Trình tự
ADN oligonucleotit
Nồng độ cuối
trong PCR
ADH-FF3
5'-CgT CgT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3'
300 nmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5’-CCA CTC CgA gAC CCT CAg TC-3'
300 nmol/l
ADH1-MDO
5’-FAM-AAT CAg ggC TCA TTT TCT CgC
TCC TCA-TAMRA-3’a
200 nmol/l
a FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA:
6-carboxytetramethylrhodamine.
Chiều dài của đoạn gen được khuếch đại
adh1 là 134 bp.
A.1.5.7 Enzym ADN
polymerase chịu nhiệt
Enzym ADN Polymerase của AmpliTaq Gold®
4).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1.5.9 Hỗn hợp phản ứng khuếch
đại
Chi tiết của hỗn hợp phản ứng khuếch đại
được liệt kê trong Bảng A.3.
Bảng A.3 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn mẫu ADN (tối đa 250 ng)
5 μl
Taq-ADN polymerase
TaqMan® Universal Master
Mix 2 x
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hệ thống khử nhiễm (dUTP bao gồm
uracil N-glycosylase)
Đệm phản ứng (chứa chuẩn thụ động
ROX)a
Hỗn hợp dNTP
Mồi
Xem Bảng A.2
Xem A.1.5.6
Đoạn dò
Xem Bảng A.2
Xem A.1.5.6
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1.6 Thiết
bị, dụng cụ
A. 1.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của
phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
A.1.6.2 Máy chu trình
nhiệt
Hồ sơ nhiệt độ-thời gian quy định được
thử nghiệm ban đầu với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700
SDS (Applied Biosystems) 5). Các thiết bị phát
hiện real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp với các điều
kiện phản ứng.
A.1.6.3 Các ống phản ứng
Các ống phản ứng phải phù hợp với quá
trình khuếch đại PCR trong máy chu trình nhiệt real-time, ví dụ: khay phản ứng
quang học 96 giếng ABI PRISM® hoặc các nắp quang học MicroAmp®
(8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystem)5).
A.1.7 Cách
tiến hành: Chuẩn bị PCR
A.1.7.1 Yêu cầu
chung
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp này quy định tổng thể tích
PCR 25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với thuốc thử như được liệt kê trong Bảng
A.3.
A.1.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Nếu các kiểm chứng không mang lại các
kết quả dự kiến, phải hủy bỏ các kết quả thử nghiệm và phải tiến hành phân tích lại.
ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng cao
được tách chiết từ ngô (ví dụ: một CRM từ JRC, IRMM 5)) có thể được
sử dụng[13] làm kiểm chứng
dương/vật liệu so sánh chuẩn. Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm
như được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
A.1.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ được
nêu trong Bảng A.4 được tối ưu hóa trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM®
7700 (Applied Biosysytem)5). Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng,
chương trình thời gian-nhiệt độ được sử dụng với ADN polymerase của AmpliTaq
Gold® 5). Việc sử dụng các
máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu sự điều chỉnh phù hợp cụ thể. Nhiệt độ
và thời gian yêu cầu để hoạt hóa enzyme phụ thuộc vào từng loại polymerase được
sử dụng. Bảng A.4 nêu ra các điều kiện phản ứng.
Bảng A.4 -
Quy trình: Các điều kiện phản ứng
Thời gian s
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tiền PCR: Khử nhiễm
120
50
Tiền PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính khuôn ADN
600
95
PCR (50 chu trình)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Biến tính
15
95
Bước 2
Gắn mồi-kéo dài
60
60
A.1.8 Các hạn
chế và diễn giải các kết quả
Sự có mặt của các chất ức chế PCR
có thể tác động lớn đến độ chính xác của số bản sao adh1 được ước tính
trong các mẫu phân tích. Vì vậy, cần khẳng định sự không có mặt của các chất ức chế
PCR có thể phát hiện được [xem Phụ lục A của TCVN 7606 (ISO 21571)], ví dụ bằng
cách thiết lập các dãy pha loãng của ADN khuôn và kiểm tra sự phù hợp giữa các
dãy pha loãng và các khác biệt trong các giá trị Ct (chu kì ngưỡng) (ví dụ: một
Ct tương ứng với gấp đôi nồng độ khuôn).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1.9 Hiệu
chuẩn và tính kết quả
Các điểm chuẩn được tạo ra với các lượng
xác định ADN trong các số bản sao tuyệt đối của ADN bộ gen ngô đơn bội có chứa
trình tự đích.
Dựng đường chuẩn bằng cách vẽ đồ thị
các giá trị Ct đối với logarit số bản sao đích của các điểm chuẩn. Điều này có
thể thực hiện được, ví dụ, sử dụng bảng tính trong Microsoft Excel 6), hoặc sử dụng
trực tiếp bằng các tùy chọn sẵn có của phần mềm hệ thống phát hiện trình tự.
Đường chuẩn được sử dụng để xác định
các số bản sao ADN tuyệt đối của ngô đơn bội ở các mẫu chưa biết. Cho dù ADN mẫu
có thể bị phân hủy bởi quá trình chế biến thực phẩm hoặc có thể chứa các thành
phần khác với ngô, điều này không ảnh hưởng đến số lượng các bản sao bộ gen đơn
bội tính được của các mẫu chưa biết.
A.2 Phương pháp đặc
hiệu taxon đích để phát hiện ADN có nguồn gốc từ gạo
A.2.1 Nguyên
tắc
Gen SPS ở gạo phù hợp dùng làm
gen nội chuẩn trong việc định lượng và xác định gạo GM (Tài liệu tham khảo
[59]). Phòng thử nghiệm phát hiện GMO Trường Đại học Tổng hợp JiaoTong
(GMDL-SJTU) đã tổ chức thử nghiệm cộng tác để xác nhận khả năng áp dụng của gen
sucrose phosphate synthase (SPS) ở gạo làm gen nội chuẩn để phân tích định lượng
gạo biến đổi gen và không biến đổi gen. Mười hai phòng thử nghiệm đến từ Tây
Ban Nha, Hàn Quốc, Lihuania, Slovenia, Nhật Bản, Ý và Trung Quốc tham gia vào
nghiên cứu này.
Quy trình tiến hành nghiên cứu cộng
tác bao gồm các mô-đun sau.
Real-time PCR định lượng các mẫu ADN gạo
(mẫu mù) sử dụng để dựng đường chuẩn
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thử nghiệm liên phòng được tiến hành
phù hợp với các hướng dẫn quốc tế được chấp nhận sau đây:
- TCVN 6910 (ISO 5725);[51]-[56]
- Quy trình chính thức của IUPAC về
thiết kế, tiến hành và diễn giải kết quả nghiên cứu được tiến hành theo phương
pháp
Các kết quả nghiên cứu liên phòng cũng
như các protocol liên quan được trình bày trong A.2.3.3
A.2.2 Phạm
vi áp dụng
Phương pháp được tối ưu cho gạo hạt và
các sản phẩm đã qua chế biến chứa hỗn hợp gạo và các nền mẫu khác, ví dụ: ngô và đậu
tương. Khả năng áp dụng của gen SPS được kiểm tra thông qua các thử nghiệm cộng
tác sử dụng mẫu ADN
chiết tách từ gạo hạt.
A.2.3 Xác nhận
giá trị sử dụng của phương pháp và các tiêu chí thực hiện
A.2.3.1 Độ vững của
phương pháp
Độ vững của phương pháp real-time PCR
định lượng gen SPS được thử nghiệm bởi tổ chức phát triển phương pháp với các
chương trình thời gian-nhiệt độ khác nhau (hai bước và ba bước) và trên ba mẫu
ADN khác nhau chứa tổng số ADN gạo biết trước (10 ng, 1 ng, 0,1 ng mẫu ADN bộ
gen gạo). Mỗi mẫu được thử nghiệm 3 lần lặp lại. Phương pháp real-time PCR có độ
mạnh mong muốn và được tiến hành tốt ở các chương trình thời gian-nhiệt độ khác
nhau ở ba nồng độ ADN gạo khác nhau.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.3.2 Thử nghiệm nội
bộ
Để chuẩn bị mẫu, tất cả các mẫu ADN được
chiết tách bằng phương pháp cetyl(trimethyl) ammonium bromide (CTAB) được chấp
nhận bởi TCVN 7606 (ISO 21571). Tiến hành định lượng tổng số ADN chiết tách bằng
cách sử dụng phương pháp quang phổ được chấp nhận trong B.1 của TCVN 7606 (ISO
21571),. Sau khi định lượng ADN, tiến hành phân tích real-time PCR định lượng để
cung cấp dữ liệu về sự ức chế phản ứng PCR có thể xảy ra.
Phương pháp PCR gen SPS đã được thử
nghiệm bởi ba nhà nghiên cứu sử dụng ADN bộ gen gạo và cho ra các kết quả thỏa
đáng; đặc biệt trong PCR định lượng, độ chệch thấp hơn 25 % trong dải động học
của phương pháp (tức là 0,05 ng đến 1,00 ng).
A.2.3.3 Thử nghiệm cộng
tác.
Dựng đường chuẫn bằng cách sử
dụng các mẫu ADN pha loãng liên tục do GMDL-SJTU chiết tách từ 4 giống gạo bằng
phương pháp PCR định lượng. Hiệu năng PCR của phương pháp PCR gen SPS từ 0,846
3 đến 1,223 3 được tính từ độ dốc của đường chuẩn là (10-1/a-1) x 100, trong
đó a là độ dốc, và độ tuyến tính (hệ số hồi quy,
) trung bình là 0,997.
Các kết quả của 8 mẫu ADN mù được báo
cáo trong Bảng A.5. Chúng được đánh giá dựa trên các tiêu chí chấp nhận phương
pháp và các yêu cầu tiến hành phương pháp, được thiết lập bởi mạng lưới các
phòng thử nghiệm GMO Châu Âu (ENGL) và được thông qua bởi Phòng thử nghiệm Chuẩn
Châu Âu về Thực phẩm và Thức ăn chăn nuôi GM (EU-RL GMFF) (Tài liệu tham khảo
[60]). Trong Bảng A.5, báo cáo ước lượng độ lặp lại và độ tái lập cho mỗi nồng
độ gạo, sau khi xác định và loại bỏ các số lạc bằng kiểm tra Cochran.
Bảng A.5 -
Các kết quả real-time PCR định lượng
Thông số
Các mẫu mù
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5 ng
1 ng
1 ng
2 ng
5 ng
5 ng
10 ng
Phòng thử nghiệm trả kết quả
12
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
12
12
12
12
12
12
Số mẫu/ phòng thử nghiệm
1
1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
1
1
1
1
Tổng số dữ liệu
108
108
108
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
108
108
108
108
Số kết quả bị loại trừ
4
2
0
8
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0
0
0
Lý do loại trừ
Kiểm tra
Cochran
Kiểm tra
Cochran
-
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Cochran
-
-
-
-
Giá trị trung bình
0,407 8
0,412 1
0,814 6
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,857 5
5,261 0
5,445 7
10,899 6
Độ lệch chuẩn lặp lại
0,058 3
0,071 9
0,143 5
0,111
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,936 4
1,142 7
1,867 7
Hệ số biến thiên lặp lại, %
14,29
17,44
17,62
15,11
18,10
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
20,98
17,15
Độ lệch chuẩn tái lập
0,130 2
0,061 8
0,249 6
0,092 7
0,201 3
0,810 9
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,617 5
Hệ số biến thiên tái lập, %
31,92
14,99
30,65
12,63
10,84
15,41
18,17
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Độ chệch, giá trị tuyệt đối
0,092 2
0,087 8
0,185 3
0,265 5
0,142 4
-0,261 0
-0,445 8
-0,889 6
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
-18,44
-17,57
-18,54
-26,53
-7,12
5,22
8,92
8,90
A.2.3.4 Chọn lọc
phân tử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các mồi và đoạn dò đích SPS có độ dài
ADN 81 bp được nêu ra trong Bảng A.6.
Bảng A.6 -
Trình tự oligonucleotit của các mồi và đoạn dò
Tên
Trình tự
ADN oligonucleotide ADN (5’ đến 3’)
Trình tự mồi và đoạn dò của
real-time PCR định lượng
Mồi xuôi SPS
TTgCgCCTgAACggATAT
Mồi ngược SPS
CggTTgATCTTTTCgggATg
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
HEX- TCCgAgCCgTCCgTgCgTC -TAMRA
A.2.3.4.2 Thực nghiệm
Các mẫu ADN chiết tách từ 11 mẫu thực
vật khác nhau (bao gồm gạo) được phân tích bằng phương pháp PCR gen SPS.
Trong số 11 mẫu, chỉ có mẫu ADN gạo cho các kết quả dương tính. Mười mẫu mẫu
khác (tre, có lông xanh, gạo mạch, gạo mì, kê vàng, cải dầu, cà chua, khoai
tây, đậu tương và Arabidopsis) cho các kết quả âm tính.
Các mẫu ADN chiết tách từ 12 giống gạo
khác nhau được phân tích bằng phương pháp PCR đặc hiệu được phát triển để phát
hiện gen SPS. Tất cả 12 mẫu đều cho các kết quả dương tính.
A.2.3.4.3 Lý thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò của gen SPS được đánh giá thông qua tìm kiếm sự tương đồng tại cơ sở dữ liệu
BLASTN 2.0MP-WashU programme (Tài liệu tham khảo [64], ngày tìm kiếm: 09-01-2010).
Trình tự 81 bp được sử dụng làm truy vấn là một phần trình tự của mã số tiếp cận
NCBI U33175 (nucleotit từ 1055-1135). Các kết quả tìm kiếm đã xác nhận sự đồng
dạng hoàn toàn của trình tự truy vấn với trình tự gen SPS của gạo, và không có
sự tương đồng với các gen khác và loài khác.
A.2.4 Nguyên
tắc
Đoạn 81 bp của gen SPS được khuếch đại
bằng cách sử dụng hai mồi đặc hiệu sps ở gạo. Đo sản phẩm PCR tích lũy cuối mỗi
chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu sps ở gạo được
đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang
và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang (xem Bảng A.6). Với mục đích đó,
hóa chất TaqMan®1) được sử dụng. Tín hiệu huỳnh quang được đo vượt
qua giá trị ngưỡng, được xác định bởi người phân tích sau một số chu kì nhất định,
số này được gọi là giá trị Ct. Để định lượng tổng số ADN sps ở gạo trong
mẫu chưa biết, giá trị Ct được chuyển đổi thành giá trị số bản sao tương ứng bằng
cách so sánh với đường chuẩn mà giá trị Ct liên kết trực tiếp với các số bản
sao đã biết (phân tích hồi quy).
A.2.5 Thuật
ngữ và định nghĩa
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.6 Số lượng
và loại mẫu
Các mẫu ADN chiết tách từ bốn giống gạo,
được sử dụng để dựng các đường chuẩn trong nghiên cứu cộng tác này. Sau đó, tám
mẫu mù được phân tích bằng cách sử dụng bốn đường chuẩn đã dựng.
Các phòng thử nghiệm tham gia đã nhận
các mẫu sau.
- 4 mẫu ADN từ các giống gạo khác nhau
(3M, giống Indica từ Hoa Kỳ; Balilla, giống Japonica từ Ý; Guangluai, giống
Indica từ Miền Nam Trung Quốc, và Shennong265, giống Japonica Trung Quốc), 50 ng/μl, mỗi mẫu 30
μl. ADN của mỗi giống gạo được pha loãng và sử dụng để dựng đường chuẩn tương ứng.
- 8 mẫu ADN mù từ 4 giống gạo khác
nhau có các nồng độ khác nhau (0 ng/μl đến ~ 50 ng/μl), mỗi mẫu 50 μl.
- Kiểm chứng âm ADN đích (dán nhãn N):
ADN tinh trùng cá hồi (20 ng/μl).
- Kiểm chứng dương ADN đích (dán nhãn P):
ADN bộ gen (20 ng/μl)
(Guangluai4). Tất cả các mẫu ADN được tinh sạch bằng phương pháp CTAB bởi
GMDL-SJTU. Kiểm soát các đích ADN âm tính và dương tính sử dụng cho mỗi khay PCR.
- Các mồi và đoạn dò của hệ thống PCR
gen SPS (xem Bảng A.6) và các thuốc thử phản ứng như sau:
- hỗn hợp gốc PCR (real-time) (1 ml x 6);
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.7 Giới hạn
định lượng (LOQ) và phạm vi áp dụng
Theo phương pháp, LOQ tuyệt đối của
phương pháp là 0,01 ng/μl. LOQ tương đối của PCR định lượng không được đánh giá
trong thử nghiệm cộng tác.
A.2.8 Ước
tính độ không đảm bảo đo
Công bố độ không đảm bảo đo chung của
phương pháp từ các kết quả của thử nghiệm cộng tác (xem Bảng A.5).
A.2.9 Các yếu
tố gây nhiễu
Quan trọng nhất đối với độ nhạy của
phương pháp là tổng
số và khả năng khuếch đại axit nucleic dùng làm khuôn mẫu cho real-time PCR.
Ngoài điểm tổng quát này, không có các yếu tố gây nhiễu cụ thể nào được nêu ra ở
phương pháp này.
A.2.10 Các
điều kiện vật lý và môi trường
Các quy trình yêu cầu điều kiện vô
trùng khi tiến hành công việc.
Duy trì chặt chẽ các khu vực làm việc
tách biệt để chiết tách ADN, chuẩn bị PCR và khuếch đại.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Để tránh ô nhiễm, cần sử dụng đầu hút
lọc (A.2.11.6) để ngăn ngừa khí dung.
Chỉ sử dụng găng tay không bột (A.2.11.8)
và thường xuyên
thay mới găng tay.
Làm sạch định kỳ thiết bị và bàn thí
nghiệm với dung dịch natri hypochlorit (10 % clo hoạt động).
Các pipet cần được hiệu chỉnh thường
xuyên, nếu cần.
A.2.11 Thiết
bị và dụng cụ
Thiết bị phòng thử nghiệm thông thường,
cụ thể như sau.
A.2.11.1 Máy li tâm.
A.2.11.2 Tủ đông, duy trì ở âm 20 °C và
tủ lạnh duy trì ở 4 °C.
A.2.11.3 Micropipet.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.11.5 Ống nghiệm, dung tích
0,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.
A.2.11.6 Đầu hút và đầu
hút lọc
cho micropipet.
A.2.11.7 Giá, để các ống
phản ứng.
A.2.11.8 Găng tay
vinyl hoặc latex.
A.2.11.9 Máy hút chân
không,
phù hợp để làm khô các hạt ADN, tùy chọn.
A.2.11.10 Hệ thống
real-time PCR
với các lọ nhựa phản ứng phù hợp để đo huỳnh quang.
A.2.11.11 Phần mềm: Hệ thống
phát hiện trình tự 1) phiên bản 1.7 (Applied Biosystems Part No
43118761)) hoặc các phiên bản tương đương.
A.2.11.12 Các khay phản
ứng quang học 96 giếng, MicroAmp® 1) (Applied
Biosystems Part No N801-05601)).
A.2.11.13 Miếng phủ quang học, MicroAmp®1)
(Applied Biosystems Part No 43119711)).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.12 Vật
liệu và thuốc thử
A.2.12.1 Yêu cầu chung
Trừ khi có quy định khác, chỉ sử dụng
thuốc thử phù hợp với các đặc điểm kỹ thuật của TCVN 7608 (ISO 24276) và dùng
nước cất hoặc nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
A.2.12.2 Chiết tách
ADN
A.2.12.2.1 Cetyltrimethylammonium
bromua
(CTAB), cấp độ siêu tinh khiết.
A.2.12.2.2 Tris-(hydroxymethyl)aminomethane
hydrochloride
(tris), cấp độ sinh học phân tử.
A.2.12.2.3 Muối
ethylenediaminetetraacetic acid disodium (EDTA), ít nhất 99,9
% phần khối lượng.
A.2.12.2.4 Etanol, φ[CH3CH2OH], ít nhất
96 % phần thể tích.
A.2.12.2.5 Isopropanol, φ[CH3CH(OH)CH3],
ít nhất 99,7 % phần thể tích.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.12.2.7 Natri clorua, w(NaCI), ít nhất
99 % phần khối lượng
A.2.12.2.8 Natri hydroxit, khan, w(NaOH),
ít nhất 98 % phần khối lượng.
A.2.12.2.9 Dung dịch
RNase A,
10 mg/ml.
A.2.12.2.10 Dung dịch
Proteinase K,
20 mg/ml.
A.2.12.2.11 Đệm pha
loãng:
tris (A.2.12.2.2), 10 mmol/l, pH 9,0.
A.2.12.2.12 Axit
clohydric,

A.2.12.2.13 ADN tinh
hoàn cá trích, ADN tuyến ức bê, hoặc Lambda ADN.
A.2.12.3 Real-time PCR
định lượng.
TaqMan®1) universal PCR
master mix (1x) hoặc tương đương phù hợp.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dung dịch ADN có thể được giữ ở 4 °C
trong tối đa 1 tuần, hoặc ở âm 20 °C để lưu trữ lâu hơn
(A.2.11.2). Để chuẩn bị cho real-time PCR định lượng, thuốc thử PCR phải được
rã đông ở 1 °C đến 4 °C trong đá lạnh.
A.2.14 Chuẩn
bị mẫu thử
Đảm bảo rằng mẫu thử nghiệm là đại diện
cho mẫu phòng thử nghiệm, ví dụ: bằng cách nghiền hoặc đồng nhất. Các bước đo
và thao tác được tiến hành như mô tả chi tiết trong TCVN 7606 (ISO 21571). Đối
với nghiên cứu cộng tác, tổng cộng 1 g mì gạo nghiền đã được sử dụng.
A.2.15 Hiệu
chuẩn thiết bị
Các thiết bị, ví dụ: máy chu trình nhiệt
và pipet phải được hiệu chuẩn, ví dụ: theo TCVN ISO/IEC 17025[61]
A.2.16 Các
bước phân tích
A.2.16.1 Yêu cầu chung
A.2.16.1.1 Chuẩn bị ADN
để dựng đường chuẩn
Mỗi mẫu ADN gạo có nồng độ 50 ng/μl được
pha loãng thành 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0,1 ng/μl, 0,01 ng/μl, 0,002 ng/μl sử dụng
dung dịch pha loãng ADN được cung cấp bởi tổ chức phát triển phương pháp và real-time
PCR dựng đường chuẩn bằng cách sử dụng 5 μl mỗi mẫu ADN pha loãng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.16.1.2 Thuốc thử PCR
A.2.16.1.3 Hỗn hợp gốc
PCR
Xem A.2.12.3
A.2.16.1.4 Mồi và đoạn
dò
Xem Bảng A.6.
A.2.16.2 Quy trình
A.2.16.2.1 Yêu cầu chung
Phương pháp PCR định lượng gen gạo SPS
có tổng thể tích hỗn hợp phản ứng là 25 μl.
Rã đông, trộn nhẹ nhàng và li tâm hỗn
hợp gốc real-time PCR định lượng và các mẫu ADN cần phải phân tích. Giữ các thuốc
thử rã đông ở nhiệt độ 1 °C đến 4 °C trong đá lạnh.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trộn nhẹ nhàng các ống PCR và li tâm
trong máy li tâm (A.2.11.1) ở 1000g trong 10 s.
Chạy PCR với điều kiện chu trình
real-time PCR định lượng.
A.2.16.2.2 Kiểm chứng
PCR
Xem A.2.6.
A.2.16.2.3 Chuẩn bị các
chuẩn
Dựng các đường chuẩn bằng cách vẽ các
giá trị Ct đối với logarit số lượng ADN đích, bằng nanogam. Thực hiện bằng cách
sử dụng bảng tính [ví dụ: Microsoft Excel] hoặc trực tiếp bằng các tùy chọn sẵn
có với phần mềm hệ thống phát hiện trình tự (A.2.11.11).
Khối lượng tính bằng nanogam, đo cho
các mẫu ADN chưa biết có được bằng phép nội suy từ đường chuẩn.
A.2.16.2.4 Chương trình
thời gian-nhiệt độ (PCR)
Phép thử PCR đã được tối ưu để sử dụng
cho hệ thống phát hiện trình tự ABI Prism®1) 7700 và hệ thống
real-time PCR Rotor Gene 3000A1) (A.2.11.10). Có thể sử dụng
các hệ thống phát hiện trình tự khác. Trong những trường hợp này, các điều kiện
có thể cần phải điều chỉnh. Chương trình thời gian- nhiệt độ cho real-time PCR
định lượng được nêu ra trong Bảng A.7.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
STT
Giai đoạn
T
°C
Thời gian
s
Tín hiệu
Chu kì
1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
95
900
Không
1 x
2
Khuếch đại
Biến tính
95
15
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
40 x
3
Gắn mồi và
kéo dài
60
45
Đo lường
A.2.16.2.5 Chấp nhận hoặc
từ chối các tiêu chí
A.2.16.2.5.1 Chấp nhận và
tiến hành các tiêu chuẩn mô tả trong Tài liệu tham khảo [60].
Sử dụng các yêu cầu tiến hành phương
pháp để đánh giá các kết
quả từ nghiên cứu cộng tác được nêu trong A.2.16.2.5.2 đến A.2.16.2.5.4.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.16.2.5.3 Hệ số biến
thiên của độ tái lập phải ở mức dưới 35 % nồng độ đích và trên toàn dải động học.
CV,R< 50 % được
chấp nhận khi nồng độ dưới 0,2 %.
A.2.16.2.5.4 Độ đúng cần nằm
trong khoảng ± 25 % giá trị chuẩn được chấp nhận trên toàn dải động học.
A.2.16.2.6 Xác định
Sử dụng đoạn dò TaqMan®1)
cho phép xác định chính xác các sản phẩm PCR.
A.2.17 Xác định
mẫu
Xem A.2.6.
A.2.18 Diễn
giải và tính toán các kết quả
Sau khi kết thúc real-time PCR định lượng,
định vị ngưỡng trong vùng có dữ liệu khuếch đại song song (giai đoạn PCR theo
hàm số mũ - kiểu logarit) và không có hiệu ứng chéo giữa các lần lặp lại của
cùng một mẫu. Xác định số chu kì mà tại đó ngưỡng đi qua đường cong khuếch đại
đầu tiên và thiết lập đường nền trước giá trị ngưỡng 3 chu kì. Xuất tất cả các
dữ liệu cho các tính toán tiếp theo.
Sau khi xác định một giá trị ngưỡng
trong giai đoạn khuếch đại logarit như mô tả trên, giá trị Ct của mỗi phản ứng
được tính toán bằng cách sử dụng phần mềm thiết bị. Dựng đường chuẩn theo các
giá trị Ct ở ngưỡng và
theo các giá trị logarit thập phân của lượng ADN khuôn mẫu ban đầu.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.19 Lưu
giữ hồ sơ
Lưu trữ hồ sơ phải phù hợp với các yêu
cầu của TCVN ISO/IEC 17025 [61].
A.2.20 Báo
cáo
Báo cáo phải tuân thủ các yêu cầu của
TCVN 7608 (ISO 24276) và TCVN ISO/IEC 17025 [61].
A.2.21 Các biện pháp
an toàn
Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608
(ISO 24276).
A.2.22 Ngăn ngừa ô
nhiễm và xử lý chất thải
Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608
(ISO 24276).
A.3 Phương pháp
đặc hiệu taxon đích để phát hiện các thành phần có nguồn gốc từ cà chua (Lycopersicon
esculentum)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Gen LAT52 mã hoá một protein giàu
cysteine, gắn cacbonhydrate, ổn định nhiệt, cần thiết cho sự phát triển của phấn
cà chua. Phương pháp phát hiện LAT52 phù hợp dùng làm gen nội chuẩn
trong việc xác định và định lượng cà chua GM (Tài liệu tham khảo [62]). Phòng
thử nghiệm Phát hiện GMO của Trường Đại học Tổng hợp Jiao Tong Thượng Hải
(GMDL-SJTU) đã tổ chức thử nghiệm cộng tác để xác nhận giá trị sử dụng của
phương pháp phát hiện gen LAT52 ở cà chua làm gen nội chuẩn cho phép
phân tích định lượng cà chua biến đổi gen (GM) hoặc không biến đổi gen
(non-GM). Nghiên cứu gồm 13 phòng thử nghiệm từ Mỹ, Singapore, Hàn Quốc,
Lithuania, Slovenia, Na Uy, Ý và Trung Quốc. Các kết quả có trong Tài liệu tham
khảo [63], Phụ lục 1 và 2.
Quy trình nghiên cứu cộng tác bao gồm
các mô-đun sau:
- Real-time PCR định lượng để dựng đường
chuẩn định lượng bằng cách sử dụng các mẫu ADN cà chua từ bốn giống cà chua
khác nhau.
- Real-time PCR định lượng để định lượng
các mẫu ADN cà chua làm mù bằng cách sử dụng các đường chuẩn đã được xây dựng.
Thử nghiệm vòng được thực hiện theo
các hướng dẫn được quốc tế chấp nhận, bao gồm:
- TCVN 6910 (ISO 5725)[51]-[56] được xem xét
đặc biệt liên quan đến độ chính xác (độ lặp lại và độ tái lập) và độ
đúng;
- Quy trình chính thức của IUPAC về
thiết kế, tiến hành và diễn giải các nghiên cứu hiệu năng phương pháp (Tài liệu
tham khảo [12]).
A.3.2 Phạm vi áp dụng
Phương pháp này dùng cho phát hiện ADN
cà chua bằng PCR định lượng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.3 Xác nhận giá
trị sử dụng của phương pháp và các tiêu chí thực hiện
A.3.3.1 Độ mạnh của
phương pháp
Độ mạnh của phương pháp real-time PCR
định lượng LAT52 đã được thử nghiệm bởi tổ chức phát triển phương pháp với
ba chương trình thời gian-nhiệt độ khác nhau (hai bước và ba bước; với ba nhiệt
độ gắn mồi khác nhau, gồm 58 °C, 59 °C và 60 °C), trên ba mẫu ADN khác nhau chứa
tổng số ADN cà chua biết trước (10 ng, 1 ng, 0,1 ng các mẫu ADN bộ gen cà chua
và mỗi mẫu lặp lại ba lần). Phương pháp real-time PCR định lượng có độ mạnh
mong muốn ở các chương trình thời gian-nhiệt độ và ở ba nồng độ mẫu ADN cà
chua.
Phương pháp PCR định lượng gen LAT52
cũng được thử nghiệm trên các thiết bị real-time PCR khác nhau
[Rotor gene 3000A,1) Corbett Research và ABI77001)], với
ba thể tích phản ứng khác nhau (20 μl, 25 μl, và 30 μl, và ba lần lặp lại trên
một thể tích). Các phương pháp real-time PCR định lượng cho thấy độ mạnh dự kiến
phù hợp khi sử dụng với các thiết bị real-time PCR khác nhau với các thể tích
phản ứng khác nhau.
A.3.3.2 Thử nghiệm nội
bộ
Gen LAT52 của cà chua đã được
xác nhận sử dụng làm gen nội chuẩn trong xác định và định lượng cà chua GM (Tài
liệu tham khảo [62]). Phương pháp PCR LAT52 cũng được thử nghiệm bởi ba
đơn vị của GMDL-SJTU sử dụng ADN bộ gen cà chua và có kết quả khả quan; đặc biệt
trong PCR định lượng, độ chệch thấp hơn 25 % trong toàn dải động học (tức là
0,05 ng đến 1,00 ng).
A.3.3.3 Thử nghiệm cộng
tác
Các kết quả thử nghiệm cộng tác được
tóm tắt và báo cáo trong Tài liệu tham khảo [63], Tóm lại, để chuẩn bị mẫu cho
nghiên cứu cộng tác, tất cả các mẫu ADN được chiết tách bằng GMDL-SJTU sử dụng
phương pháp CTAB được thông qua trong A.3 của TCVN 7606 (ISO 21571). Định lượng
quang phổ lượng ADN chiết tách được bằng phương pháp trong B.1 của TCVN 7606
(ISO 21571). Sau khi định lượng ADN, tiến hành phân tích real-time PCR định lượng
để cung cấp dữ liệu về sự ức chế PCR có thể xảy ra. Sau đó gửi đến mỗi phòng thử
nghiệm tham gia các mẫu ADN đã được chuẩn bị.
Dựng các đường chuẩn bằng cách sử dụng
các mẫu ADN pha loãng từ bốn giống hạt cả chua bằng phương pháp PCR định lượng:
hiệu suất PCR trung bình của phương pháp PCR gen LAT52 là 96,6 %, được tính từ
độ dốc của đường chuẩn là (10-1/a - 1) x 100, a là độ
dốc, và độ tuyến tính (hệ số hồi quy, Rc2) trung bình là
0,997.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng A.8 - Dữ
liệu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp real-time PCR gen LAT52
Thông số
Tổng số ADN
đích cà chua chưa biết
0,5 ng
0,05 ng
Zhongsu5
R144
Zaofeng
Lichun
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
R144
Zaofeng
Lichun
Số phòng thử nghiệm có kết quả
gửi trả
13
13
13
13
13
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
13
13
Số mẫu/ phòng thử nghiệm
4
4
4
4
4
4
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4
Dữ liệu bị loại trừ
2
5
4
4
5
8
7
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Lý do loại trừ
Dữ liệu
không nằm trong khoảng tin cậy 95 %
Giá trị trung bình
0,446 8
0,480 6
0,487 5
0,488 6
0,045 9
0,049 0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,045 7
Độ lệch chuẩn lặp lại
0,120
0,122
0,109
0,133
0,015
0,015
0,014
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hệ số biến thiên lặp lại, %
26,76
25,41
22,46
27,12
32,06
30,41
29,00
24,73
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,084
0,077
0,073
0,091
0,007
0,009
0,007
0,004
Hệ số biến thiên tái lập, %
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
15,99
15,04
18,68
15,00
18,61
14,21
8,65
Độ chệch, giá trị tuyệt đối
0,053
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,012
0,011
0,004
0,001
0,000
0,004
Độ chệch, %
10,64
3,88
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2,29
8,26
1,92
0,43
8,68
A.3.3.4 Chọn lọc phân
tử
A.3.3.4.1 Yêu cầu chung
Phương pháp này nhằm vào gen LAT52
có mặt ổn định với một bản sao đơn cho mỗi bộ gen đơn bội của các giống cà chua
khác nhau. Các mồi và đoạn dò đích của đoạn ADN LAT52 có độ dài 92bp được
nêu ra trong Bảng A.9.
Bảng A.9 -
Các trình tự mồi và đoạn dò oligonucleotit
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trình tự
ADN oligonucleotit (5’ đến 3’)
Trình tự mồi và đoạn dò real-time
PCR định lượng
Mồi F LAT52
AgACCACgAGAACgATATTTgC
Mồi R LAT52
TTCTTgCCTTTTCATATCCAgACA
Đoạn dò LAT52
HEX-CTCTTTgCAgTCCTCCCTTgggCT-BHQ
A.3.3.4.2 Thực nghiệm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các mẫu ADN chiết tách từ 12 giống cà
chua khác nhau có nguồn gốc địa lý và phát sinh loài khác nhau, ví dụ:
Shengnong 2, Jifan4, Zhongsu5, Yashu6, Jiafen1, Shenfeng2, Hongza9,
R144, Nongyou30, Dongnong70, Lichun và Zaokui đã được phân tích bằng PCR gen
LAT52 theo phương pháp đã được phát triển. Tất cả 12 mẫu đều cho kết quả dương
tính.
A.3.3.4.3 Lý thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của mồi và đoạn dò LAT52
được phân tích bằng cách tìm kiếm tương đồng bằng chương trình BLASTN
2.0MP-WashU (Tài liệu tham khảo [64], ngày tìm kiếm: 20-01-2010). Trình tự 92
bp của LAT52 được sử dụng làm chuỗi truy vấn là một phần của mã số tiếp cận
NCBI X15855 (nucleotit 1385-1476), và kết quả phân tích trên BLAST đã xác nhận
sự tương đồng hoàn toàn của trình tự truy vấn với các trình tự gen LAT52 đặc hiệu
bao phấn cà chua.
A.3.4 Nguyên tắc
Phương pháp này là một quy trình
real-time PCR định lượng sử dụng TaqMan®1) để định lượng trình tự
đích LAT52 ở cà chua. Định
lượng các sản phẩm PCR bằng tín hiệu huỳnh quang trong mỗi chu kì PCR bằng cách
sử dụng đoạn dò oligonucleotít đặc hiệu LAT52 đánh dấu với hai thuốc nhuộm
huỳnh quang: HEX là thuốc nhuộm phát
huỳnh quang ở đầu 5' và TAM RA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang ở đầu 3'. Giá
trị Ct được sử dụng để tính toán hàm lượng ADN cà chua, và giá trị Ct là chu kì ngưỡng với
tín hiệu huỳnh quang quan sát vượt qua một giá trị ngưỡng sau một số chu kì nhất
định.
Để định lượng số bản sao gen LAT52 ở cà chua trong mẫu
chưa biết, giá trị Ct của mẫu được xác định. Sử dụng bốn điểm chuẩn để dựng đường
chuẩn và tính số bản sao tương ứng của các mẫu phân tích ADN.
A.3.5 Thuật ngữ và
định nghĩa
Trong Điều này, áp dụng các thuật ngữ
và định nghĩa của TCVN 6910-1 (ISO 5725-1)[51] và TCVN 7608 (ISO
24276).
A.3.6 Số lượng và
loại mẫu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tám mẫu ADN cà chua chưa biết từ 4 giống
cà chua khác nhau với các nồng độ khác nhau (0 ng/μl đến 50 ng/μl) và các nồng
độ GM khác nhau được sử dụng, mỗi mẫu 50 μl.
A.3.7 Giới hạn phát
hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), phạm vi áp dụng
LOQ tuyệt đối của phương pháp PCR định
lượng là 0,01 ng mỗi phản ứng, tương ứng với khoảng 11 bản sao ADN bộ gen cà
chua đơn bội. LOD của phương pháp PCR định lượng không được đánh giá trong thử
nghiệm cộng tác.
A.3.8 Ước tính độ
không đảm bảo đo
Công bố độ không đảm bảo đo
chung của phương pháp từ các kết quả thử nghiệm cộng tác (xem A.3.3.3).
A.3.9 Các yếu tố gây nhiễu
Các mẫu ADN đã chuẩn bị phải được kiểm
tra các chất ức chế PCR trước khi phân tích PCR để tránh kết quả âm tính giả.
A.3.10 Các điều kiện
vật lý và môi trường
Các quy trình cần phải thực hiện trong
điều kiện vô trùng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bất kỳ ADN tồn dư cần phải loại bỏ khỏi
thiết bị trước khi sử dụng.
Để tránh ô nhiễm, sử dụng đầu hút lọc
(A.3.11.6) để bảo vệ khỏi khí dung.
Chỉ sử dụng găng tay không bột
(A.3.11.8) và thường xuyên thay mới.
Bàn thí nghiệm và thiết bị cần phải được
làm sạch định kỳ bằng dung dịch natri hypochlorite (Clo hoạt động 10 %) (thuốc
tẩy).
Pipet nên được kiểm tra độ chính xác
và thường xuyên hiệu chỉnh.
A.3.11 Thiết bị và dụng
cụ
Thiết bị thông thường phòng thử nghiệm,
cụ thể như sau.
A.3.11.1 Máy li tâm.
A.3.11.2 Tủ đông bảo quản ở
âm 20 °C và tủ lạnh duy trì ở 4 °C.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.11.4 Máy vortex.
A.3.11.5 Ống nghiệm, dung tích
0,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.
A.3.11.6 Đầu hút và đầu
hút lọc
cho micropipet.
A.3.11.7 Giá để các ống
phản ứng.
A.3.11.8 Găng tay
vinyl
hoặc latex.
A.3.11.9 Máy hút chân
không
phù hợp để làm khô hạt ADN, tùy chọn.
A.3.11.10 Thiết bị
real-time PCR.
A.3.11.11 Các ống phản ứng
real-time PCR
hoặc các giếng và các nắp quang học hoặc các miếng phủ quang học, nếu
phù hợp.
A.3.11.12 Phần mềm: Sequence
DeteCtion System1) phiên bản 1.7 (Applied Biosystems Part No 43118761))
hoặc các phiên bản tương đương.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trừ khi có quy định khác, chỉ sử dụng
thuốc thử phù hợp với các đặc điểm kỹ thuật của TCVN 7608 (ISO 24276) và chỉ sử
dụng nước cất vô trùng hoặc nước khử khoáng vô trùng hoặc nước có độ tinh khiết
tương đương.
A.3.12.1 Hỗn hợp gốc
real-time PCR
A.3.12.2 Oligonucleotit (mồi và đoạn
dò).
A.3.13 Thu thập mẫu,
vận chuyển, bảo quản và lưu mẫu
Các dung dịch ADN cần được bảo quản ở
nhiệt độ 4 °C trong thời gian tối đa một tuần hoặc ở âm 20 °C khi cần bảo quản
lâu hơn (A.3.11.2). Để chuẩn bị cho real-time PCR định lượng, thuốc thử PCR phải
được rã đông ở nhiệt độ 1 °C đến 4 °C trong đá lạnh.
A.3.14 Chuẩn bị mẫu
thử
Mẫu thử phải đại diện cho mẫu phòng thử nghiệm,
ví dụ: bằng cách nghiền hoặc đồng nhất các mẫu. Các phép đo và các bước tiến
hành cần được xem xét mô tả chi tiết trong TCVN 7606 (ISO 21571).
A.3.15 Hiệu chuẩn
thiết bị
Thiết bị, ví dụ: máy chu trình nhiệt
và pipet phải được hiệu chuẩn theo TCVN ISO/IEC 17025.[61]
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.16.1 Yêu cầu chung
A.3.16.1.1 Chuẩn bị ADN
để dựng đường chuẩn
ADN được chiết tách, định lượng và gửi
đến tất cả các phòng thử nghiệm tham gia như được nêu trong A.3.3.3.
Mỗi mẫu ADN cà chua có nồng độ 50 ng/μl
được pha loãng đến 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0,1 ng/μl, 0,01 ng/μl, 0,002 ng/μl bởi
0,1 x TE, tương ứng.
A.3.16.1.2 Thuốc thử PCR
A.3.16.1.3 Hỗn hợp gốc
real-time PCR
Xem A.3.12.
A.3.16.1.4 Mồi
Xem Bảng A.9.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.16.2.1 Yêu cầu chung
Chuẩn bị PCR cho PCR định lượng đích
là gen LAT52 ở cà chua được phát triển với tổng thể tích hỗn hợp phản ứng
25 μl.
Rã đông, trộn nhẹ nhàng và li tâm hỗn hợp
gốc real-time PCR định lượng và các mẫu ADN cần thiết để phân tích. Rã đông thuốc
thử ở nhiệt độ 1°C đến 4°C trong đá lạnh.
Phân phối 20 μl hỗn hợp gốc vào mỗi ống
phản ứng PCR 200 μl (A.3.11.7). Thêm 5 μl các mẫu dung dịch ADN, kiểm chứng
dương cà chua, kiểm chứng âm và kiểm chứng trắng (H2O) vào các ống
tương ứng.
Trộn dung dịch trong ống PCR nhẹ nhàng
và li tâm nhanh trong máy li tâm (A.3.11.1).
Đặt khay vào thiết bị.
Phân tích PCR với các điều kiện chu
trình real-time PCR định lượng được mô tả trong A.3.16.2.4.
A.3.16.2.2 Kiểm chứng
PCR
Kiểm chứng dương và kiểm chứng âm cần được
tiến hành theo TCVN 7608 (ISO 24276).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dựng các đường chuẩn bằng cách vẽ các
giá trị Ct đối với logarit tổng số ADN đích, bằng nanogam. Có thể được thực hiện
điều này bằng cách sử dụng bảng tính [ví dụ: Microsoft Excel1)], hoặc trực
tiếp bằng các tùy chọn sẵn có với phần mềm phát hiện trình tự (A.3.11.11).
Khối lượng tính bằng nanogam, đo cho mẫu
ADN chưa biết có được bằng phép nội suy từ đường chuẩn.
A.3.16.2.4 Chương trình
thời gian-nhiệt độ (PCR)
Phép thử PCR được tối ưu để sử dụng
cho hệ thống phát hiện trình tự ABI Prism®1) 7700 và hệ
thống real-time PCR Rotor Gene 3000A1) (A.3.11.10).
Các thiết bị khác có thể được sử dụng. Trong các trường hợp này, các điều kiện
chu trình nhiệt có thể phải điều chỉnh. Chương trình thời gian-nhiệt độ cho
real-time PCR định lượng được nêu ra trong Bảng A.10.
Bảng A.10 -
Chương trình thời gian-nhiệt độ real-time PCR định lượng
STT
Giai đoạn
T
°C
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
s
Tín hiệu
Chu kì
1
Biến tính và hoạt hóa ADN polymerase
95
900
Không
1 x
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khuếch đại
Biến tính
95
15
Không
40 x
3
Gắn mồi và kéo dài
60
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đo lường
A.3.16.2.5 Chấp nhận hoặc
từ chối các tiêu chí
A.3.16.2.5.1 Sử dụng các
yêu cầu tiến hành phương pháp để đánh giá các kết quả từ nghiên cứu cộng tác được
nêu trong A.3.16.2.5.2 đến A.3.16.2.5.4.
A.3.16.2.5.2 Dải động học
của phương pháp gồm ít nhất năm nồng độ đích có độ pha loãng 1/10. Nồng độ đích
cần được dự kiến là ngưỡng liên quan với yêu cầu luật pháp.
A.3.16.2.5.3 Hệ số biến
thiên của độ tái lập phải ở mức dưới 35 % nồng độ đích và trên toàn dải động học.
Cv.R< 50 % được chấp nhận khi nồng độ dưới 0,2 %.
A.3.16.2.5.4 Độ đúng cần
nằm trong khoảng ± 25 % giá trị chuẩn được chấp nhận trên toàn dải động.
A.3.16.2.6 Xác định
Sử dụng đoạn dò TaqMan®1)
cho phép xác định chính xác các sản phẩm PCR.
A.3.17 Xác định mẫu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.18 Diễn giải và
tính kết quả
Sau khi kết thúc real-time PCR định lượng,
xác định ngưỡng trong vùng có dữ liệu khuếch đại song song (giai đoạn PCR theo
hàm số mũ - kiểu logarit) và không có hiệu ứng chéo giữa các lần lặp lại của
cùng một mẫu. Xác định số chu kì mà tại đó ngưỡng đi qua đường cong khuếch đại
đầu tiên và thiết lập đường nền trước giá trị ngưỡng 3 chu kì. Xuất tất cả các
dữ liệu cho các tính toán tiếp theo.
Sau khi xác định một giá trị ngưỡng
trong giai đoạn khuếch đại logarit như mô tả trên, giá trị Ct của mỗi phản ứng
được tính toán bằng phần mềm thiết bị.
Dựng đường chuẩn theo các giá trị Ct ở
ngưỡng và các giá trị logarit thập phân của số lượng ADN khuôn mẫu ban đầu.
Sau đó, sử dụng các đường chuẩn để
tính toán hàm lượng ADN trong mẫu ADN chưa biết bằng cách nội suy từ các đường
chuẩn.
A.3.19 Lưu giữ hồ sơ
Lưu trữ hồ sơ phải phù hợp với các yêu
cầu của TCVN ISO/IEC 17025 [61].
A.3.20 Báo cáo
Báo cáo phải tuân thủ các yêu cầu của
TCVN 7608 (ISO 24276) và TCVN ISO/IEC
17025 [61]
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608
(ISO 24276).
A.3.22 Ngăn ngừa ô nhiễm
và xử lý chất thải
Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608
(ISO 24276).
Phụ
lục B
(Tham
khảo)
Các phương pháp sàng lọc
B.1 Phương pháp
sàng lọc để định lượng tương đối ADN promoter 35S ở đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử
dụng real-time PCR
B.1.1 Giới thiệu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các hạn chế, xem B.1.8.
B.1.2 Xác nhận giá
trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng
B.1.2.1 Yêu cầu
chung
Phương pháp được tối ưu cho mẫu chuẩn
được chứng nhận (CRM IRMM-410) 7) [18] gồm có bột đậu
tương khô chứa hỗn hợp đậu tương GTS 40-3-2 và đậu tương thông thường.
Đã kiểm tra độ tái lập của các phương
pháp mô tả trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng những mẫu chưa biết
(các mẫu được gắn nhãn từ SA đến SE, xem Bảng B.1) là các hỗn hợp
của các mẫu chuẩn kể trên [19]. Ngoài ra, các thực
phẩm thương mại sẵn có cũng đã được kiểm tra [20].
Số bản sao của mỗi trình tự đích trong
bộ gen chưa được đánh giá chi tiết [21],[22].
Phương pháp được công bố trong Tài liệu
tham khảo [23].
B.1.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Năm mẫu chưa biết chứa các nồng độ
trong khoảng từ 0,7 % đến 3 % (theo khối lượng) bột đậu tương khô có nguồn gốc
từ dòng GTS 40-3-2 được phân tích bởi 11 phòng thử nghiệm tham gia.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đối với tách chiết ADN, sử dụng quy
trình mô tả trong Tài liệu tham khảo [23]. Theo đó, ly giải 200 mg mẫu trong 1 ml guanidium
hydrochloride//đệm proteinase K (0,5 mol/l//0,8 mg/ml) ở 56°C trong 3 h. Sau bước
xử lý RNase, trộn 500 μl dịch chiết đã được làm trong với 1 ml hạt silica của
Wizard® 8) và thu hồi hạt
nhựa cùng ADN bám quanh bằng cách cho đi qua cột lọc Wizard® 8). Sau khi rửa
bằng isopropanol, tách rửa ADN ra khỏi nhựa silica trong 10 mmol/l đệm Tris pH 9,0 ở 70°C.
Nồng độ ADN được ước tính bằng đo OD ở bước sóng 260 nm và được điều chỉnh về
20 μg/ml. Để phân
tích PCR, 200 ng ADN từ mỗi mẫu đã được phân tích trong hai phản ứng độc lập.
Các mẫu được phân tích lặp lại hai lần.
Vì các mẫu gắn nhãn từ SA đến SE được trộn lẫn
với các mẫu chuẩn khác nhau, nên các kết quả thu được với các mẫu này không thể
được sử dụng cho việc đánh giá độ đúng của phương pháp real-time PCR được áp dụng.
Tuy nhiên, các kết quả có thể được
sử dụng cho đánh giá độ chính xác của phương pháp được áp dụng, theo đó các trường
hợp nêu trên phản ánh tình huống xấu
nhất dẫn đến một ước lượng thấp về độ chính xác của phương pháp real-time PCR
áp dụng[19].
Việc loại ra các phòng thử nghiệm dựa
trên thiết bị real-time PCR được sử dụng và dựa trên tính toán thống kê của các
giá trị số lạc. Phương pháp đã phát triển cho các máy chu trình
nhiệt khối. Do đó, hai phòng
thử nghiệm đang sử dụng một hệ thống LightCycler®8) đã bị loại trừ
trước khi tính toán các giá trị
số lạc. Lý do cho sự loại trừ loại máy PCR cụ thể là việc quan sát cho thấy rằng
phương pháp được áp dụng cần được điều chỉnh thích hợp và tối ưu hóa cẩn thận nếu chạy
trên thiết bị real-time PCR khác với các thiết bị đã được quy định cụ thể trong
phương pháp này. Ngoài ra, các phòng thử nghiệm được giữ lại được kiểm tra các
giá trị số lạc theo Grubbs [24]. Tuy nhiên, không xác định được giá trị số lạc nào. Chi
tiết về các thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng B.1.
Bảng B.1 - Dữ
liệu xác nhận giá trị sử dụng để phát hiện GMO đặc hiệu
promoter-35S
Mẫu
SA
SB
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
SD
SE
Năm thử nghiệm liên phòng
1999
1999
1999
1999
1999
Số phòng thử nghiệm báo cáo kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
11
11
11
11
Số mẫu cho mỗi phòng thử nghiệm
1
1
1
1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số phòng thử nghiệm bị loại trừ
2
2
2
2
2
Số phòng thử nghiệm được giữ lại
9
9
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9
9
Số mẫu đã được chấp nhận
9
9
9
9
9
Giá trị dự kiến (% GMO)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,8
3
0,7
1
Giá trị trung bình (% GMO)
1,63
1,76
4,04
0,88
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giá trị trung vị (% GMO)
1,62
1,70
3,46
1,00
1,60
Độ lệch chuẩn tái lập SR (% GMO)
0,28
0,39
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,21
0,35
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)
17
22
34
24
20
Giới hạn tái lập R(R =
2,8 SR)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,08
3,82
0,58
0,97
Ngoài ra, bốn mẫu thực phẩm thương mại
có sẵn chưa biết chứa khoảng 0,3 % và 36 % (theo khối lượng) (các giá trị trung
bình) của đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 đã được phân tích bởi bốn đơn vị
tham gia. Phương pháp phát hiện đặc hiệu promoter-35S cho kết quả với độ lệch
chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 17 % đến 28 %[20].
B. 1.2.3 Đặc hiệu phân
tử
B.1.2.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp này được thiết kế dựa vào
một trình tự được mô tả tại cơ sở dữ liệu GenBank®9) với mã số tiếp
cận V00141.
Danh mục cây trồng biến đổi gen chứa
promoter-35S của CaMV được cung cấp trong Tài liệu tham khảo [25].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Để phân biệt giữa mẫu bị nhiễm virút
và mẫu biến đổi gen, có thể sử dụng các phương pháp để phát hiện virút khảm súp
lơ[28].
B.1.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ 9)
bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit như chuỗi truy vấn với chương trình
BLASTN 2.2.3 9) [ngày 24 tháng tư năm 2002]. Kết quả của việc tìm kiếm
xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.
B.1.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
Tính đặc hiệu thực nghiệm của phương
pháp đã được đánh giá bằng phân tích CRM IRMM-410 từ bột đậu tương khô IRMM chứa
từ 0 % đến 5 % đậu tương dòng GTS 40-3-2 và các mẫu chuẩn từ Hiệp hội Quốc tế
Nghiên cứu Thực phẩm Leatherhead 9) gồm bột đậu tương chưa tách dầu (Lot
No.2/99-01) chứa 0 %, 0,3 %, 1,25 % và 2 % đậu tương GTS 40-3-2, tương ứng.
Các nền mẫu thực phẩm thương mại đã được
thử nghiệm là bột đậu tương, protein tách chiết từ đậu tương, thực phẩm tổng hợp
chứa bột đậu tương và protein đậu tương.
B.1.2.4 Tối ưu hóa
Tối ưu hóa được thực hiện trên hệ thống
phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM® 7700 9) sử dụng hóa
chất TaqMan®9)
Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực
hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express® (Applied Biosystems)9).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Vì là phương pháp định lượng, nên LOD
đã không được đánh giá cụ thể. LOD dự kiến là tốt hơn hoặc bằng với giới hạn định
lượng; ví dụ 50 bản sao bộ gen của đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000 bản
sao bộ gen của đậu tương thông thường.
B.1.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
LOQ đã được đánh giá bằng cách đo các
dãy pha loãng ADN đích
theo Tài liệu tham khảo [20],
Theo các phòng thử nghiệm phân tích,
LOQ là 50 bản sao gen đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000 bản sao bộ gen
đậu tương thông thường. Đối với giá trị 1C, xem Tài liệu tham khảo [20]. Điều này cho
ước lượng LOQ tương đối là 0,06 (= 50 bản sao/82 000 bản sao x 100 %).
Các nồng độ được kiểm tra trong thử
nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng B.1.
CHÚ THÍCH: Số lượng bản sao không được
xác định trong thử nghiệm cộng tác.
B.1.3 Điều chỉnh
Chưa có thông tin cụ thể.
B.1.4 Nguyên tắc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đoạn ADN có chiều dài 81 bp của trình
tự gen lectin đậu tương được khuếch đại bằng PCR trong một phản ứng real time
PCR riêng biệt sử dụng hai mồi đặc hiệu gen lectin đậu tương, và các sản phẩm
PCR được đo qua mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan® đặc hiệu gen lectin
ở đậu tương 10).
Phép định lượng được thực hiện bằng
cách sử dụng hoặc phương pháp ΔΔCt hoặc phương pháp đường chuẩn kép (xem
B.1.9).
B.1.5 Thuốc thử
B. 1.5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử được
sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
B.1.5.2 Nước
B.1.5.3 Đệm PCR
(không bao gồm MgCl2), 10 x
B.1.5.4 Dung dịch
MgCl2, c(MgCl2) = 25 mmol/l
B.1.5.5 Dung dịch dNTP, c(dNTP)
= 2,5 mmol/l (mỗi loại)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chi tiết của các oligonucleotit được
liệt kê trong Bảng B.2.
Bảng B.2 -
Các oligonucleotit
Tên
Trình tự
ADN oligonucleotit
Nồng độ cuối
trong PCR
Trình tự đích gen đối
chứng
Lectin- F
5’-TCC ACC CCC ATC CAC ATT T-3'
900 nmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5'-ggC ATA gAA ggT gAA gTT gAA
ggA-3'
900 nmol/l
Lectin- TMP
5'-FAM-AAC Cgg TAg CgT TgC CAg CTT
Cg-TAMRA-3'a
100 nmol/l
Trình tự đích GMO
35S-F
5'-gCC TCT gCC gAC AgT ggT-3'
900 nmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5’-AAg ACg Tgg TTg gAA CgT CTT C-3’
900 nmol/l
35S-TMP
5’-FAM-CAA AgA Tgg ACC CCC ACC CAC
g-TAMRA-3’a
100 nmol/l
a FAM:
6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.
Chiều dài sản phẩm PCR của gen lectin
là 81 bp; chiều dài sản phẩm PCR gen 35S là 82 bp.
B.1.5.7 Enzym ADN
Polymerase chịu nhiệt
Enzym ADN Polymerase của AmpliTaq Gold®11)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.1.6 Thiết bị, dụng
cụ
B.1.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
B.1.6.2 Máy chu trình
nhiệt
Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được
thử nghiệm ban đầu với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700
SDS và GeneAmp® 5700 SDS (Applied Biosystems)11). Các hệ
thống phát hiện real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp
các điều kiện phản ứng.
B.1.6.3 Các ống phản ứng
Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch
đại PCR cho từng máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96-giếng
ABI PRISM®, hoặc các nắp quang học MicroAmp® (8 nắp ống/dải, phẳng)
(Applied Biosystems)11).
B.1.7 Cách tiến hành:
Chuẩn bị PCR
B.1.7.1 Yêu cầu chung
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh
quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.
Phương pháp được quy định cho tổng thể
tích PCR 50 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với các thành phần như được liệt kê
trong Bảng B.3.
Bảng B.3 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng
Trình tự đích gen đối
chứng
Tổng thể tích
50 μl
Khuôn ADN (lượng lớn nhất 200 ng)
10 μl
ADN polymerase
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,25 U
Hệ thống khử nhiễm
dUTP
400 μmol/l
AmpErase® uracil N-glycosylase
0,5 U
Đệm phản ứng
Đệm A của TaqMan® (chứa
chuẩn thụ động ROX)a
1 x
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
MgCl2
5 mmol/l
Mồi
Lectin-F và Lectin-R (xem Bảng B.2)
Xem Bảng B.2
dNTP
dATP, dCTP, dGTP
200 μmol/l mỗi loại
Đoạn dò
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
xem Bảng B.2
Trình tự đích GMO
Tổng thể tích
50 μl
Khuôn ADN (lượng lớn nhất 200 ng)
10 μl
ADN polymerase
AmpliTaq Gold™
1,25 U
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
dUTP
400 μmol/l
AmpErase® uracil
N-glycosylase
0,5 U
Đệm phản ứng
Đệm A của TaqMan® (chứa
chuẩn thụ động ROX)a
1 x
MgCl2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mồi
35S-F và 35S-R (xem Bảng B.2)
Xem Bảng B.2
dNTP
dATP, dCTP, dGTP
200 μmol/l mỗi loại
Đoạn dò
35S-TMP (xem Bảng B.2)
xem Bảng B.2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.1.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Các mẫu chuẩn được chứng nhận GTS
40-3-2 (vật liệu chứa từ 0,1 % đến 5 % đậu tương biến đổi gen) được sản xuất bởi
IRMM, Geel, Bỉ (dãy IRMM-410)12) có thể sử dụng làm kiểm chứng dương
và làm vật liệu so
sánh chuẩn [18].
Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần
bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
B.1.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ như được
nêu trong Bảng B.4 đã được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI
PRISM® 7700 (Applied Biosystems) 12). Trong nghiên cứu xác
nhận giá trị sử dụng, chương trình được sử dụng kết hợp với ADN polymerase của
AmpliTaq Gold® 12). Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể
yêu cầu những điều chỉnh thích hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu
phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.
Bảng B.4 mô tả các điều kiện phản ứng.
Bảng B.4 -
Quy trình thực hiện: Các điều kiện phản ứng
Thời gian, s
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tiền PCR: khử nhiễm
120
50
Tiền PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính khuôn mẫu ADN
600
95
PCR (45 chu trình)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Biến tính
15
95
Bước 2
Gắn mồi và kéo dài
60
60
B.1.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
Vì các GMO khác với dòng đậu tương GTS
40-3-2 cũng chứa các trình tự ADN promoter 35S, nên phương pháp này chỉ phù hợp
cho định lượng ADN GTS 40-3-2 khi không có mặt các GMO khác. Trong tất cả các
trường hợp khác, phương pháp này chỉ có thể được áp dụng cho các mục đích sàng lọc
và kiểm soát.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH: Nếu chế biến thực phẩm dẫn đến sự
phân hủy hoặc loại bỏ ADN (ví dụ:
dầu đậu tương tinh luyện, các lecithin đậu tương tinh luyện) thì phương pháp
này không cho các kết quả đáng tin cậy.
B.1.9 Hiệu chuẩn
và tính kết quả
Sau khi xác định một giá trị ngưỡng
(ví dụ: giá trị trong khoảng 0,01 đến 0,1 của thuốc nhuộm phát huỳnh quang được
chuẩn hóa (Rn)), hệ thống phát hiện trình tự tính toán các giá trị Ct (chu kì
ngưỡng) cho mỗi PCR (phương pháp ΔΔCt). Sự khác biệt giữa các giá trị Ct đặc hiệu
lectin và các giá trị Ct đặc hiệu 35S của các mẫu (ΔCt,sam) và của các
mẫu chuẩn (ΔCt,ref) được tính
toán. Lượng tương đối của ADN 35S trong mẫu, w, theo phần trăm, có liên
quan chặt với mẫu chuẩn được tính theo (B.1).
w = 2 - (ΔCt,sam - ΔCt,ref) x cref
(B.1)
Trong đó cref là nồng độ của
mẫu chuẩn (mẫu đối chứng).
Cách khác, một đường chuẩn được tính
(log [c] đối với Ct) bằng hệ thống phát hiện trình tự dựa trên các chuẩn
là các hỗn hợp GMO có nồng độ đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 xác định
(ví dụ: 0,1 %; 0,5 %, 1 %, 2 % và 5 %) hoặc các chuẩn là các pha loãng thích hợp
của các dung dịch kiểm tra thu được từ các hỗn hợp GMO có nồng độ GTS 40-3-2
xác định (ví dụ: 5 %) (phương pháp đường chuẩn kép). Đường chuẩn này được sử dụng
để xác định nồng độ dòng GTS 40-3-2 của các mẫu chưa biết. Vì ADN mẫu có thể bị
phân hủy do quá trình chế biến thực phẩm hoặc vì mẫu có thể chứa các thành phần
khác với đậu tương, nồng độ GTS 40-3-2 cần tính phải được chuẩn hoá với tổng số
ADN đậu tương có thể khuếch đại có trong mẫu. Tổng số ADN đậu tương có trong mẫu
được xác định bằng phương pháp real-time PCR đặc hiệu gen lectin đậu tương qua
việc sử dụng các hỗn hợp ADN chuẩn có nồng độ ADN đậu tương xác định [ví dụ 100
% (theo khối lượng), 50 % (theo khối lượng), 25 % (theo khối lượng), 10 % (theo
khối lượng) và 1 % (theo khối lượng)]. Hỗn hợp ADN chuẩn có nồng độ ADN đậu
tương ở trên được chuẩn bị bằng cách pha loãng ADN đậu tương từ dãy IRMM 410 với
ADN mang thích hợp. Để chuẩn hóa, chia lượng ADN của GTS 40-3-2 đo được cho lượng
ADN đo được của đậu tương.
Để tính kết quả của quy trình thay thế
này, điều quan trọng là lượng tuyệt đối của ADN khuôn (ng) là như nhau cho mỗi
PCR được sử dụng trong hiệu chuẩn.
Một quy trình thực hiện thay thế khác được mô
tả trong C.2.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phụ lục C
(Tham khảo)
Các phương
pháp đặc hiệu cấu trúc
C.1 Phương pháp
đặc hiệu cấu trúc để định lượng ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử dụng real-time
PCR (phương pháp 1)
C.1.1 Giới thiệu
Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại
đặc hiệu và phát hiện một gen đậu tương đặc hiệu taxon (gen lectin, Ie1)
và phát hiện ADN có nguồn gốc từ cấu trúc gen đặc hiệu có mặt trong đậu tương
biến đổi gen dòng GTS 40-3-2. Phương pháp này thích hợp để định lượng tổng số ADN có
nguồn gốc từ đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 trong thành phần đậu tương
chứa đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 (Roundup Ready®13)).
Các hạn chế, xem C.1.7.
C.1.2 Xác nhận giá
trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng
C.1.2.1 Yêu cầu chung
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đã kiểm tra độ tái lập của các phương
pháp mô tả trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết (từ
SA đến SE, xem Bảng C.1) là các hỗn hợp của các mẫu chuẩn đã đề cập ở trên [19]. Ngoài ra,
các thực phẩm thương mại sẵn có đã được kiểm tra [20].
Các số bản sao của mỗi trình tự đích
trong bộ gen chưa được đánh giá chi tiết [21],[22].
Phương pháp được công bố trong Tài liệu
tham khảo [23].
C.1.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Năm mẫu chưa biết chứa các nồng độ
trong khoảng 0,7 % và 3 % (theo khối lượng) bột đậu tương khô có nguồn gốc từ
dòng GTS 40-3-2 được phân tích bởi 11 phòng thử nghiệm tham gia.
Phương pháp phát hiện đặc hiệu cấu
trúc GTS 40-3-2 có kết quả độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 16 % đến
28 % (xem Bảng C.1). Trong các thí nghiệm ban đầu của thử nghiệm cộng tác, đã
xác định đậu tương CRM 1 % không nhất quán với giá trị cho trước.
Các nghiên cứu công bố các mẫu chuẩn
khác nhau được sản xuất sử dụng các quy trình thực hiện khác nhau tại các thời
điểm khác nhau, có sự phân hủy ADN ở các mức độ khác nhau. Các đơn vị tham gia
thử nghiệm cộng tác được
khuyến cáo trong suốt quy trình thử nghiệm cộng tác cần sử dụng CRM 2 % và pha
loãng ADN để có được một dung dịch ADN đối chứng 1% dùng trong định lượng.
Đối với tách chiết ADN, sử dụng quy
trình mô tả trong Tài liệu tham khảo [23], Theo đó, ly giải 200 mg mẫu trong 1
ml guanidium hydrochloride//đệm proteinase K (0,5 mol/l//0,8 mg/ml) ở 56 °C
trong 3 h. Sau bước xử lý RNase, trộn 500 μl dịch chiết đã được làm trong với 1
ml hạt silica của Wizard® 14) và thu hồi hạt
nhựa có ADN bám quanh bằng cách cho đi qua một cột lọc Wizard ® 14).
Sau khi rửa bằng isopropanol, tách rửa ADN ra khỏi nhựa silica trong 10 mmol/l
đệm Tris pH 9,0 ở 70 °C. Nồng độ ADN được ước tính bằng cách đo OD ở bước sóng
260 nm và được điều chỉnh về 20 μg/ml. Để phân tích PCR, 200 ng ADN từ mỗi mẫu
đã được phân tích trong hai phản ứng độc lập.
Các mẫu được phân tích lặp lại hai lần.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Việc loại ra các phòng thử nghiệm được
dựa trên các thiết bị real-time PCR sử dụng và dựa trên tính toán thống
kê của các giá trị số lạc. Phương pháp đã được phát triển cho các máy chu trình
nhiệt khối. Do đó, hai phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống LightCycler® 14) (Roche
Diagnostics) bị loại trừ trước khi tính toán các giá trị số lạc. Lý do loại trừ
một thiết bị PCR cụ thể là do quan sát
thấy phương pháp cần điều chỉnh phù hợp và tối ưu hóa cẩn thận nếu chạy trên
thiết bị real-time PCR khác với các thiết bị PCR được quy định trong phương
pháp này. Các phòng thử nghiệm giữ lại được kiểm tra thêm về các số lạc theo
Grubbs [24]. Các chi tiết
của thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.1.
Bảng C.1 - Dữ
liệu xác nhận giá trị sử dụng để phát hiện GMO đặc hiệu promoter-35S
Mẫu
SA
SB
SC
SD
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Năm thử nghiệm liên phòng
1999
1999
1999
1999
1999
Số lượng phòng thử nghiệm báo cáo kết
quả
11
11
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
11
11
Số lượng mẫu cho mỗi phòng thử nghiệm
1
1
1
1
1
Số lượng phòng thử nghiệm bị loại trừ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2
3
3
3
Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại
8
9
8
8
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số mẫu đã được chấp nhận
8
9
8
8
8
Giá trị dự kiến (% GMO)
1,4
1,8
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,7
1
Giá trị trung bình (% GMO)
1,7
1,89
3,65
0,86
1,58
Giá trị trung vị (% GMO)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,90
3,68
0,85
1,49
Độ lệch chuẩn tái lập SR
(% GMO)
0,27
0,53
0,57
0,15
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Độ lệch chuấn tương đối tái lập (%)
16
28
16
17
24
Giới hạn tái lập R (R = 2,8 SR)
0,77
1,48
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,42
1,06
Ngoài ra, bốn mẫu thực phẩm thương mại
có sẵn chưa biết chứa khoảng 0,3 % và 36 % (theo khối lượng) (các giá trị trung
bình) đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 đã được phân tích bởi bốn đơn vị
tham gia. Phương pháp phát hiện đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 cho kết quả với độ
lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 23 % đến 36 % [20].
C.1.2.3 Đặc hiệu phân
tử
C.1.2.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp này được thiết kế dựa vào
một trình tự được mô tả tại cơ sở dữ liệu GenBank® 15), mã số tiếp
cận AX033493.
C.1.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ15) bằng
cách sử dụng các trình tự nucleotit như chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN
2.2.315) [ngày 24, tháng tư, 2002], Kết quả của việc tìm kiếm xác nhận
một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.
C.1.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các nền mẫu thực phẩm thương mại đã được
thử nghiệm là bột đậu tương, protein tách chiết từ đậu tương, thực phẩm tổng hợp
chứa bột đậu tương và protein đậu tương.
C.1.2.4 Tối ưu hóa
Tối ưu hóa được thực hiện trên hệ thống
phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM® 770015) sử dụng hóa
chất TaqMan®15).
Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực
hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express® (Applied Biosystems)15).
C.1.2.5 Giới hạn
phát hiện
(LOD)
Vì là phương pháp định lượng nên giới
hạn phát hiện không được đánh giá cụ thể. Giới hạn phát hiện được dự kiến tốt
hơn hoặc bằng giới hạn định lượng; ví dụ: 50 bản sao bộ gen của đậu tương dòng
GTS 40-3-2 trong 82 000 bản sao bộ gen của đậu tương thông thường.
C.1.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
Giới hạn định lượng được đánh giá bằng
cách đo dãy pha loãng ADN đích theo Tài liệu tham khảo [20].
Theo các phòng thử nghiệm phân tích,
giới hạn định lượng là 50 bản sao bộ gen đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000
bản sao bộ gen đậu tương thông thường. Đối với giá trị 1C, xem Tài liệu tham khảo
[20],
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các nồng độ được kiểm tra trong thử
nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.1
CHÚ THÍCH: Số lượng bản
sao không được xác định trong thử nghiệm cộng tác.
C.1.3 Điều chỉnh
Chưa có thông tin cụ thể.
C.1.4 Nguyên tắc
Đoạn gen chuyển có chiều dài 83 bp được
sử dụng cho cấu trúc dòng đậu tương GTS 40-3-2 được khuếch đại bằng PCR sử dụng
hai mồi đặc hiệu cho gen CTP từ Petunia hybrids (RRS-F, xem Bảng C.2) và đặc
hiệu cho promoter-35S (RRS-R, xem Bảng C.2). Các sản phẩm PCR được đo trong mỗi
chu trình PCR (real-time) bằng một đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu cho vùng nối
giữa gen CTP và promoter-35S (RRS-TMP, xem Bảng C.2). Đoạn dò oligonucleotit
này được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh
quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất
TaqMan® 16) được sử dụng.
Đoạn trình tự gen lectin đậu tương có
chiều dài 81 bp được khuếch đại bằng PCR trong một phản ứng real-time PCR riêng
biệt sử dụng hai mồi đặc hiệu gen lectin đậu tương và các sản phẩm PCR được đo
qua mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan® 16) đặc hiệu gen
lectin đậu tương (Lectin-TMP, xem Bảng C.2).
Phép định lượng được thực hiện bằng
cách sử dụng hoặc phương pháp ΔΔCt hoặc phương pháp đường chuẩn kép (xem C.1.8).
C.1.5 Thuốc thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đối với chất lượng của thuốc thử đã được
sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
C.1.5.2 Nước.
C.1.5.3 Đệm PCR
(không có MgCl2), 10 x
C.1.5.4 Dung dịch
MgCl2, c(MgCl2) = 25
mmol/l.
C.1.5.5 Dung dịch
dNTP,
c(dNTP) = 2,5 mmol/l (mỗi loại).
C.1.5.6 Các
oligonucleotit
Chi tiết của các oligonucleotit được
liệt kê trong Bảng C.2.
Bảng C.2 -
Các oligonucleotit
Tên
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nồng độ cuối
trong PCR
Trình tự đích gen đối chứng
Lectin-F
5’-TCC ACC CCC ATC CAC ATT T-3'
900 nmol/l
Lectin-R
5'-ggC ATA gAA ggT gAA gTT gAA
ggA-3’
900 nmol/l
Lectin-TMP
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
100 nmol/l
Trình tự đích GMO
RRS-F
5'-gCC ATg TTg TTA ATT TgT gCC AT-3’
900 nmol/l
RRS-R
5'-gAA gTT CAT TTC ATT Tgg AgA ggA
C-3'
900 nmol/l
RRS-TMP
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
100 nmol/l
a FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA:
6-carboxytetramethylrhodamine.
Chiều dài sản phẩm PCR của gen lectin
là 81 bp; chiều dài sản phẩm PCR của gen RRS là 83 bp.
C.1.5.7 Enzym ADN
Polymerase chịu nhiệt
Enzym ADN polymerase của AmpliTaq Gold® 17).
C.1.5.8 Uracil N-glycosylase (tùy chọn).
C.1.6 Thiết bị, dụng
cụ
C.1.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được
thử nghiệm đầu tiên với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700
SDS 17) và GeneAmp® 5700 SDS (Applied Biosystems) 17).
Các hệ thống phát hiện realtime PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh
phù hợp với các điều kiện phản ứng.
C.1.6.3 Các ống phản ứng
Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch
đại PCR cho từng máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng
ABI PRISM®, hoặc các nắp quang học MicroAmp® (8 nắp ống/dải,
phẳng) (Applied Biosystems) 17).
C.1.6.4 Cách tiến
hành: Chuẩn bị PCR
Chuẩn bị PCR cho trình tự đích gen đối
chứng và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt.
Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa
được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.
Phương pháp quy định tổng thể tích PCR
50 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với các thành phần như được liệt kê trong Bảng
C.3.
Bảng C.3 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng
Trình tự đích gen đối
chứng
Tổng thể tích
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
ADN khuôn (lượng lớn nhất 200 ng)
10 μl
ADN Polymerase
AmpliTaq Gold ®
1,25 U
Phương pháp khử nhiễm
dUTP
AmpErase uracil N-glycosylase
400 μmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đệm phản ứng
Đệm A của TaqMan® (chứa
chuẩn thụ động ROX)a
1 x
MgCl2
5 mmol/l
Mồi
Lectin-F và Lectin-R (xem Bảng C.2)
Xem Bảng
C.2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
dATP, dCTP, dGTP
200 μmol/l mỗi
loại
Đoạn dò
Lectin-TMP (xem Bảng C.2)
xem Bảng
C.2
Trình tự đích GMO
Tổng thể tích
50 μl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10 μl
ADN Polymerase
AmpliTaq Gold ®
1,25 U
Phương pháp khử nhiễm
dUTP
AmpErase uracil N-glycosylase
400 gmol/l
0,5 U
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đệm A của TaqMan® (chứa
chuẩn thụ động ROX)a
1 x
MgCl2
5 mmol/l
Mồi
RRS-F và RRS-R (xem Bảng C.2)
Xem Bảng
C.2
dNTP
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
200 μmol/l mỗi
loại
Đoạn dò
RRS-TMP (xem Bảng C.2)
xem Bảng
C.2
a ROX =
carboxy-X-rhodamine.
C.1.6.5 Các kiểm chứng
PCR
Các mẫu chuẩn được chứng nhận GTS
40-3-2 (vật liệu có chứa 0,1 % đến 5 % đậu tương biến đổi gen) được
sản xuất bởi IRMM, Geel, Bỉ (dãy IRMM 110 18)) có thể được sử dụng
làm kiểm chứng dương và làm vật liệu so sánh chuẩn [18].
Các kiểm chứng thích hợp
bất kỳ khác cần bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
C.1.6.6 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng C.4 mô tả các điều kiện phản ứng.
Bảng C.4 -
Quy trình thực hiện: Các điều kiện phản ứng
Thời gian s
Nhiệt độ °C
Tiền-PCR: khử nhiễm
120
50
Tiền-PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính khuôn ADN
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
95
PCR (45 chu trình)
Bước 1
Biến tính
15
95
Bước 2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
60
60
C.1.7 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
Vì các GMO khác với dòng đậu tương GTS
40-3-2 có thể chứa một phần của gen chuyển được sử dụng để tạo dòng đậu tương
GTS 40-3-2, đặc biệt promoter-35S, trình tự CTP từ Petunia hybrida và
vùng nối đặc hiệu giữa hai yếu tố gen này, nên phương pháp này thích hợp cho định
lượng ADN GTS 40-3-2 khi không có mặt GMO khác, như đã được nêu cụ thể ở trên.
Phương pháp này thích hợp để đo tỉ lệ
giữa ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 với ADN đậu tương. Tỉ lệ này phản ánh lượng
đậu tương GTS 40-3-2 trong thành phần đậu tương của thực phẩm nghiên cứu.
Nếu tổng số thành phần đậu tương ít
hơn 5 % trong thực phẩm nghiên cứu, hàm lượng 1 % đậu tương GTS 40-3-2 không chắc
xác định được.
CHÚ THÍCH: Nếu quá trình chế biến thực
phẩm dẫn đến sự phân hủy hoặc loại bỏ
ADN (ví dụ: dầu đậu tương tinh luyện các lecithin đậu tương tinh luyện) thì
phương pháp này không cho các kết quả đáng tin cậy.
C.1.8 Hiệu chuẩn
và tính kết quả
Sau khi xác định một giá trị ngưỡng
(ví dụ: giá trị trong khoảng 0,01 đến 0,1 của thuốc nhuộm phát huỳnh quang được
chuẩn hóa (Rn)), hệ thống phát hiện trình tự tính toán các giá trị Ct (chu kì
ngưỡng) cho mỗi PCR (phương pháp ΔΔCt). Sự khác biệt giữa các giá trị Ct đặc hiệu
lectin và các giá trị Ct đặc hiệu RRS của các mẫu (ΔCt,sam) vả của các
mẫu chuẩn (ΔCt,ref) được tính toán. Lượng tương đối của ADN đậu
tương dòng GTS 40-3-2 trong mẫu, w, theo phần trăm, có liên quan chặt với
mẫu chuẩn được tính toán theo phương trình (C.1):
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(C.1)
Cách khác, một đường chuẩn được tính
(log [c] đối với Ct) bằng
hệ thống phát hiện trình tự dựa trên các chuẩn là các hỗn hợp GMO có nồng độ đậu
tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 xác định (ví dụ: 0,1 %; 0,5 %, 1 %, 2 % và 5
%), hoặc các chuẩn là các pha loãng thích hợp của các dung dịch kiểm tra thu được
từ các hỗn hợp GMO có nồng độ GTS 40-3-2 xác định (ví dụ: 5 %) (phương pháp đường
chuẩn kép). Đường chuẩn này được sử dụng để xác định nồng độ dòng GTS 40-3-2 của
các mẫu chưa biết. Vì ADN mẫu có thể bị phân hủy do quá trình chế biến thực phẩm hoặc vì
mẫu có thể chứa các thành phần khác với đậu tương, nồng độ GTS 40-3-2 tính toán
phải được chuẩn hóa với tổng số
ADN đậu tương có thể khuếch đại có mặt ở trong mẫu. Tổng số ADN đậu tương có
trong mẫu được xác định bằng phương pháp real-time PCR đặc hiệu gen lectin đậu
tương qua việc sử dụng các hỗn hợp ADN chuẩn có nồng độ ADN đậu tương xác định
[ví dụ 100 % (theo khối lượng), 50 % (theo khối lượng), 25 % (theo khối lượng),
10 % (theo khối lượng) và 1 % (theo khối
lượng)]. Hỗn hợp ADN chuẩn có nồng độ ADN đậu tương ở trên được chuẩn bị bằng
cách pha loãng ADN đậu tương từ dãy IRMM 410 hoặc 410R 19) với
ADN mang thích hợp. Để chuẩn hóa, chia lượng ADN của GTS 40-3-2 đo được cho lượng
ADN đo được của đậu tương.
Để tính kết quả của quy trình thay thế
này, điều quan trọng là lượng tuyệt đối của ADN khuôn (ng) là như nhau cho mỗi
PCR được sử dụng trong hiệu chuẩn.
Một quy trình thay thế khác được mô tả
trong C.2.
C.2 Phương pháp đặc
hiệu cấu trúc để định lượng ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử dụng real-time PCR
(phương pháp 2)
C.2.1 Giới thiệu
Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại
đặc hiệu và phát hiện gen đậu tương đặc hiệu taxon (lectin gen, Ie1) và
vùng cấu trúc gen đặc hiệu nối giữa ADN promoter-35S từ virút khảm súp lơ với
các tín hiệu hướng lục lạp của Petunia hybrida phía trước trình tự của
gen tổng hợp 5 enolpyruvylshikimate-3-phosphate từ Agrobacterium (epsps) có mặt
trong đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 (Roundup Ready® 20)) để định lượng
tương đối lượng đậu tương dòng GTS 40-3-2.
Các hạn chế, xem C.2.8.
C.2.2 Xác nhận giá
trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp đã được tối ưu hóa cho các
thiết bị real-time PCR sử dụng các mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM IRMM-410R 20))
[18] gồm bột đậu
tương khô chứa các hỗn hợp của GTS 40-3-2 và đậu tương thông thường.
Đã kiểm tra độ tái lập và độ chính xác
của phương pháp trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết
là các mẫu chuẩn được đề cập ở trên. Ngoài ra, một loại mẫu chuẩn đã qua xử lý là
bột đậu nành tách béo (TVP) đã được kiểm tra.
Số lượng bản sao của mỗi trình tự đích
trong bộ gen chưa được đánh giá chi tiết.
C.2.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Sáu mẫu chưa biết chứa khoảng 0,1 % và
5 % (theo khối lượng) các mẫu chuẩn đã được chứng nhận nêu trên (CRM IRMM-410R 20))
và mẫu TVP chứa 2 % (theo khối lượng) đậu tương dòng GTS 40-3-2 được phân tích
bởi
- 14 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống
ABI PRISM® 7700 SDS,
- 6 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống
ABI GeneAmp® 5700 SDS và
- 12 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống
LightCycler® 20) (Roche Diagnostics).
Số lượng đơn vị tham gia cũng như số
lượng mẫu được tuân thủ các tiêu chí của bộ TCVN 6910 (ISO 5725).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Để tách chiết ADN, các quy trình thực
hiện được mô tả trong A.3 của TCVN 7606 (ISO 21571) đã được sử dụng.
Đối với mỗi mẫu, thực hiện song song
hai tách chiết ADN. Phân tích mỗi mẫu lặp lại ba lần.
Độ chụm, độ chính xác và giới hạn định
lượng của phương pháp được xác định bằng thử nghiệm cộng tác. Dữ liệu về độ đặc
hiệu, tuyến tính và giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng được xác định trước
thử nghiệm cộng tác. Hàm lượng ADN của các mẫu thử nghiệm bao phủ được các giá
trị này.
Một bản tóm tắt các dữ liệu xác nhận
giá trị sử dụng về độ đúng và độ chính xác được nêu trong Bảng C.5 và C.6.
Bảng C.5 - Dữ
liệu xác nhận giá trị sử dụng cho ABI PRISM® 7700 SDS và GeneAmp®
5700 SDS21)
Mẫu 1
0,10%
± 0,03 %
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,50 %
± 0,06 %
Mẫu 3
1,0 %
± 0,1 %
Mẫu 4
2,0 %
± 0,2 %
Mẫu 5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
± 0,2 %
Mẫu 6
2 %TVP
Năm thử nghiệm liên phòng
2000
2000
2000
2000
2000
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số lượng phòng thử nghiệm
19
19
19
19
19
19
Số các số lạca
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
0
1
0
Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại
19
17
18
19
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
19
Giá trị trung bình
0,11
0,49
1,00
2,27
5,11
1,71
Độ lệch chuẩn lặp lại sr
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,12
0,21
0,25
0,53
0,48
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)
33
24
21
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10
28
Giới hạn lặp lại r(r =
2,8 sr)
0,10
0,33
0,59
0,71
1,48
1,34
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,05
0,3
0,28
0,71
1,38
0,55
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)
44
27
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
32
27
32
Giới hạn tái lập R(R =
2,6 sR)
0,13
0,37
0,77
2,00
3,87
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a Giá trị số lạc được
xác định với các kiểm định Grubbs và Cochran.[24]
Bảng C.6 - Dữ
liệu xác nhận giá trị sử dụng cho hệ thống LightCycler® 22)
Mẫu 1
0,10 %
± 0,03 %
Mẫu 2
0,50 %
± 0,06 %
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,0 %
± 0,1 %
Mẫu 4
2,0 %
± 0,2 %
Mẫu 5
5,0 %
± 0,2 %
Mẫu 6
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Năm thử nghiệm liên phòng
2000
2000
2000
2000
2000
2000
Số lượng phòng thử nghiệm
7
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7
7
7
5
Số giá trị số lạca
1
0
0
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại
6
7
7
7
7
4
Giá trị trung bình (%)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,55
0,95
2,01
5,43
1,82
Độ lệch chuẩn lặp lại sr
0,07
0,23
0,28
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,10
0,20
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lạl (%)
55
42
30
28
20
11
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,19
0,66
0,79
1,57
3,07
0,56
Độ lệch chuẩn tái lập sR
0,08
0,31
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,64
1,94
0,50
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)
64
55
35
32
36
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giới hạn tái lập R(R =
2,8 sR)
0,22
0,86
0,95
1,79
5,43
1,40
a Giá trị số lạc được
xác định với các kiểm định Grubbs và Cochran. [24]
Các kết quả liệt kê trong Bảng C.6
minh họa sự biến thiên quan sát được đối với hệ thống LightCycler®22) (Roche
Diagnostics). Lưu ý số phòng thử nghiệm gửi trả kết quả không đủ theo TCVN 6910
(ISO 5725).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.2.2.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp được thiết kế dựa vào một
trình tự được mô tả tại cơ sở dữ liệu GenBank® 22), mã số tiếp
cận AY596948.
C.2.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ22)
bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit như là các chuỗi truy vấn với chương
trình BLASTN 2.2.322) [ngày 24, tháng tư, 2002]. Kết quả của
việc tìm kiếm xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự
kiến.
C.2.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
Các mẫu bột đậu nành khô CRM IRMM-410R
22) chứa từ 0 % đến 5 % đậu tương GTS 40-3-2 đã được xác định. Các nền
mẫu thực phẩm thương mại được kiểm tra là bột đậu tương và các tách chiết
protein đậu tương.
Các kiểm tra đặc hiệu trước khi thử
nghiệm cộng tác cho thấy không có phản ứng chéo giữa bộ mồi/ đoạn dò trong
phương pháp này với các loài/mẫu không phải đích sau: lúa (Oryza sativa),
lúa mạch đen (Secale cereale), lúa mì (Triticum aestivum), lúa mạch
(hordeum vulgare), kê (Panicum miliaceum), đậu lăng (Lens
culinaris), đậu trắng (Phaseolus vulgaris), đậu xanh (Phaseolus
aureus), một loại đậu vàng (Lupinus luteus), teosinte (Zea mays
ssp.mexicana), cà chua (Lycopersicon escutentum), khoai tây (Solarium
tuberosum tuberosum ssp.), lúa miến (Sorghum vulgare), ngô (Zea
mays), cải dầu (Brassica napus), yến mạch (Avena sativa), lúa
mì spenta (Triticum spelta), lanh (Linum usitatissimum), kiều mạch
(Fagopyrum esculentum), vừng (Sesamum spp.), người (Homo
sapiens sapiens), cá hồi (Sdlmo saiar), bò (Bos
taunts) và Bacillus subtilis. Hơn nữa, không có phản ứng chéo được
quan sát với MS8xRF3 (SeedLink) hạt cải dầu hoặc với sự kiện GM sau: Bt176,
Bt11, T25, MON810, CBH351, DBT418, GA21.
Các alen và sự ổn định số bản sao của
gen đối chứng đậu tương được đánh giá sử dụng ít nhất tám giống khác nhau của đậu
tương.
C.2.2.4 Tối ưu hóa
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực
hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express® (Applied Biosystems)23).
C.2.2.5 Giới hạn phát
hiện
(LOD)
Giới hạn phát hiện không được đánh giá
trong thử nghiệm cộng tác.
Giới hạn phát hiện cho PCR được tính
toán bằng cách đo dãy pha loãng ADN đích. Theo phòng thử nghiệm phân tích, LOD
đã được xác định là 5 bản sao trình tự đích (được xác định với các plasmid).
C.2.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
Các giới hạn định lượng đã được đánh
giá bằng cách đo các dãy pha loãng liên tiếp ADN đích.
Theo các phòng thử nghiệm phân tích,
giới hạn định lượng là ít nhất 50 bản sao bộ gen đậu tương dòng GTS 40-3-2. Đối
với giá trị 1 C, xem Tài liệu
tham khảo [20].
Các nồng độ được kiểm tra trong thử
nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.5 và C.6.
CHÚ THÍCH Số lượng bản
sao không được xác định trong thử nghiệm cộng tác.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chưa có thông tin cụ thể.
C.2.4 Nguyên tắc
Đoạn ADN của trình tự đặc hiệu cấu
trúc GTS 40-3-2 có chiều dài 74 bp được khuếch đại bằng PCR sử dụng một cặp mồi đặc
hiệu cho GTS 40-3-2. Các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time)
bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 được đánh dấu bằng hai
thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM như một loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA
như một loại thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Vì mục đích đó, hóa chất TaqMan®23) được sử dụng.
Đoạn ADN của gen lectin đậu
tương đặc hiệu taxon (Ie1) có chiều dài 74 bp được khuếch đại bằng PCR
trong một lần chạy real-time PCR riêng biệt sử dụng hai mồi đặc hiệu gen Ie1
đậu tương và các sản phẩm PCR được đo trong mỗi chu trình PCR bằng một đoạn dò
TaqMan® đặc hiệu Ie123)
Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định
lượng các ADN được tách chiết từ mẫu kiểm tra chưa biết.
CHÚ THÍCH: Trước khi phân tích PCR định lượng,
các dung dịch ADN được tách chiết đã được phân tích bằng việc sử dụng một
chương trình PCR định tính trên máy real-time PCR. Chương trình chạy PCR định
tính (“chạy giám sát”) được tiến
hành để xác định “chu kì ngưỡng” (giá trị Ct)
của mỗi mẫu mã không tồn tại
một kinh nghiệm thực nghiệm. Bằng cách kiểm tra hai độ pha loãng khác nhau của
axit nucleic được tách chiết (ví dụ: độ pha loãng 1:10 và 1:40 của dung dịch
ADN) trong chạy giám sát, sự hiện diện có thể có của chất ức chế khuếch đại có
thể được xác định. Ngoài ra, một độ
pha loãng thích hợp của chất chiết axit nucleic thu được từ mẫu kiểm tra phù hợp
với dải hiệu chuẩn của phân tích định lượng có thể được xác định.
C.2.5 Thuốc thử
C.2.5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng,
xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.2.5.3 Đệm PCR
(không có MgCI2), 10x
C.2.5.4 Dung dịch
MgCl2, c(MgCI2)
= 25 mmol/l.
C.2.5.5 Dung dịch
dNTP,
c(dNTP) = 25 mmol/l
C.2.5.6 Các
oligonucleotit
Chi tiết của các oligonucleotit được
liệt kê trong Bảng C.7.
Bảng C.7 -
Các oligonucleotit
Tên
Trình tự
ADN oligonucleotit
Nồng độ cuối
trong PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
GM1-F
5'-CCA gCT TCg CCg CTT CCT TC-3'
600 nmol/l
GM1-R
5'-gAA ggC AAg CCC ATC TgC AAg CC-3’
600 nmol/l
Đoạn dò GM1
5'-FAM-CTT CAC CTT CTA TgC CCC TgA
CAC-TAMRA-3'a
120 nmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
RR1-F
5-CAT TTg gAg Agg ACA CgC TgA-3'
600 nmol/l
RR1-R
5'-gAg CCA TgT TgT TAA TTT gTg CC-3'
600 nmol/l
Đoạn dò RR1
5'-FAM-CAA gCT gAC TCT AgC AgA TCT
TTC-TAMRA-3'a
125 nmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chiều dài sản phẩm PCR của gen lectin
và chiều dài sản phẩm PCR của gen GTS 40-3-2 là 74 bp.
C.2.5.7 Enzym ADN
Polymerase chịu nhiệt
Enzyme ADN polymerase của AmpliTaq
Gold® 24).
C.2.5.8 Uracil N-glycosylase (tùy chọn).
C.2.6 Thiết bị, dụng
cụ
C.2.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu
chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
C.2.6.2 Máy chu trình
nhiệt
Các hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định
được thử nghiệm đầu tiên với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS hoặc
GeneAmp® 5700 SDS (Applied Biosystems), hệ thống LightCycler®
(Roche
Diagnostics)25). Các máy
real-time PCR khác có thể cũng được sử dụng nếu chúng có thể được chỉ ra được kết
quả tương đương hoặc tốt hơn.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch
đại PCR cho từng máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng
ABI PRISM®, hoặc các nắp quang học MicroAmp® (8 nắp ống/dải,
phẳng) (Applied Biosystems) và các ống mao dẫn LightCycler® (Roche
Diagnostics)25).
C.2.7 Cách tiến
hành: Chuẩn bị PCR
C.2.7.1 Yêu cầu chung
Chuẩn bị PCR cho trình tự đích gen đối
chứng và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt.
Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa
được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.
Trước khi "chạy định lượng",
một chương trình real-time PCR được thực hiện với ít nhất hai độ pha loãng của
ADN được tách chiết từ các mẫu kiểm tra cho cả hai hệ thống PCR để giám sát khả
năng khuếch đại. Dữ liệu thu được từ “chạy giám sát” được sử dụng
để kiểm soát chất lượng của ADN (ức chế). Các giá trị Ct thu được từ hai độ pha
loãng tuyến tính phải tỉ lệ với một khác biệt giá trị Ct xác định (ΔCt), ví dụ:
một độ pha loãng một phần tư có giá trị ΔCt xấp xỉ 2. Một giá trị ΔCt nhỏ hơn
chỉ ra sự khuếch đại không tuyến tính mà có thể bị gây ra bởi các chất ức chế
PCR. Giá trị Ct của một ADN chưa biết được xác định trong một lần chạy giám sát
cũng cung cấp thông tin về số lượng của ADN đích. Bằng cách này, một nồng độ
ADN thích hợp của mẫu kiểm tra chưa biết được lựa chọn phải nằm trong phạm vi của đường
chuẩn.
Phương pháp được quy định tổng thể
tích PCR 50 μl cho mỗi hỗn
hợp phản ứng với các thành phần như được liệt kê trong Bảng C.8 và C.9.
Bảng C.8 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng của trình
tự taxon đích
Tổng thể tích phản ứng
50 μl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5 μl
Polymerase ADN
ADN polymerase của AmpliTaq Gold® a
1,25 U
Hệ thống khử nhiễm
dUTP
uracil N-glycosylase
400 μmol/l 0,5 U
Đệm phản ứng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1 X
MgCl2
4,5 mmol/l mỗi loại
Mồi
GM1-F và GM1-R (xem Bảng C.7)
Xem Bảng C.7
dNTP
dATP, dCTP, dGTP
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đoạn dò
GM1 (xem Bảng C.7)
Xem Bảng C.7
H2O (loại dùng cho sinh học
phân tử)
Thêm đến 50 μl
a Khi sử dụng
hệ thống LightCycler®, đệm thay thế và Taq polymerase được khuyên
dùng, ví dụ Platinum Taq
hoặc Faststart
Taq trong đệm phản ứng của nhà sản xuất.
b ROX = carboxy-X-rhodamine.
Bảng C.9 - Hỗn hợp phản
ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng của trình tự đích
GMO
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
50 μl
Khuôn ADN thêm vào (1,7 ng đến 108
ng ADN đậu tương)
5 μl
Polymerase ADN
ADN polymerase của AmpliTaq Gold® a
1,25 U
Hệ thống khử nhiễm
dUTP
400 μmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5 U
Đệm phản ứng
Đệm A của TaqMan® (chứa
chuẩn thụ động ROX)a
1 x
MgCI2
4,5 mmol/l
Mồi
RR1-F và RR1-R (xem Bảng C.7)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
dNTP
dATP, dCTP, dGTP
200 μmol/l mỗi loại
Đoạn dò
RR1 (xem Bảng C.7)
Xem Bảng C.7
H2O (loại dùng cho sinh học
phân tử)
Thêm đến 50 μl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
b ROX =
carboxy-X-rhodamine.
C.2.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Các mẫu chuẩn được chứng nhận của đậu
tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 được sản xuất bởi IRMM, Geel, Bỉ (dãy
IRMM-410 26)) có thể được sử dụng làm kiểm chứng
dương [18].
Các kiểm chứng thích hợp
bất kỳ khác cần bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
C.2.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ như được
nêu trong Bảng C.10 đã được tối ưu hóa cho hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI
PRISM®7700 (Applied Biosystems) và hệ thống LightCycler®
(Roche Diagnostics) 26). Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng,
chương trình được sử dụng kết hợp với ADN polymerase của AmpliTaq Gold® 26). Việc sử dụng
các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu những điều chỉnh thích hợp cụ thể.
Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử
dụng.
Bảng C.10 mô tả các điều kiện phản ứng.
Bảng C.10 -
Quy trình thực hiện: Các điều kiện phản ứng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
s
Nhiệt độ
°C
Tiền-PCR: khử nhiễm
120
50
Tiền-PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính khuôn mẫu ADN
600
95
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bước 1
Biến tính
15a/5b
95
Bước 2
Gắn mồi và kéo dài
60a/25b
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a Được tối
ưu hóa cho ABI PRISM® 7700 SDS (Applied Biosystems) với phiên bản
phần mềm 1.6.3.
b Được tối
ưu hóa cho hệ thống LightCycler®. Thông số huỳnh quang trong LightCycler®
là channel 1 (gain 4) và thu được duy nhất trong suốt quy trình biến tính với
phần mềm phiên bản 3.
C.2.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
Vì các GMO khác với dòng đậu tương GTS
40-3-2 có thể chứa một phần của cấu trúc gen được sử dụng để cấu trúc nên dòng
đậu tương GTS 40-3-2, đặc biệt là vùng nối đặc hiệu giữa promoter-35S và trình
tự tín hiệu CTP từ các yếu tố Petunia hybrids, nên phương pháp này chỉ
thích hợp cho định lượng ADN GTS 40-3-2 khi không có mặt các GMO khác, như đã
được nêu cụ thể ở trên.
Phương pháp này phù hợp để đo tỉ lệ giữa
ADN đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 và ADN đậu tương. Tỉ lệ này phản ánh lượng
tương đối GTS 40-3-2 trong thành phần đậu tương ở thực phẩm được nghiên cứu.
Phương pháp này đã xác nhận giá trị sử
dụng cho bột đậu tương và protein thực vật đã tách béo.
CHÚ THÍCH: Nếu ADN đậu tương bị loại bỏ
hoặc bị phân hủy nhiều trong suốt quá trình chế biến thực phẩm (ví dụ: dầu tinh
luyện) hoặc nếu đậu tương chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong mẫu phân tích thì số bản sao đặc
hiệu đậu tương và/hoặc số bản sao đặc hiệu GM sẽ bằng hoặc dưới giới hạn định
lượng và phương pháp này sẽ không áp dụng được.
C.2.9 Hiệu chuẩn
và tính kết quả
Các đường chuẩn riêng biệt với mỗi bộ
mồi/đoạn dò thu được trong cùng lần chạy khuếch đại phân tích. Các đường chuẩn
bao gồm bốn độ pha loãng ADN được tách chiết từ 5 % CRM IRMM-410R 27).
Tại mỗi điểm trong số bốn điểm chuẩn, thực hiện các phản ứng lặp lại (trên hệ
thống ABI PRISM®7700 SDS 27) và GeneAmp® 5700) 27)
hoặc phản ứng đơn (trên hệ thống LightCycler® 27). Thực
hiện các phản ứng ba lần lặp lại tại một độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu thử
trên hệ thống ABI, trong khi thực hiện các phản ứng đơn tại hai độ pha loãng
khác nhau của ADN mẫu thử trên hệ thống LightCycler®27)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các số bản sao của ADN mẫu chưa biết
có được bằng cách nội suy từ các đường chuẩn. Để xác định số lượng ADN GTS
40-3-2 trong mẫu chưa biết, lấy số bản sao đích GTS 40-3-2 chia cho số bản sao
gen lectin và nhân với 100, sau đó được biểu thị dưới dạng tỉ lệ phần trăm.
C.3 Phương pháp đặc
hiệu cấu trúc để định lượng ADN ngô dòng Event176 sử dụng real-time PCR
C.3.1 Giới thiệu
Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại
đặc hiệu và phát hiện gen (hmg) mã hóa protein nhóm dễ biến đổi đặc hiệu
taxon ở ngô (Zea mays) và phát hiện phần đặc hiệu của gen tổng hợp cry1A(b)
có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis (cry1A(b) tổng hợp) có mặt
trong bộ gen của ngô biến đổi gen Event176 (Bt176, Maximizer™) để định lượng lượng
tương đối ADN Event176.
Các hạn chế, xem C.3.8.
C.3.2 Xác nhận giá
trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng
C.3.2.1 Yêu cầu chung
Phương pháp đã được tối ưu cho các mẫu
chuẩn được chứng nhận (CRM IRMM 411 28)) gồm bột ngô khô chứa các hỗn hợp của
Event176 và ngô thông thường.
Đã kiểm tra độ tái lập và độ chính xác
của phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết
của CRM IRMM 411 28) từ 0,1 % đến 5 % Event176 trong ngô thông thường,
cũng như sử dụng các mẫu chuẩn được sản xuất từ ngô hạt đã qua khử trùng bằng
nhiệt (HSK) chứa 2 % ngô Event176 trong ngô thông thường.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.3.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Thử nghiệm cộng tác đã được tổ chức bởi
Viện Bảo vệ Sức khỏe Người tiêu dùng và Thuốc Thú y Liên bang trước đây (BgVV
nay là BfR, Đức) cùng với GeneScan Châu Âu (Teltow, Đức), số lượng phòng thử
nghiệm tham gia cũng như số lượng mẫu được tuân thủ các tiêu chí của bộ TCVN
6910 (ISO 5725).
Nghiên cứu được thực hiện với 10 phòng
thử nghiệm sử dụng hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS 28)
và 7 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống ABI GeneAmp® 5700 SDS [28].
Để tách chiết ADN, sử dụng quy trình
thực hiện mô tả trong A.3 của TCVN 7606 (ISO 21571).
Với mỗi mẫu, thực hiện song song 2
tách chiết ADN. Mỗi mẫu thử nghiệm được phân tích lặp lại 3 lần.
Mỗi phòng tham gia nhận được sáu mẫu
chưa biết. Các mẫu bao gồm 4 mẫu chuẩn đã được chứng nhận: CRM IRMM 411 trong
khoảng 0,1 % đến 2 % ngô Event176 trong bột ngô (theo khối lượng), một mẫu bột
ngô chứa hỗn hợp (theo khối lượng) gồm 50 % đậu tương dòng GTS 40-3-2 (Roundup
ready), 49 % ngô (không biến đổi gen) và 1 % ngô Event176 (được dán nhãn Hỗn hợp
A) và một mẫu bột khô được sản xuất từ ngô hạt đã khử trùng bằng nhiệt (được
dán nhãn HSK) chứa 2 % ngô Event 176 trong ngô không biến đổi gen.
Độ chính xác, độ đúng và giới hạn định
lượng của phương pháp đã được xác định bởi một thử nghiệm cộng tác. Dữ liệu về
độ đặc hiệu, tuyến tính và giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện vượt quá
phạm vi các mẫu thử nghiệm đã được xác định trước khi tiến hành thử nghiệm cộng
tác.
Tóm tắt dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng
đối với độ đúng và độ chính xác nêu ra trong Bảng C.1.1.
Bảng C.11 - Dữ
liệu xác nhận giá trị sử dụng cho định lượng đặc hiệu cấu trúc Bt176
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu 1
0,100 %
± 0,002 %
Mẫu 2
0,50 %
± 0,01 %
Mẫu 3
1,00%
± 0,02 %
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2,00 %
± 0,04 %
Mẫu 5
Hỗn hợp A
(2 %)
Mẫu 6
2 % HSK
Năm thử nghiệm cộng tác
2000
2000
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2000
2000
2000
Số lượng phòng thử nghiệm
17
17
17
17
17
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số lượng số lạca
1
0
0
0
2
2
Số phòng thử nghiệm được giữ lại
16
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
17
17
15
15
Giá trị trung bình (%)
0,13
0,67
1,47
2,27
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,75
Độ lệch chuẩn lặp lại sr
0,03
0,13
0,28
0,45
0,37
0,21
Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối (%)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
19,48
18,83
19,88
18,22
27,71
Giới hạn lặp lại r(r = 2,8 sr)
0,08
0,37
0,78
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,04
0,58
Độ lệch chuẩn tái lập sR
0,05
0,26
0,55
0,92
0,85
0,25
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
36,13
39,23
37,19
40,72
41,62
32,90
Giới hạn tái lập R (R =
2,8 sR)
0,13
0,74
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2,59
2,38
0,69
a Số lạc được
xác định với các kiểm định Grubbs và Cochran
C.3.2.3 Đặc hiệu phân
tử
C.3.2.3.1 Yêu cầu chung
Thông tin về cấu trúc gen đưa vào bộ
gen ngô có sẵn trong Tài liệu tham khảo [31].
C.3.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ29)
bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit như là các chuỗi truy vấn với chương
trình BLASTN 2.2.4. 29) [ngày 8 tháng 12 năm 2002], Kết quả của việc
tìm kiếm đã xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự
kiến.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CRM bột ngô khô IRMM-411 29)
chứa từ 0,1 % đến 5 % ngô Event176 đã được xác định.
Với bộ mồi/đoạn dò đặc hiệu Event176,
không có các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ ADN của 20 dòng ngô khác nhau (giống
Zea mays), hoặc gạo (Oryza sativa), lúa mạch đen (Secale cereal),
lúa mì (Triticum
aestivum), lúa mạch (Hortium
vulgare), kê (Panicum miliaceum), đậu lăng (Lens culinaris), đậu trắng (Phaseolus
vulgaris), đậu xanh (Phaseolus aureus), đậu lupin (Lupinus
tuteus), teosinte (Zea mays ssp. mexicana), cà chua (Lycopersicum
esculentum), khoai tây (Solatium tuberosum ssp. Tuberosum), lúa miến
(Sorghum vulgare), ngô (Zea mays), cải dầu (Brassica napus),
yến mạch (Avena sativa), lúa mì (Triticum spelta), cây gai (Linum
usitatissimum), kiều mạch (Fagopyrum sculentum), vừng (Sesamum
spp.), người (Homo sapiens sapiens), cá hồi (Salmo salar), bò
(Bos taurus). Hơn nữa, không có phản ứng chéo được quan sát thấy ở đậu
tương biến đổi gen sự kiện GTS 40-3-2 hoặc các sự kiện ngô biến đổi gen sau:
Bt11, T25, MON810, CBH351, DBT418 và GA21.
Đối với bộ mồi/đoạn dò của gen hmg
đặc hiệu cho ngô, các sản phẩm khuếch đại đã được phát hiện với ADN từ các dòng
ngô không biến đổi gen khác nhau và với ADN được tách chiết từ CRM IRMM- 1130),
nhưng không phát hiện thấy một trong các loài nêu trên, ngoại trừ teosinte (Zea
may, ssp. mexicana), có họ hàng gần với ngô.
C.3.2.4 Tối ưu hóa
Tối ưu hóa được thực hiện trên hệ thống
phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS 30) sử dụng hóa chất
TaqMan [30]. Không cần
phải tối ưu hóa thêm khi thực hiện PCR trên thiết bị GenAmp® 5700 30)
vì chu trình nhiệt của thiết bị này giống với chu trình nhiệt của hệ thống phát
hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS30).
Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực
hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express (Applied Biosystems)30)
C.3.2.5 Giới hạn phát
hiện
(LOD)
Giới hạn phát hiện không được đánh giá
trong thử nghiệm cộng tác.
Giới hạn phát hiện cho PCR được tính
toán bằng cách đo các dãy pha loãng
liên tiếp ADN đích.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.3.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
Giới hạn định lượng cho giai đoạn PCR
đã được tính toán bằng cách đo các dãy pha loãng liên tiếp ADN đích.
Giới hạn định lượng tính toán bởi nhà
cung cấp phương pháp là 50 bản sao bộ gen ngô dòng Event 176 trong 82 000 bản
sao bộ gen dựa vào kích thước bộ gen lý thuyết là 2725 pg cho mỗi bộ gen đơn bội [14]
Các nồng độ được kiểm tra trong thử
nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.1.1.
CHÚ THÍCH: Số lượng các bản sao không được xác định trong
thử nghiệm cộng tác.
C.3.3 Điều chỉnh
Chưa có thông tin cụ thể.
C.3.4 Nguyên tắc
Đoạn ADN có chiều dài 129 bp của gen tổng
hợp cry1A (b) được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Các sản
phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time) bằng một đoạn dò
oligonucleotit đặc hiệu gen tổng hợp cry1A(b) được đánh dấu bằng 2 loại
thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc
nhuộm dập tắt huỳnh quang. Vì mục đích đó, hóa chất TaqMan® 30) được sử dụng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH: Ngô Event176 (Maximizer™)
có chứa 2 bản sao của một gen tổng hợp cry1A(b) dưới sự kiểm soát của
promoter của gen calcium dependent protein kinase (CDPK6) ở ngô và promoter của
gen phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) ở ngô, tương ứng.
Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định
lượng các ADN được tách chiết từ mẫu kiểm tra chưa biết. Các đường chuẩn riêng
biệt của mỗi bộ mồi/đoạn dò thu được trong cùng lần khuếch đại phân tích. Các
đường chuẩn gồm bốn độ pha loãng ADN tách chiết từ CRM IRMM-411 5 %, được sử dụng
làm vật liệu chuẩn cho hiệu chuẩn. Tại mỗi điểm của bốn điểm chuẩn, thực hiện
phân tích lặp lại hai lần. Thực hiện phản ứng lặp lại ba lần cho mỗi hai lần
tách chiết ADN của mẫu kiểm tra chưa biết, sử dụng các độ pha loãng ADN thích hợp.
Trước khi “chạy định lượng”,
thực hiện một lần chạy real-time PCR với ít nhất 2 độ pha loãng ADN được tách
chiết từ các mẫu kiểm tra (ví dụ: độ pha loãng 1:10 và 1:40 của dung dịch ADN)
để giám sát khả năng khuếch đại. Dữ liệu thu được bởi “chạy giám sát” được sử dụng
để xác định sự có mặt của bất kỳ chất ức chế PCR nào. Các giá trị Ct thu được từ
hai độ pha loãng tuyến tính phải tỉ lệ với một khác biệt giá trị Ct xác định (ΔCt),
ví dụ: một độ pha loãng một phần tư cho ra giá trị ΔCt xấp xỉ 2. Một giá
trị ΔCt nhỏ hơn chỉ ra sự khuếch đại không tuyến tính mà có thể bị gây ra bởi
các chất ức chế PCR. Giá trị Ct của ADN chưa biết được xác định trong chạy giám
sát cũng cung cấp thông tin về số lượng ADN đích. Bằng cách này, nồng độ ADN mẫu
thử thích hợp được xác định phải nằm trong dải động học của đường chuẩn.
C.3.5 Thuốc thử
C.3.5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử được
sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
C.3.5.2 Nước.
C.3.5.3 Đệm PCR
(không có MgCl2), 10 x
C.3.5.4 Dung dịch MgCl2, c(MgCl2)
= 25 mmol/l.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.3.5.6 Các
oligonucleotit
Chi tiết của các oligonucleotit được
liệt kê trong Bảng C.12.
Bảng C.12 -
Các oligonucleotit
Tên
Trình tự
ADN oligonucleotit
Nồng độ cuối
trong PCR
Trình tự đích gen đối chứng
ZM1-F
5’-TTg gAC TAg AAA TCT CgT gCT gA-3’
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
ZM1-R
5’-gCT ACA TAg ggA gCC TTg TCC T-3’
300 nmol/l
Đoạn dò ZM1
5’-FAM-CAA TCC ACA CAA ACg CAC gCg
TA-TAMRA-3’a
160 nmol/l
Trình tự đích GMO
CRY2-F
5’-CCC ATC gAC ATC AgC CTg AgC-3’
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CRY2-R
5'-CAg gAA ggC gTC CCA CTg gC-3’
300 nmol/l
Đoạn dò BTSYN
5’-FAM-ATg TCC ACC Agg CCC AgC ACg
-TAMRA-3’a
160 nmol/l
a FAM: 6-carboxylfluorescein; TAMRA:
6-carboxyltetramethyltrhodamine.
Chiều dài sản phẩm PCR của gen đặc hiệu
taxon là 79 bp, chiều dài sản phẩm PCR của gen đặc hiệu Event176 là 129 bp.
C.3.5.7 Enzym ADN
polymerase chịu nhiệt
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.3.5.8 Uracil N-glycosylase (tùy chọn).
C.3.6 Thiết bị, dụng
cụ
C.3.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
C.3.6.2 Máy chu trình
nhiệt
Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được
thử nghiệm đầu tiên với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS và
GeneAmp® 5700 SDS, Applied Biosystems 31). Các hệ thống
phát hiện real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp các
điều kiện phản ứng.
C.3.6.3 Các ống phản ứng
Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch
đại PCR cho từng máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng
ABI PRISM® hoặc các nắp quang học MicroAmp® (Applied
Biosystems 31)).
C.3.7 Cách tiến
hành: Chuẩn bị PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chuẩn bị PCR cho trình tự đích gen đối
chứng và trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt.
Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa
được kiểm tra hoặc xác nhận giá trị sử dụng.
Phương pháp này quy định tổng thể tích
PCR 25 μl cho mỗi phản ứng với các thành phần như được liệt kê trong Bảng
C.13 và C.14.
Bảng C.13 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng của trình
tự taxon đích
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (2,3 ng tới 150 ng ADN
ngô)
5 μl
ADN polymerase
ADN polymerase của AmpliTaq Gold®
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hệ thống khử nhiễm
dUTP
Uracil N-glycosylase
(tùy chọn)
400 μmol/l
0,5 U
Đệm phản ứng
Đệm A của TaqMan® (chứa
chuẩn thụ động ROX)a
1 x
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4,5 mmol/l
Mồi
ZM1-F và ZM1-R (xem Bảng C.12)
xem Bảng C.3.5.6
dNTP
dATP, dCTP, dGTP
200 μmol/l mỗi
loại
Đoạn dò
Đoạn dò ZM1 (xem Bảng C.12)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a ROX = carboxy-X-
rhodamine
Bảng C.14 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng của trình
tự đích GMO
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (2,3 ng tới 150 ng ADN
ngô)
5 μl
ADN polymerase
ADN polymerase của AmpliTaq Gold®
1,25 U
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
dUTP
Uracil N-glycosylase
(tùy chọn)
400 μmol/l
0,5 U
Đệm phản ứng
Đệm A của TaqMan® (chứa chuẩn thụ
động ROX)a
1 x
MgCl2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mồi
CRY2-F và CRY2-R (xem Bảng C.12)
xem C.3.5.6
dNTP
dATP, dCTP, dGTP
200 μmol/l mỗi
loại
Đoạn dò
Đoạn dò BTSYN (xem Bảng C.12)
xem C.3.5.6
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.3.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Các mẫu chuẩn được chứng nhận của vật
liệu Event176 được sản xuất bởi IRMM, Geel, Bỉ (dãy IRMM-411 32)) có thể được
sử dụng làm kiểm chứng dương[5].
Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần
bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
C.3.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian- nhiệt độ như
được nêu trong Bảng C.15 đã được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI
PRISM® 7700 (SDS) 32) (Applied Biosystems). Trong nghiên cứu
xác nhận giá trị sử dụng, chương trình được sử dụng kết hợp với ADN polymerase
của AmpliTaq Gold®32). Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có
thể yêu cầu những điều chỉnh thích hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban
đầu phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.
Bảng C.15 Mô tả các điều
kiện phản ứng.
Bảng C.15 -
Quy trình: Các điều kiện phản
ứng
Thời gian s
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tiền-PCR: Khử nhiễm
120
50
Tiền-PCR: Hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính ADN khuôn mẫu
600
95
PCR (45 chu trình)
Bước 1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
15
95
Bước 2
Gắn mồi và kéo dài
60
60
C.3.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
Phương pháp này phù hợp để đo tỉ lệ giữa
ADN đặc hiệu cấu trúc Event176 với ADN ngô. Tỉ lệ này phản ánh lượng tương đối
Event176 trong thành phần ngô ở thực phẩm được nghiên cứu.
CHÚ THÍCH: Nếu ADN ngô bị loại bỏ hoặc bị phân hủy
nhiều trong suốt quá trình chế biến thực phẩm (ví dụ: dầu tinh luyện) hoặc nếu
ngô chỉ chiếm một phần
rất nhỏ trong mẫu phân tích, thì tổng số các bản sao đặc hiệu GM và/hoặc tổng số
các bản sao đối chứng ở ngô
sẽ bằng hoặc dưới giới hạn định lượng và các phương pháp này mô tả sẽ không áp
dụng được.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các đường chuẩn riêng biệt với mỗi bộ
mồi/đoạn dò thu được trong cùng lần chạy khuếch đại phân tích. Các đường chuẩn
bao gồm 4 độ pha loãng ADN được tách chiết từ dãy 5 % CRM IRMM-411 33). Tại mỗi điểm
trong số 4 điểm chuẩn, thực hiện phản ứng lặp lại 2 lần (trên hệ thống
ABI PRISM®7700 SDS và GeneAmp® 5700) 33). Sử dụng dãy
pha loãng một phần tư với nồng độ ban đầu là 40 000 bản sao bộ gen (giả định một
bộ gen ngô đơn bội tương quan với 2 725 pg [4]). Thực hiện
các phản ứng lặp lại 3 lần tại độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu thử trên hệ
thống ABI.
Dựng đường chuẩn dựa vào các giá trị Ct
với logarit số bản sao đích của các điểm chuẩn. Điều này có thể thực hiện được,
ví dụ: bằng cách sử dụng bảng tính của Microsoft Excel33), hoặc trực
tiếp bằng các tùy chọn có sẵn với phần mềm hệ thống phát hiện trình tự.
Các số bản sao của ADN mẫu chưa biết
có được bằng cách nội suy từ các
đường chuẩn. Để xác định lượng ADN Event176 trong mẫu chưa biết, lấy số bản sao
đích Event176 chia cho số bản sao của gen hmg sau đó nhân với 100 và biểu
thị kết quả dưới dạng tỉ lệ phần trăm.
C.4 Phương pháp đặc
hiệu cấu trúc để định lượng ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử dụng real-time PCR
C.4.1 Giới thiệu
Phụ lục này mô tả phương pháp phát hiện
và định lượng gen đặc hiệu taxon của đậu tương (gen lectin, Ie1) và vùng
ADN đặc hiệu nối giữa trình tự peptit vận chuyển trong lục lạp của Petunia
hybrids và trình tự gen tổng hợp 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (epsps)
của Agrobacterium có mặt trong
đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 [đậu tương Roundup Ready®
(RRS)]. Phương pháp dựa vào real-time PCR sử dụng Plasmid
pMulSL2 làm mẫu chuẩn để định lượng tương đối GTS 40-3-2 trong đậu tương thông
qua sử dụng hệ số chuyển đổi (Cf) là tỉ lệ của các số bản sao giữa các trình tự
ADN đặc hiệu GTS 40-3-2 với các trình tự ADN đặc hiệu taxon trong các hạt đậu
tương đại diện cho dòng GTS 40-3-2 thuần chủng.
CHÚ THÍCH Cf được sử dụng
để tính toán hàm
lượng GMO (% khối lượng) từ số bản sao ADN GMO của trình tự đặc hiệu đích và trình
tự đặc hiệu taxon. Cf có thể được đo bằng tỉ lệ giữa số bản sao trình tự đặc hiệu đích với
trình tự đặc hiệu taxon từ một mẫu chuẩn thích hợp.
Các hạn chế, xem c.4.8.
C.4.2 Xác nhận giá
trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp này được tối ưu cho máy
real-time PCR ABI PRISM® 7700 SDS 33) sử dụng plasmid
pMulSL2 làm chuẩn [33]. Plasmid pMulSL2 trong các sản phẩm PCR riêng
biệt được khuếch đại từ các hệ thống PCR để khuếch đại đặc hiệu trình tự taxon
đậu tương (Le1), và trình tự đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2.
CHÚ THÍCH Plasmid được sử
dụng làm chuẩn để xác định các hàm lượng biến đổi gen được tính từ các số bản sao
tương đối của trình tự ADN đặc hiệu GM và trình tự ADN đặc hiệu taxon.
Đã kiểm tra độ lặp lại và độ tái lập của
phương pháp trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng mẫu chuẩn và bột đậu
tương khô chưa biết là hỗn hợp của GTS 40-3-2 và đậu tương thông thường [34].
Số bản sao của các trình tự đặc hiệu
taxon (Le1) trong bộ gen được đánh giá cho 10 giống đậu tương đại diện.
Phương pháp được công bố trong các
tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản và Hàn Quốc [35],[36],[37],[38]
C.4.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia thử
nghiệm trên 6 cặp mẫu đậu tương chưa biết chứa khoảng 0 % đến 10 % bột đậu
tương khô có nguồn gốc từ dòng GTS 40-3-2.
CHÚ THÍCH Các mẫu chưa
biết của hỗn hợp bột đậu tương dùng cho xác nhận giá trị sử dụng của phương
pháp đã được chuẩn bị là 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng)
bột đậu tương khô có nguồn gốc từ dòng GTS 40-3-2. Độ đồng nhất của các mẫu ở mỗi
mức độ được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp định lượng này theo quy
trình thực hiện của AOAC[39].
Phương pháp này đã được xác nhận giá
trị sử dụng cho GTS 40-3-2 trong một thử nghiệm cộng tác theo quy trình của
AOAC [34],[39]. Thử nghiệm
cộng tác được tổ chức bởi Viện Nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (NFRI, Tsukuba, Nhật
Bản) cùng với Trung tâm cấp nhãn hiệu Chất lượng Thực phẩm và Dịch vụ Người
tiêu dùng, Saitama, Nhật Bản và Viện Khoa học Sức khỏe Quốc gia, Nhật Bản. Mười
lăm đơn vị tham gia bao gồm các phòng thử nghiệm của Nhật Bản, Hàn Quốc và Mỹ
thực hiện các thử nghiệm cộng tác sử dụng hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS
(Applied Biosystems) 34) trong hai giai đoạn riêng biệt. Tất cả
các đơn vị tham gia được yêu cầu phải tuân theo các quy trình tách chiết ADN và
PCR định lượng. Giai đoạn đầu nhằm xác định Cf của GTS 40-3-2. Tất cả các phòng
tham gia được nhận các bộ mồi, đoạn dò, mẫu chuẩn và các ADN được tách chiết từ
các hạt GTS 40-3-2, được chuẩn bị bởi Qiagen DNA Eeasy Plant Maxikit34).
Các ADN đã được sử dụng để đo các số bản sao của trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc
và trình tự ADN đặc hiệu taxon ở đậu tương. Tất cả các phép đo trong giai đoạn
này được lặp lại 3 lần. Tổng cộng 135 bộ dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm
tham gia. Các tương quan của các đường chuẩn trong dữ liệu thu được từ tất cả các đơn vị
tham gia có thể chấp nhận được (r > 0,990). Theo quy
trình thực hiện của AOAC [39], các phòng thử nghiệm
có số lạc bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran (p <0,025) và kiểm định
Grubbs (p <0,025). Không có các số lạc nào quan sát được ở một trong
hai kiểm định, như trình bày trong Bảng C.16.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trình tự đích
Đặc hiệu cấu
trúc GTS 40-3-2
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia
15
Số lượng số lạc Cochran
0
Số lượng số lạc Grubbs
0
Số phòng thử nghiệm được giữ lại
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Cfa
0,95 ±0,02
a Trình bày
dạng trung bình ± khoảng tin cậy (α = 0,05)
Người phân tích có thể xác định lại Cf
bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn đậu tương dòng GTS 40-3-2 thích hợp.
Giai đoạn thứ hai thực hiện các thử
nghiệm mù. Các mẫu bột đậu tương chưa biết được thiết kế thành sáu cặp mù đôi,
gồm 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột đậu tương biến đổi
gen dòng GTS 40-3-2 dạng khô trong đậu tương thông thường. Mẫu trắng 0 % đậu
tương dòng GTS 40-3-2 được sử dụng để loại bỏ các phòng thử nghiệm không hợp lệ
trước khi phân tích thống kê. Các phòng thử nghiệm tham gia được chỉ dẫn tách chiết
ADN từ các mẫu bằng cách sử dụng Qiagen kit. Dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm được
giữ lại bởi các kiểm định số lạc được sử dụng để tính toán giá trị trung bình
và khoảng tin cậy (α = 0,05). Các giá trị trung bình được xác định là Cf dùng
cho tính toán hàm lượng biến đổi gen (%) trong các thử nghiệm mù. Giá trị trung
bình của Cf cho định lượng đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 là 0,95.
Mười ba phòng thử nghiệm tham gia
trong giai đoạn thứ hai đã phân tích 156 mẫu bằng cách khuếch đại trình tự Le1
và trình tự đặc hiệu cấu trúc. Các phòng thử nghiệm không báo cáo mẫu trắng là
0 % bị coi là không hợp lệ và tất cả các dữ liệu của các phòng thử nghiệm này bị
loại ra trước khi tiến hành các kiểm định số lạc. Trong tất cả các thí nghiệm,
các tương quan của các đường chuẩn đã có thể chấp nhận được (r > 0,990).
Các phòng thử nghiệm có giá trị bất thường trong cặp mù đôi ở mỗi mức độ GTS
40-3-2 bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran [40] và Grubbs [41], tương ứng,
trước khi phân tích thống kê độ chính xác và độ chụm. Không có số lạc Cochran
và một số lạc Grubbs được phát hiện trong dữ liệu. Giá trị trung bình, độ chệch,
độ lệch chuẩn tương đối lặp lại
(%) và độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) ở mỗi mức độ trộn được trình bày
trong Bảng C.17.
CHÚ THÍCH 2 Các cộng tác
viên không tính toán các kết quả cuối cùng sử dụng Cf được xác định bởi nghiên
cứu cộng tác đầu tiên. Các số bản sao của mỗi trình tự đích thu được trong các
xác định Cf và các thử nghiệm mù được báo cáo cho NFRI và đơn vị % GMO của các
mẫu thử nghiệm mù đã được chuyển đổi về các kết quả cuối cùng bằng cách sử dụng
Cf.
Bảng C.17 -
Tóm tắt xác nhận giá trị sử dụng cho định lượng đậu tương GTS 40-3-2 đặc
hiệu cấu trúc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,1
0,5
1
5
10
Số lượng các phòng thử nghiệm tham
gia
13
13
13
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
13
Số lượng các phòng thử nghiệm không
hợp lệ
1
1
1
1
1
Số lượng số lạc Cochran
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0
0
0
Số lượng số lạc Grubbs
1
0
0
0
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
11
12
12
12
12
Trung bình hàm lượng GMO (%)
0,1
0,6
1,2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
11,7
Độ chệch của giá trị đúng (%)
+8,1
+14,3
+16,1
+ 15,1
+ 17,2
Độ lệch chuẩn lặp lại sra
0,015
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,129
0,435
0,993
Giới hạn lặp lại ra (r = 2,8 sr)
0,041
0,191
0,362
1,219
2,779
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
13,4
12,0
11,2
7,6
8,5
Độ lệch chuẩn tái lập sRa
0,015
0,091
0,161
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,246
Giới hạn tái lập Ra
(R = 2,8 x sR)
0,041
0,255
0,451
1,849
3,489
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)b
13,4
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
13,9
11,5
10,6
Dưới 20 bảo saoc (giới hạn
phát hiện tuyệt đối trong phương pháp này)
4/22
0/24
0/24
0/24
0/24
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
b Được biểu
thị là tỉ lệ % của giá trị trung bình
c Được biểu
thị là tỉ lệ của số lượng dữ liệu dưới 20 bản sao được giữ lại với tổng số dữ
liệu được giữ lại.
C.4.2.3 Đặc hiệu phân
tử
C.4.2.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp này được mô tả trong Tài
liệu tham khảo [33], Thông tin về cấu trúc di truyền đưa vào bộ gen đậu tương sẵn
có trong Tài liệu tham khảo [33] và [22], Các trình tự ADN của phương pháp này
thu được từ DDBJ 35) database với mã số tiếp cận X04879, từ
một báo cáo [42] và từ bằng sáng chế Mỹ số 5633435.
Nếu cấu trúc ADN đưa vào GTS 40-3-2 được
sử dụng cho các sự kiện GM khác, thì có thể thu được kết quả dương tính giả do
trình tự được khuếch đại bắt nguồn từ cấu trúc này.
C.4.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu DDBJ35) (ngày 3 tháng 12
năm 1999) và các tài liệu đánh giá sự an toàn được công bố bởi Bộ Y tế, Lao động
và Phúc lợi Nhật Bản và bởi Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Nhật Bản, sử
dụng các trình tự nucleotit như là chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3
36).
Các kết quả tìm kiếm đã xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với trình tự
đích dự kiến.
C.4.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các kiểm tra đặc hiệu trước khi thử
nghiệm cộng tác cho thấy không có phản ứng chéo giữa bộ mồi/đoạn dò với các
loài/mẫu không phải đích sau: lúa (Oryza sativa), lúa mì (Triticum
aestivum) và lúa mạch (hordeum vulgare). Không quan sát thấy phản ứng
chéo ở các dòng ngô biến đổi gen sau: MON810, Event176, Bt11,
GA21 và T25.
C.4.2.4 Tối ưu hóa
Tối ưu hóa của thuốc thử được thực hiện
trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS (Applied
Biosystems) sử dụng hóa chất TaqMan® 36)[43].
Thiết kế mồi và đoạn dò được thực hiện
bằng phần mềm Primer Express® (Applied Biosystems).
C.4.2.5 Giới hạn phát
hiện
(LOD)
LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu
chuẩn [33]
LOD tương đối được xác nhận giá trị sử
dụng trong các thử nghiệm cộng tác: 0,1 % GTS 40-3-2.
C.4.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu
chuẩn.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.4.3 Điều chỉnh
Chưa có thông tin cụ thể.
C.4.4 Nguyên tắc
Đoạn trình tự đặc hiệu cấu trúc có chiều
dài 121 bp của GTS 40-3-2 được khuếch đại bằng PCR sử dụng một cặp mồi đặc hiệu
cho GTS 40-3-2. Các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (realtime) bằng
một đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu GTS 40-3-2 được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm
huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt
huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan®37) được sử dụng.
Đoạn trình tự đặc hiệu taxon có chiều
dài 118 bp của gen lectin (Le1) đậu tương được khuếch đại bằng PCR
trong một phản ứng real-time PCR riêng biệt bằng cách sử dụng hai mồi đặc hiệu
Le1 đậu tương, và các sản phẩm PCR được đo trong mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò
TaqMan®37) đặc hiệu Le1.
Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định
lượng số bản sao ADN được tách chiết từ mẫu chưa biết. Các đường chuẩn riêng biệt
của mỗi bộ mồi/đoạn dò được tạo thành trong cùng một lần chạy khuếch đại phân
tích. Các đường chuẩn gồm năm nồng độ chứa 20, 125, 1 500, 20 000, 250 000 bản
sao ADN plasmid
pMulSL2. Tại mỗi điểm của năm điểm chuẩn, phép đo được thực hiện ba lần. Các phản
ứng lặp lại ba lần bằng cách sử dụng độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu thử, và
đo trên thiết bị ABI PRISM® 7700 SDS (Applied Biosystems)37)
trong cùng lần chạy phân tích.
Các giá trị Ct (chu kì ngưỡng) xác định
cho các điểm chuẩn của Le1 hoặc đích đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2, tương
ứng, được vẽ đồ thị đối với logarit số bản sao ADN plasmid pMulSL2[33] để thiết lập
một đường chuẩn, số bản sao ADN mẫu kiểm tra có được bằng cách nội suy từ các
đường chuẩn. Để xác định lượng GTS 40-3-2 trong mẫu kiểm tra, lấy số bản sao của
cấu trúc GTS 40-3-2 chia cho số bản sao Le1 và Cf của GTS 40-3-2 đặc hiệu
cấu trúc, nhân với 100 để có tỉ lệ phần trăm như trong C.4.9.
C.4.5 Thuốc thử
C.4.5.1 Yêu cầu chung
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.4.5.2 Nước
C.4.5.3 TaqMan®
Universal Master Mix 37), 2 x.
C.4.5.4 Mẫu chuẩn (Plasmid)
Mẫu chuẩn sử dụng để xây dựng và xác nhận giá
trị sử dụng của phương pháp là plasmid pMulSL2 [33] có trong plasmid phát
hiện đậu tương GM (RRS) (Fasmac No. PS-2 và Nippon Gene No. 310-04981)37).
C.4.5.5 Các Oligonucleotit
Các trình tự của các mồi và đoạn dò của
các gen đặc hiệu cấu trúc cho đậu tương dòng GTS 40-3-2 và gen đặc hiệu taxon
được liệt kê trong Bảng C.18.
Bảng C.18 - Các
oligonucleotit
Tên
Trình tự
ADN oligonucleotit
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trình tự đích gen đặc hiệu taxon
Le1n02-5'
5’-gCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3’
500 nmol/l
Le1n02-3’
5’-gCC CAT CTg CAA gCC TTT TT-3’
500 nmol/l
Le1-Taq
5’-FAM-AgC TTC gCC gCT TCC TTC AAC
TTC AC-TAMRA-3’a
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trình tự đích GMO
RRS 01-5’
5-CCT TTA ggATTT CAg CAT CAg Tgg-3'
500 nmol/l
RRS01-3’
5’-gAC TTg TCg CCg ggA ATg-3’
500 nmol/l
RRS-Taq
5’-FAM-CgC AAC CgC CCg CAA ATC C
-TAMRA-3’3
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a FAM:
6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.
Chiều dài sản phẩm PCR của gen lectin
là 118 bp, của gen GTS 40-3-2 là 121 bp.
C.4.6 Thiết bị, dụng
cụ
C.4.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
C.4.6.2 Máy chu trình
nhiệt
Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được
thử nghiệm với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS
(Applied Biosystems)38) trong thời gian thử nghiệm cộng tác.
Các hệ thống phát hiện real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh
thích hợp các điều kiện phản ứng.
C.4.6.3 Khay và các nắp
ống phản ứng
Khay và các nắp ống phản ứng phải phù
hợp để khuếch đại
PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng
ABI PRISM®, hoặc các nắp quang học MicroAmp® (Applied
Biosystems)38), tương ứng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.4.7.1 Yêu cầu chung
Chuẩn bị PCR cho trình tự đích Le1
đặc hiệu taxon và cho trình tự đích đặc hiệu GTS 40-3-2 phải được thực hiện
trong các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác
nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.
Phương pháp này quy định tổng thể tích
PCR 25 μl cho mỗi hỗn
hợp phản ứng với thuốc thử như được liệt kê trong Bảng C.19 cho Le1 và
trong Bảng C.20 cho GTS 40-3-2.
Bảng C.19 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại trình tự Le1 đặc hiệu taxon ở thể tích cuối cho
mỗi ống phản ứng
Tổng thể tích
25 μl
Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen đậu
tương)
2,5 μl
Đệm phản ứng (ADN polymerase và
dNTP)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
12,5 μl
Mồi
Le1n02-5' và Le1n02-3' (xem
Bảng C.18)
xem Bảng C.18
Đoạn dò
Le1-Taq (xem Bảng
C.18)
xem Bảng
C.18
Bảng C.20 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại trình tự đặc hiệu GTS 40-3-2 ở thể tích cuối cho mỗi ống
phản ứng
Tổng thể tích phản ứng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen đậu
tương)
2,5 μl
Đệm phản ứng (ADN polymerase và
dNTP)
TaqMan® Universal PCR
Master Mix (ABI)
12,5 μl
Mồi
RRS 01-5' và RRS 01-3' (xem Bảng
C.18)
xem Bảng
C.18
Đoạn dò
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
xem Bảng
C.18
C.4.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Các dãy thử nghiệm phải bao gồm các kiểm
chứng như quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
Nếu các kiểm chứng không cho các kết
quả dự kiến, thì phải hủy kết quả và phân tích phải được lặp lại.
Ít nhất hai phương án lựa chọn thay thế nên sẵn
có để làm kiểm chứng dương/vật liệu so sánh chuẩn, như sau.
a) ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng
cao được tách chiết từ đậu tương, có thể sử dụng nếu số lượng ADN được biết,
trên cơ sở tính toán
các số bản sao trình tự đích từ kích thước bộ gen đậu tương.
b) Một plasmid chứa các trình tự đích
có thể được bổ sung ở các nồng độ khác nhau với các số lượng bản sao đã biết. Plasmid này có
trong bộ plasmid phát hiện đậu tương biến đổi gen (RRS) (Fasmac No. PS-2 và
Nippon Gene No 310-0498139))[33].
Theo các yêu cầu đảm bảo chất lượng,
các kiểm chứng dương
tốt hơn không nên là các vật liệu so sánh chuẩn.
C.4.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trong thử nghiệm cộng tác, chương
trình được sử dụng kết hợp với TaqMan® Universal Master Mix 39).
Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu điều chỉnh phù hợp cụ
thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại Master Mix được
sử dụng.
Bảng C.21 -
Quy trình: Các điều kiện phản ứng
Thời gian s
Nhiệt độ °C
Tiền-PCR: khử nhiễm
120
50
Tiền-PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính ADN khuôn
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
95
PCR (40 chu trình)
Bước 1
Biến tính
30
95
Bước 2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
60
59
C.4.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
Nếu đậu tương biến đổi gen khác với
GTS 40-3-2 chứa cùng các trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc, thì phương pháp chỉ
phù hợp cho định lượng ADN GTS 40-3-2 khi không có mặt các GMO khác.
Phương pháp này chỉ phù hợp cho định
lượng dòng đậu tương GTS 40-3-2 khi không có mặt các sự kiện GM khác chứa cùng
cấu trúc này. Tỉ lệ này phản ánh lượng GTS 40-3-2 trong các đậu tương được
nghiên cứu. Phương pháp này chỉ xác nhận giá trị sử dụng cho đậu tương.
Thử nghiệm cộng tác là một nguồn dữ liệu
giá trị để hỗ trợ cho việc ước lượng độ không đảm bảo đo. Cần xác định bất kỳ
nguồn không đảm bảo đo nào mà không được bao gồm trong dữ liệu thử nghiệm cộng
tác, như lấy mẫu và những vấn đề khác, theo yêu cầu quốc tế [44],[45].
C.4.9 Hiệu chuẩn và
tính kết quả
Người phân tích phải xác định giá trị
ngưỡng để xác định chu kì ngưỡng (Ct).
Ví dụ về các thủ tục sau khi phân tích
PCR có sẵn trong Hướng dẫn của nhà sản xuất Bộ plasmid phát hiện đậu tương biến
đổi gen (RRS) (Fasmac No. PS-2 và Nippon Gene No. 310-04981). Xem Tài liệu tham
khảo [33].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
w = 
Trong đó:
NGM là số của các bản sao
của trình tự đích đặc hiệu GM trong ADN mẫu thử nghiệm;
NTX là số của các bản
sao của trình tự đích đặc hiệu taxon trong ADN mẫu thử nghiệm.
C.5 Phương pháp đặc
hiệu cấu trúc để định lượng ADN ngô dòng MON 810 sử dụng real-time PCR
C.5.1 Giới thiệu
Phụ lục này mô tả
phương pháp phát hiện và định lượng gen đặc hiệu taxon của ngô (gen tổng hợp
tinh bột ngô llb: zSSIIb)
và vùng nối cấu trúc ADN đặc hiệu giữa trình tự intron của gen mã hóa heat shock
protein 70 (Hsp70) ở ngô và gen tổng hợp crylA(b) có nguồn gốc từ Bacillus
thuringiensis có mặt trong ngô biến đổi gen dòng MON 810 dựa trên real-time
PCR sử dụng plasmid làm chuẩn để định lượng tương đối MON 810 bằng sử dụng hệ số
chuyển đổi (Cf) là tỉ lệ của các số bản sao giữa các trình tự ADN đặc hiệu cấu
trúc với các trình tự ADN đặc hiệu taxon của ngô hạt đại diện cho dòng MON 810
thuần chủng.
CHÚ THÍCH: Cf được sử dụng để tính
toán hàm lượng GMO (% khối lượng) từ số bản sao ADN GMO của trình tự đặc hiệu
đích và trình tự đặc hiệu taxon. Cf có thể được đo bằng tỉ lệ giữa số bản sao
trình tự đặc hiệu đích với trình tự đặc hiệu taxon từ một mẫu chuẩn thích hợp.
Các hạn chế, xem C.5.8.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.5.2.1 Yêu cầu
chung
Phương pháp này được tối ưu trên thiết
bị real-time PCR ABI PRISM® 7700 SDS 40) sử dụng
plasmid PMul5 40) làm chuẩn [33]. plasmid
pMul5 trong các sản phẩm PCR riêng biệt được khuếch đại từ các hệ thống PCR để
khuếch đại đặc hiệu trình tự taxon ở ngô (zSSIIb), trình tự promoter 35S
(p35S) của
vi
rút khảm súp lơ, trình tự kết thúc của nopaline synthase (tNOS), và trình tự đặc
hiệu cấu trúc của MON 810, Event 176, Bt11, GA21 và T25.
CHÚ THÍCH: plasmid được
sử dụng làm chuẩn để xác định các hàm lượng GM được tính từ số bản
sao tương đối của các trình tự ADN đặc hiệu GM và các trình tự ADN đặc hiệu
taxon.
Đã kiểm tra độ lặp lại và độ tái lập của
phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng mẫu chuẩn và bột
ngô khô chưa biết là hỗn hợp của ngô MON 810 và ngô thông thường [34].
Số bản sao của các trình tự đặc hiệu
taxon (zSSIIb) trong bộ gen được đánh giá cho 20 giống ngô đại diện.
Phương pháp được công bố trong các
tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản và Hàn Quốc[35],[36],[37],[38].
C.5.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia thử
nghiệm trên tổng số 12 mẫu ngô chưa biết có chứa khoảng 0 % đến 10 % (theo khối
lượng) bột ngô khô có nguồn gốc từ dòng MON 810.
CHÚ THÍCH Các hạt ngô
giống MON 810 đại diện dị hợp tử đối với tính trạng GM được sử dụng để xác định
các giá trị Cf và để chuẩn bị các mẫu chưa biết cho các thử nghiệm cộng tác. Chuẩn bị
các mẫu chưa biết của các hỗn hợp bột ngô dùng cho xác nhận giá trị sử dụng ở
các mức độ 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột ngô của giống
ngô trên. Độ đồng nhất của các mẫu tại mỗi mức độ được kiểm tra bằng
cách sử dụng phương pháp định lượng này theo các quy trình của AOAC [34],[39].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giai đoạn đầu nhằm xác định Cf của MON
810. Tất cả các phòng tham gia được nhận các bộ mồi, đoạn dò, mẫu chuẩn và các
ADN được tách chiết từ các hạt ngô giống MON 810, được chuẩn bị bởi Qiagen
DNeasy Plant Maxi kít
41) và sự thích hợp đã được kiểm tra tại NFRI trước cuộc thử nghiệm.
Các ADN đã được sử dụng để đo các số bản sao của trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc
MON 810 và trình tự ADN zSSIIb đặc hiệu taxon ở ngô. Tất cả các phép đo
trong giai đoạn này được lặp lại 3 lần. Tổng cộng 90 bộ dữ liệu thu được từ các
phòng thử nghiệm tham gia. Các tương quan của các đường chuẩn thu được từ các
phòng thử nghiệm tham gia có thể chấp nhận được (r > 0,990).
Theo quy trình thực hiện của AOAC [39], các phòng
thử nghiệm có số lạc bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran (p <0,025) và
kiểm định Grubbs (p <0,025). Sau hai kiểm định, phát hiện một phòng
thử nghiệm có một số lạc Cochran ở tỉ lệ giữa trình tự MON 810 đặc hiệu
cấu trúc với trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon. Không có số lạc quan sát được
ở các tỉ lệ khác, như được trình bày trong Bảng C.22
Bảng C.22 -
Tóm tắt Cf cho MON 810
Trình tự đích
Đặc hiệu cấu
trúc MON 810
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia
15
Số lượng số lạc Cochran
1
Số lượng số lạc Grubbs
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số lượng phòng thử nghiệm được giữ
lại
14
Cfa
0,38 ± 0,01
a Cf được biểu
thị dạng trung bình ± khoảng tin cậy (α =0,05).
Người phân tích có thể xác định lại Cf
bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn ngô MON 810 thích hợp.
Giai đoạn thứ hai thực hiện các thử
nghiệm mù. Các mẫu bột ngô chưa biết được thiết kế thành sáu cặp mù đôi, gồm 0
%, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột ngô biến đổi gen dòng
MON 810 dạng khô trong ngô thông thường. Mẫu trắng 0 % ngô dòng MON 810 được sử dụng để
loại bỏ các phòng thử nghiệm không hợp lệ trước khi phân tích thống kê. Các
phòng tham gia được chỉ dẫn tách chiết ADN từ các mẫu bằng cách sử dụng Qiagen
kít41). Dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm được giữ lại bởi
các kiểm định số lạc được sử dụng để tính toán giá trị trung bình và khoảng tin
cậy (α = 0,05). Các
giá trị trung bình được xác định là Cf dùng cho tính toán hàm lượng GMO (%)
trong các thử nghiệm mù. Giá trị trung bình của Cf cho định lượng đặc hiệu cấu
trúc MON 810 là 0,38.
Mười bốn phòng thử nghiệm tham gia
trong giai đoạn hai đã phân tích 168 mẫu bằng cách khuếch đại trình tự zSSIIb
và trình tự đặc hiệu cấu trúc MON
810. Các phòng thử nghiệm không báo cáo các mẫu trắng là 0 % bị coi là không hợp
lệ và tất cả các dữ liệu của các phòng thử nghiệm này bị loại ra trước khi tiến
hành các kiểm định số lạc. Trong tất cả các thí nghiệm, các tương quan của các
đường chuẩn đã có thể chấp nhận được (r > 0,990).
Các phòng thử nghiệm có giá trị bất thường trong cặp mù đôi ở mỗi mức độ MON
810 bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran và Grubbs [40],[41], tương ứng,
trước khi phân tích thống kê độ chính xác và độ chụm. Năm số lạc Cochran và một
số lạc Grubbs đã được phát hiện trong dữ liệu. Giá trị trung bình, độ chệch, độ
lệch chuẩn tương đối lặp lại (%) và độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) ở mỗi mức
độ trộn được trình bày trong Bảng C.23 [34].
CHÚ THÍCH 2 Các cộng tác
viên không tính toán các kết
quả cuối cùng sử dụng Cf được xác định bởi nghiên cứu cộng tác đầu tiên. Các số
bản sao của mỗi trình tự đích thu được trong các xác định Cf và các thử nghiệm
mù được báo cáo cho NFRI và đơn vị % GMO của các mẫu thử nghiệm mù đã được chuyển đổi
về kết quả cuối cùng bằng cách sử dụng Cf.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mức độ trộn
(%)
0,1
0,5
1
5
10
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia
14
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
14
14
14
Số lượng phòng thử nghiệm không hợp
lệ
0
0
0
0
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2
1
0
1
1
Số lượng số lạc Grubbs
1
0
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0
Số phòng lượng thí nghiệm được giữ lại
11
13
14
13
13
Trung bình hàm lượng
GMO (%)
0,1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,0
4,8
9,8
Độ chệch của giá trị đúng (%)
+25,0
+9,4
+4,6
-4,3
-1,8
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,040
0,082
0,124
0,647
1,028
Giới hạn lặp lại ra (r = 2,8 sr)
0,113
0,231
0,347
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2,879
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)b
32,3
15,1
11,8
13,5
10,5
Độ lệch chuẩn tái lập sRa
0,040
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,158
0,647
1,140
Giới hạn tái lập Ra
(R = 2,8
x sr)
0,113
0,301
0,443
1,813
3,191
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
32,3
19,6
15,1
13,5
11,6
Dưới 20 bảo saoc (Giới hạn
phát hiện tuyệt đối trong phương pháp này)
19/22
0/26
0/28
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0/26
a Được biểu
thị theo đơn vị % GMO.
b Được biểu
thị là tỉ
lệ
phần trăm của giá trị trung bình.
c Được biểu
thị là tỉ lệ của số lượng dữ liệu dưới 20 bản sao được giữ lại với tổng số dữ
liệu được giữ lại.
C.5.2.3 Đặc hiệu phân
tử
C.5.2.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp này được mô tả trong Tài
liệu tham khảo [33], Thông tin về cấu trúc di truyền đưa vào bộ gen ngô sẵn có
trong Tài liệu tham khảo [33] và [46]. Các mồi và đoạn dò TaqMan® 42) để phát triển
phương pháp này được thiết kế bởi thông tin mô tả trong Tài liệu tham khảo [46].
Nếu cấu trúc ADN đưa vào MON 810 sử dụng
cho các sự kiện GM khác, thì có thể thu được kết quả dương tính giả do trình tự
được khuếch đại bắt nguồn từ cấu trúc này.
C.5.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.5.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
Kiểm tra các mẫu bột ngô khô chứa 0 %
đến 10 % (phần khối lượng, được chuẩn bị bởi NFRI) ngô biến đổi gen dòng MON
810 bằng khuếch đại ADN với mồi và đoạn dò đã thu được các sản phẩm PCR dự kiến
[33],[34].
Các nền mẫu được kiểm tra là ngô hạt,
bột kiều mạch ngô, bột ngô và bột ngô xay thô.
Các kiểm tra đặc hiệu trước khi thử
nghiệm cộng tác cho thấy không có phản ứng chéo giữa bộ mồi/ đoạn dò của phương
pháp này với các loài/mẫu không phải đích sau: lúa (Oryza sativa), lúa mì
(Triticum aestivum) và lúa mạch (hordeum vulgare). Không quan sát
thấy phản ứng chéo ở đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2, ở ngô biến đổi gen các
dòng Event176, Bt11, GA21 và T25.
C.5.2.4 Tối ưu hóa
Tối ưu hóa chất phản ứng được thực hiện
trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS (ABI)44)
sử dụng hóa chất TaqMan®44)[43].
Thiết kế mồi và đoạn dò được thực hiện
bằng phần mềm Primer Express® (Applied Biosystems)44).
C.5.2.5 Giới hạn phát
hiện
(LOD)
LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm: 20
bản sao plasmid của mẫu chuẩn (33).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.5.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm: 20
bản sao plasmid của mẫu chuẩn [33).
LOQ tương đối được xác nhận trong thử
nghiệm cộng tác: mẫu chuẩn 0,5 % MON 810.
C.5.3 Điều chỉnh
Chưa có thông tin cụ thể.
C.5.4 Nguyên tắc
Đoạn trình tự đặc hiệu cấu trúc có chiều
dài 113 bp của
MON 810 được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu MON 810. Các sản phẩm
PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time) bằng một đoạn dò oligonucleotit đặc
hiệu MON 810, được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm
phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó,
hóa chất TaqMan®44)
được sử dụng.
Đoạn trình tự đặc hiệu taxon có chiều
dài 151 bp của zSSIIb được khuếch đại bằng PCR trong phản ứng real-time
PCR riêng biệt sử dụng hai mồi đặc hiệu zSSIIb ở ngô, và các sản phẩm
PCR được đo qua mỗi chu trình PCR bằng một đoạn dò TaqMan®44) đặc hiệu
zSSIIb.
Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định
lượng số bản sao ADN được tách chiết từ mẫu chưa biết. Các đường chuẩn riêng biệt
của mỗi bộ mồi/đoạn dò được tạo thành trong cùng một lần chạy khuếch đại phân
tích. Các đường chuẩn gồm năm nồng độ chứa 20, 125, 1 500, 20 000, 250 000 bản
sao ADN plasmid pMul5 45)[33]. Tại mỗi điểm
của năm điểm chuẩn, phép đo được thực hiện ba lần. Các phản ứng lặp lại ba lần
bằng cách sử dụng độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu thử và đo trên hệ thống
phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS (Applied Biosystems)45)
trong cùng một lần chạy phân tích.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.5.5 Thuốc thử
C.5.5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng,
xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
C.5.5.2 Nước
C.5.5.3 TaqMan®
Universal Master Mix 45), 2 x.
C.5.5.4 Mẫu chuẩn (Plasmid)
Mẫu chuẩn được sử dụng để xây dựng và
xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp này là plasmid pMul5 45) [33] có trong bộ plasmid
phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319-04981 )45).
Có thể sử dụng các mẫu chuẩn khác với điều kiện hiệu năng được chứng minh là
tương đương hoặc tốt hơn.
C.5.5.5 Các
oligonucleotit
Các trình tự của các mồi và đoạn dò của
gen đặc hiệu cấu trúc MON 810 và gen đặc hiệu taxon ở ngô được liệt kê trong Bảng
C.24.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tên
Trình tự
ADN oligonucleotit
Nồng độ cuối
trong PCR
Trình tự đích gen đặc hiệu taxon
SSIIb 1-5'
5’-CTC CCA ATC CTT TgA CAT CTg C-3'
500 nmol/l
SSIlb 1-3'
5'-TCg ATT TCT CTC TTg gTg ACA gg-3'
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
SSllb-Taq
5'-FAM-AgC AAA gTC AgA gCg CTg CAA
TgC A-TAMRA-3'
200 nmol/l
Trình tự đích GMO
MON810 2- 5'
5'-gAT gCC TTC TCC CTA gTg TTg A-3'
500 nmol/l
MON810 2- 3'
5'-ggA TgC ACT CgT TgA TgT TTg - 3’
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
MON810-Taq
5'-FAM-AgA TAC CAA gCg gCC ATg gAC
AAC AA -TAMRA-3'
200 nmol/l
FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA:
6-carboxytetramethylrhodamine.
Chiều dài sản phẩm PCR của SSIIb là
151 bp; chiều dài sản phẩm PCR của MON 810 là 113 bp.
C.5.6 Thiết bị, dụng
cụ
C.5.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
C.5.6.2 Máy chu trình
nhiệt
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.5.6.3 Khay và các nắp
ống phản ứng
Khay và các nắp ống phản ứng phải phù
hợp để khuếch đại
PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng ABI
PRISM®, hoặc các nắp quang học MicroAmp® (8 nắp ống/dải,
phẳng) (Applied Biosystems) 46), tương ứng. Các khay phản ứng khác,
lọ nhỏ hoặc các nắp ống phản ứng khác cũng có thể được sử dụng nếu cho kết quả
tương đương hoặc tốt hơn.
C.5.7 Cách tiến
hành: Chuẩn bị PCR
C.5.7.1 Yêu cầu chung
Chuẩn bị PCR cho trình tự đích zSSIIb
đặc hiệu taxon và cho trình tự đích đặc hiệu MON 810 phải được thực hiện trong
các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau
cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.
Phương pháp quy định tổng thể tích PCR
25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng, với các thành phần thuốc thử được nêu ra trong
Bảng C.25 cho zSSIIb và trong Bảng C.26 cho MON 810.
Bảng C.25 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon ở thể tích cuối
cho mỗi ống phản ứng
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2,5 μl
Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase
và dNTP)
TaqMan® Universal PCR
Master Mix (ABI)
12,5 μl
Mồi
SSIIb1-5' và SSIIb1-3' (xem Bảng
C.24)
xem Bảng
C.24
Đoạn dò
SSIIb-Taq (xem Bảng C.24)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng C.26 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại trình tự đặc hiệu MON 810 ở thể tích cuối cho mỗi ống
phản ứng.
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)
2,5 μl
Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase
và dNTP)
TaqMan® Universal PCR
Master Mix (ABI)
12,5 μl
Mồi
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
xem Bảng
C.24
Đoạn dò
MON810-Taq (xem Bảng C.24)
xem Bảng
C.24
C.5.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Mỗi dãy kiểm tra phải bao gồm các kiểm
chứng như quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
Nếu các kiểm chứng không cho ra các kết
quả dự kiến, thì phải hủy kết quả và phân tích phải được lặp lại.
Ít nhất hai phương án lựa chọn thay thế
nên sẵn có để làm kiểm chứng dương/ vật liệu so sánh chuẩn, như sau.
a) ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng
cao được tách chiết từ ngô hạt, có thể sử dụng nếu số lượng ADN được biết, trên
cơ sở tính toán
các số bản sao của trình tự đích từ kích thước bộ gen ngô MON 810.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Theo các yêu cầu đảm bảo chất lượng,
các kiểm chứng dương tốt hơn không nên là các vật liệu so sánh chuẩn.
C.5.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ được
nêu trong Bảng C.27 được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM®
7700 SDS (Applied Biosystems) 47).
Trong thử nghiệm cộng tác, chương
trình sử dụng kết hợp với TaqMan® Universal Master Mix 47).
Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu điều chỉnh phù hợp cụ
thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại Master Mix được
sử dụng.
Bảng C.27 - Các
điều kiện phản ứng
Thời gian s
Nhiệt độ °C
Tiền-PCR: khử nhiễm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
50
Tiền-PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính khuôn mẫu ADN
600
95
PCR (40 chu trình)
Bước 1
Biến tính
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
95
Bước 2
Gắn mồi và kéo dài
60
59
C.5.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
Nếu ngô biến đổi gen khác với MON 810
chứa cùng các
trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc, thì
phương pháp này chỉ thích hợp cho định lượng ADN MON 810 khi không có mặt các
GMO khác.
Phương pháp này chỉ phù hợp để đo tỉ lệ
giữa trình tự đặc hiệu cấu trúc MON 810 với trình tự zSSIIb đặc hiệu
taxon ở ngô. Tỉ lệ này phản ánh lượng MON 810 trong ngô nghiên cứu. Phương pháp
này chỉ xác nhận giá trị sử dụng cho ngô hạt.
Thử nghiệm cộng tác là một nguồn dữ liệu
giá trị để hỗ trợ cho việc ước lượng độ không đảm bảo đo. Cần xác định bất kỳ
nguồn không đảm bảo đo nào mà không được bao gồm trong dữ liệu của thử nghiệm cộng
tác, như lấy mẫu và những
vấn đề khác, theo yêu cầu quốc tế [44],[45].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Người phân tích phải xác định giá trị ngưỡng
để xác định chu kì ngưỡng (Ct).
Ví dụ về các thủ tục sau khi phân tích
PCR có sẵn trong Hướng dẫn của nhà sản xuất bộ plasmid phát hiện ngô biến đổi
gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319-04981)48). Xem Tài liệu
tham khảo [33].
Giá trị Cf cho định lượng đặc hiệu cấu
trúc MON 810 và plasmid chuẩn được sử dụng trong thử nghiệm cộng tác là 0,38.
Tính lượng ngô biến đổi gen trong mẫu thử nghiệm, w, theo phương
trình sau:
w = 
Trong đó:
NGM là số lượng bản sao
của trình tự đích đặc hiệu GM trong ADN mẫu thử nghiệm.
NTX là số lượng bản sao
của trình tự đích đặc hiệu taxon trong ADN mẫu thử nghiệm.
C.6 Phương pháp đặc
hiệu cấu trúc để định lượng ADN ngô dòng Event176 sử dụng real-time PCR
C.6.1 Giới thiệu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH Cf được sử dụng để tính toán
hàm lượng GMO (%, theo khối lượng) từ số bản sao ADN GMO của các trình tự
đặc hiệu đích và các trình tự đặc hiệu taxon. Cf có thể được đo bằng tỉ lệ giữa
số bản sao trình tự đặc hiệu đích với trình tự đặc hiệu taxon từ một mẫu chuẩn
thích hợp.
Các hạn chế, xem C.6.8.
C.6.2 Xác nhận giá
trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng
C.6.2.1 Yêu cầu
chung
Phương pháp này được tối ưu trên thiết
bị real-time PCR ABI PRISM® 7700 SDS 48) sử dụng plasmid
pMul5 làm chuẩn [33]. plasmid
pMul5 trong các sản
phẩm PCR riêng biệt được khuếch đại từ các hệ thống PCR để khuếch đại đặc hiệu
trình tự taxon ở ngô (zSSIIb), trình tự promotor 35S ở virút khảm súp lơ
(p35S), trình tự kết thúc của nopaline synthase (tNOS), và trình tự đặc hiệu cấu
trúc của MON 810, Event176, Bt11, GA21 và T25.
CHÚ THÍCH plasmid được sử dụng làm chuẩn
để xác định các hàm lượng GM được tính từ các số bản sao tương đối của các trình
tự ADN đặc hiệu GM và các trình tự ADN đặc hiệu taxon.
Đã kiểm tra độ lặp lại và độ tái lập của
phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng mẫu chuẩn và bột
ngô khô chưa biết là hỗn hợp của ngô Event176 và ngô thông thường [34].
Số bản sao của các trình tự
đặc hiệu taxon (zSSIIb) trong bộ gen được đánh giá cho 20 giống ngô đại
diện.
Phương pháp được công bố trong các
tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản và Hàn Quốc [35],[36],[37],[38].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia thử
nghiệm trên tổng số 12 mẫu ngô chưa biết có chứa khoảng 0 % và 10 %
(theo khối lượng) bột ngô khô có nguồn gốc từ dòng Event176.
CHÚ THÍCH 1: Các hạt ngô giống Bt176 đại
diện, dị hợp tử đối với tính trạng GM
được sử dụng để xác định các giá trị Cf và để chuẩn bị các mẫu chưa biết cho
các thử nghiệm cộng tác. Chuẩn bị các mẫu chưa biết của các hỗn hợp bột ngô
dùng cho xác nhận giá trị sử dụng ở các mức độ 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và
10 % (theo khối lượng) bột ngô của giống ngô trên. Độ đồng nhất của các mẫu tại
mỗi mức độ được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp định lượng này theo các
quy trình của AOAC [34],[39].
Phương pháp này đã được xác nhận giá
trị sử dụng cho ngô Event176 trong một thử nghiệm cộng tác theo quy trình của AOAC
[39]. Thử nghiệm
cộng tác được tổ chức bởi Viện nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (NFRI, Tsukuba, Nhật
Bản), cùng với Trung tâm cấp nhãn hiệu Chất lượng Thực phẩm và Dịch vụ Người
tiêu dùng, Saitama, Nhật Bản và Viện Khoa học Sức khỏe Quốc gia, Tokyo, Nhật Bản.
Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia bao gồm các phòng thử nghiệm của Nhật Bản,
Hàn Quốc và Mỹ thực hiện các thử nghiệm cộng tác trên hệ thống phát hiện trình
tự ABI PRISM® 7700 SDS 49) (Applied Biosystems)
trong hai giai đoạn riêng biệt. Tất cả các phòng thử nghiệm tham gia được yêu cầu
phải tuân theo các quy trình tách chiết ADN và PCR định lượng.
Giai đoạn đầu nhằm xác định Cf của
Event176. Tất cả các phòng thử nghiệm tham gia được nhận các bộ mồi, đoạn dò, mẫu
chuẩn và các ADN được tách chiết từ các hạt ngô giống Event176, được chuẩn bị bởi
Qiagen DNeasy Plant Maxi kít
49) và sự thích hợp đã được kiểm tra tại NFRI trước cuộc thử nghiệm.
Các ADN đã được sử dụng để đo các số bản sao của trình tự ADN zSSIIb đặc
hiệu taxon ở ngô và trình tự đặc hiệu cấu trúc Event176. Tất cả các phép đo
trong giai đoạn này được lặp lại ba lần. Tổng cộng 90 bộ dữ liệu thu được từ
các phòng thử nghiệm tham gia.
Các tương quan của các đường chuẩn trong dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm
tham gia có thể chấp nhận được (r > 0,990). Theo quy
trình thực hiện của AOAC [39], các phòng thử nghiệm có số lạc bị loại
bỏ bằng kiểm định Cochran (p < 0,025) và kiểm định Grubbs (p
< 0,025). Không có phòng thử nghiệm có số lạc được quan sát thấy trong các
kiểm định này, như được trình bày trong Bảng C.28.
Bảng C.28 -
Tóm tắt Cf3 cho Event176
Trình tự đích
Đặc hiệu cấu trúc
Event176
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia
15
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0
Số lượng số lạc Grubbs
0
Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại
15
Cfa
2,05 ± 0,04
a Cf được biểu
thị dạng trung bình ± khoảng tin cậy (α = 0,05).
Người phân tích có thể xác định lại
giá trị Cf bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn ngô Event176 thích hợp.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mười bốn phòng thử nghiệm tham gia
trong giai đoạn thứ hai đã phân tích 168 mẫu bằng cách khuếch đại trình tự zSSIIb
và trình tự đặc hiệu cấu trúc Event176. Các phòng thử nghiệm không báo cáo các
mẫu trắng là 0 % bị coi là không hợp lệ và tất cả các dữ liệu của các phòng thử
nghiệm này bị loại ra trước khi tiến hành các kiểm định số lạc. Trong tất cả
các thí nghiệm, các tương quan của các đường chuẩn đã có thể chấp nhận được (r
> 0,990). Các phòng thử nghiệm có giá trị bất thường trong cặp mù đôi ở mỗi
mức độ Event176 bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran và Grubbs [40], [41], tương ứng,
trước khi phân tích thống kê độ chính xác và độ chụm. Bốn số lạc Cochran đã được
phát hiện trong dữ liệu. Giá trị trung bình, độ chệch, độ lệch chuẩn tương đối
lặp lại (%) và độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) ở mỗi mức độ trộn được trình
bày trong Bảng C.29.
CHÚ THÍCH 2: Các cộng tác viên không
tính toán các kết quả cuối cùng sử dụng Cf được xác định bởi nghiên cứu cộng
tác đầu tiên. Các số bản sao của mỗi trình tự đích thu được trong các xác định
Cf và các thử nghiệm mù được báo cáo cho NFRI và đơn vị % GMO của các mẫu thử
nghiệm mù được chuyển đổi về kết quả cuối cùng bằng cách sử dụng Cf.
Bảng C.29 -
Tóm tắt xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng ngô Event176 đặc hiệu cấu
trúc
Mức độ trộn
(%)
0,1
0,5
1
5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia
14
14
14
14
14
Số lượng phòng thử nghiệm không hợp
lệ
1
1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
1
Số lượng số lạc Cochran
1
2
0
0
1
Số lượng số lạc Grubbs
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0
0
0
0
Số phòng thử nghiệm được giữ lại
12
11
13
13
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trung bình hàm lượng GMO (%)
0,1
0,5
0,9
5,0
9,6
Độ chệch của giá trị đúng (%)
+ 11,3
-1,6
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,0
-3,8
Độ lệch chuẩn lặp lại sra
0,018
0,029
0,066
0,406
0,554
Giới hạn lặp lại ra (r = 2,8 sr)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,080
0,184
1,137
1,552
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)b
16,3
5,8
7,1
8,1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Độ lệch chuẩn tái lập sRa
0,024
0,051
0,106
0,559
0,917
Giới hạn tái lập Ra (R =2,8 x sR)
0,066
0,142
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,565
2,566
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)b
21,3
10,3
11,4
11,2
9,5
Dưới 20 bản saoc (giới hạn
phát hiện tuyệt đối trong phương pháp này)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0/22
0/26
0/26
0/24
a Được biểu
thị theo đơn vị % GMO.
b Được biểu
thị là tỉ lệ phần
trăm của giá trị trung bình.
c Được biểu
thị là tỉ lệ của số
lượng dữ liệu dưới 20 bản sao được giữ lại với tổng số dữ liệu được giữ lại.
C.6.2.3 Đặc hiệu phân
tử
C.6.2.3.1 Yêu cầu chung
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nếu cấu trúc ADN đưa vào Event176 được
sử dụng cho các sự kiện GM khác, thì có thể thu được kết quả dương tính giả do
trình tự được khuếch đại bắt nguồn từ cấu trúc này.
C.6.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu DDBJ 51) (ngày
3 tháng 12 năm 1999) và các tài liệu đánh giá sự an toàn được công bố bởi Bộ Y
tế, Lao động và Phúc lợi Nhật Bản, và Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Nhật
Bản, sử dụng các trình tự nucleotit như là chuỗi truy vấn với chương trình
BLASTN 2.2.3 50). Các kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận một sự
tương đồng hoàn toàn chỉ với trình tự đích dự kiến.
C.6.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
Kiểm tra các mẫu bột ngô khô chứa 0 %
đến 10 % (phần khối lượng, được chuẩn bị bởi NFRI) ngô biến đổi gen Event176 bằng
khuếch đại ADN với mồi và đoạn dò đã thu được các sản phẩm PCR dự kiến [33],[34].
Các nền mẫu được kiểm tra là ngô hạt,
bột kiều mạch ngô, bột ngô và bột ngô xay thô.
Các kiểm tra đặc hiệu trước khi thử nghiệm
cộng tác cho thấy không có phản ứng chéo giữa bộ mồi/đoạn dò với các loài/mẫu
không phải đích sau: lúa (Oryza sativa), lúa mì (Triticum aestivum) và lúa mạch
(Hordeum vulgare). Không quan sát thấy phản ứng chéo ở đậu tương biến đổi gen
dòng GTS 40-3-2, ở ngô biến đổi gen các dòng MON 810, Bt11, GA21 và T25.
C.6.2.4 Tối ưu hóa
Tối ưu hóa chất phản ứng được thực hiện
trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS (ABI) sử dụng
hóa chất TaqMan® 50) [43].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.6.2.5 Giới hạn phát
hiện
(LOD)
LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn [33].
LOD tương đối được xác nhận trong các
thử nghiệm cộng tác: 0,1 % Event176.
C.6.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn [33].
LOQ tương đối được xác nhận trong các
thử nghiệm cộng tác: 0,1 % Event176.
C.6.3 Điều chỉnh
Chưa có thông tin cụ thể.
C.6.4 Nguyên tắc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đoạn đặc hiệu taxon có chiều dài 151
bp của zSSIIb được khuếch đại bằng phản ứng real-time PCR riêng biệt sử
dụng cặp mồi đặc hiệu cho zSSIIb, và các sản phẩm PCR được đo qua mỗi
chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan® 52) đặc hiệu zSSIIb.
Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định
lượng số bản sao ADN được tách chiết từ mẫu chưa biết. Đường chuẩn riêng biệt của
mỗi bộ mồi/đoạn dò được tạo thành trong cùng một lần chạy khuếch đại phân tích.
Các đường chuẩn gồm năm nồng độ chứa 20, 125, 1 500, 20 000, 250 000 bản sao
ADN plasmid pMul5 52). Tại mỗi điểm của năm điểm chuẩn, phép đo được
thực hiện ba lần. Các phản ứng lặp lại ba lần bằng cách sử dụng độ pha loãng
thích hợp của ADN mẫu thử và đo trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM®
7700 SDS (Applied Biosystems) trong cùng một lần chạy phân tích.
Các giá trị Ct xác định cho
các điểm chuẩn của zSSIIb hoặc đích đặc hiệu cấu trúc Event176, tương ứng,
được vẽ đồ thị đối với logarit số bản sao ADN plasmid pMul5 [33] để thiết lập
một đường chuẩn, số bản sao ADN mẫu kiểm tra có được bằng cách nội suy từ các
đường chuẩn. Để xác định lượng Event176 trong mẫu kiểm tra, lấy số bản sao của
cấu trúc Event176 chia cho số bản sao gen zSSIIb và Cf của Event176 đặc
hiệu cấu trúc, nhân với 100 để có được tỉ lệ phần trăm như mô tả trong C.6.9.
C.6.5 Thuốc thử
C.6.5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng,
xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
C.6.5.2 Nước
C.6.5.3 TaqMan®
Universal Master Mix 52), 2 x.
C.6.5.4 Mẫu chuẩn (Plasmid)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.6.5.5 Các
oligonucleotit
Trình tự của của các mồi và đoạn dò của
gen đặc hiệu cấu trúc Event176 và gen đặc hiệu taxon ở ngô được liệt kê trong Bảng
C.30.
Bảng C.30 -
Các oligonucleotit
Tên
Trình tự
ADN oligonucleotit
Nồng độ cuối
trong PCR
Trình tự đích gen đặc hiệu taxon
SSIIb 1-5'
5’-CTC CCA ATC CTT TgA CAT CTg C-3'
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
SSIIb 1-3'
5'-TCg ATT TCT CTC TTg gTg ACA gg-3'
500 nmol/l
SSIIb-Taq
5'-FAM-AgC AAA gTC AgA gCg CTg CAA
TgC A-TAMRA-3'a
200 nmol/l
Trình tự đích GMO
E176 2-5’
5'-TgT TCA CCA gCA gCA ACC Ag-3'
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
E176 2-3'
5'-ACT CCA CTT TgT gCA gAA CAg ATC
T-3'
500 nmol/l
E176-Taq
5'-FAM-CCg ACg TgA CCg ACT ACC ACA
TCg A -TAMRA-3’a
200 nmol/l
a FAM:
6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.
Chiều dài sản phẩm PCR của SSIIb là
151 bp; chiều dài sản phẩm PCR của Event176 là 100 bp.
C.6.6 Thiết bị, dụng
cụ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
C.6.6.2 Máy chu trình
nhiệt
Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được
thử nghiệm với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS
(Applied Biosystems) 53) trong thời gian thử nghiệm cộng tác.
Các thiết bị real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh thích hợp
các điều kiện phản ứng.
C.6.6.3 Khay và các nắp
ống phản ứng
Khay và các nắp ống phản ứng phải phù
hợp để khuếch đại PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng
quang học 96 giếng ABI PRISM®, hoặc các nắp quang học MicroAmp®
(8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems) 53), tương ứng. Các khay
phản ứng, lọ nhỏ hoặc nắp ống phản ứng khác cũng có thể được sử dụng nếu cho kết
quả tương đương hoặc tốt hơn.
C.6.7 Cách tiến
hành: Chuẩn bị PCR
C.6.7.1 Yêu cầu chung
Chuẩn bị PCR cho trình tự đích zSSIIb
đặc hiệu taxon và cho trình tự đích đặc hiệu Event176 phải được thực hiện trong
các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau
cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hoặc xác nhận giá trị sử dụng.
Phương pháp quy định tổng thể tích PCR
25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng, với các thành phần thuốc thử như liệt kê trong
Bảng C.31 đối với zSSIIb và trong Bảng C.32 đối với Event176.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)
2,5 μl
Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase
và dNTP)
TaqMan® Universal PCR
Master Mix (ABI)
12,5 μl
Mồi
SSIIb1-5' và SSIIb1-3' (xem Bảng
C.30)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đoạn dò
SSIIb-Taq (xem Bảng C.30)
xem Bảng
C.30
Bảng C.32 - Hỗn
hợp phản ứng
khuếch đại trình tự đặc hiệu Event176 ở thể tích cuối cho mỗi ống phản ứng.
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)
2,5 μl
Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase
và dNTP)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
12,5 μl
Mồi
E176 2-5' và E176 2-3' (xem Bảng
C.30)
xem Bảng
C.30
Đoạn dò
E176-Taq (xem Bảng C.30)
xem Bảng
C.30
C.6.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Mỗi dãy kiểm tra phải bao gồm các kiểm
chứng như quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Ít nhất hai phương án lựa chọn thay thế nên sẵn
có để làm kiểm chứng dương/vật liệu so sánh chuẩn, như sau.
a) ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng
cao được tách chiết từ ngô hạt có thể sử dụng nếu số lượng ADN được biết, trên
cơ sở tính toán các số bản sao của trình tự đích từ kích thước bộ gen ngô
Event176.
b) Một plasmid chứa các trình tự đích
có thể được bổ sung ở các nồng
độ khác nhau với các số lượng bản sao đã biết. Plasmid này có trong bộ
Plasmid phát
hiện ngô biến đổi gen
(Fasmac No. PS-2 và Nippon Gene No. 310-04981) 54) [33].
Theo yêu cầu đảm bảo chất lượng, các
kiểm chứng dương tốt hơn không nên là các vật liệu so sánh chuẩn.
C.6.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ được
nêu trong Bảng C.33 được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM®
7700 SDS (Applied Biosystems) 54).
Trong thử nghiệm cộng tác, chương
trình được sử dụng kết hợp với TaqMan® Universal Master Mix 54).
Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu điều chỉnh phù hợp cụ
thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại Master Mix được
sử dụng.
Bảng C.33 -
Các điều kiện phản ứng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nhiệt độ °C
Tiền PCR: khử nhiễm
120
50
Tiền PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính khuôn mẫu ADN
600
95
PCR (40 chu trình)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bước 1
Biến tính
30
95
Bước 2
Gắn mồi và kéo dài
60
59
C.6.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp này chỉ phù hợp để đo tỉ lệ
giữa trình tự đặc hiệu cấu trúc Event176 với trình tự zSSIIb đặc hiệu
taxon ở ngô. Tỉ lệ này phản ánh lượng Event176 trong ngô nghiên cứu. Phương
pháp này chỉ xác nhận giá trị sử dụng cho ngô hạt.
Thử nghiệm cộng tác là một nguồn dữ liệu
giá trị để hỗ trợ cho việc ước lượng độ không đảm bảo đo. Cần xác định bất kỳ
nguồn không đảm bảo đo nào mà không được bao gồm trong dữ liệu của thử nghiệm cộng
tác, như lấy mẫu và những vấn đề khác, theo yêu cầu quốc tế [44],[45].
C.6.9 Hiệu chuẩn và
tính kết quả
Người phân tích phải xác định giá trị
ngưỡng để xác định chu kì ngưỡng (Ct).
Các ví dụ về các thủ tục sau khi phân
tích PCR có sẵn trong Hướng dẫn của nhà sản xuất bộ plasmid phát hiện ngô biến
đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319-04.981). Xem Tài liệu tham khảo
[33].
Giá trị Cf cho định lượng đặc hiệu cấu
trúc Event176 và plasmid chuẩn được sử dụng trong các thử nghiệm cộng tác là
2,05. Tính lượng ngô biến đổi gen trong mẫu thử nghiệm theo phương trình sau:
w = 
Trong đó:
NGM là số lượng bản sao
của trình tự đích đặc hiệu GM trong ADN mẫu thử nghiệm;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.7 Phương pháp đặc
hiệu cấu trúc để định lượng ADN ngô dòng Bt11 sử dụng realtime PCR
C.7.1 Giới thiệu
Phụ lục này mô tả phương pháp phát hiện
và định lượng gen đặc hiệu taxon của ngô (gen tổng hợp tinh bột ngô llb: zSSIIb)
và vùng nối cấu trúc ADN đặc hiệu giữa gen tổng hợp crylA(b) có nguồn gốc
từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis với trình tự intron của gen Adh1
mã hóa enzyme khử hydro của alcohol trong ngô biến đổi gen Bt11, dựa trên
real-time PCR bằng cách sử dụng plasmid làm chuẩn để định lượng tương đối Bt11
qua sử dụng hệ số chuyển đổi (Cf) là tỉ lệ của các số bản sao giữa các trình tự ADN
đặc hiệu cấu trúc với các trình tự ADN đặc hiệu taxon trong ngô hạt đại diện
cho dòng Bt11 thuần chủng.
CHÚ THÍCH Cf được sử dụng để tính toán hàm lượng
GMO (%, theo khối lượng) từ số bản sao ADN GMO của các trình tự đặc hiệu đích
và các trình tự đặc hiệu taxon. Cf có thể được đo bằng tỉ lệ giữa số bản sao
trình tự đặc hiệu đích với trình tự đặc hiệu taxon từ một mẫu chuẩn thích hợp.
Các hạn chế, xem C.7.8.
C.7.2 Xác nhận giá
trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng
C.7.2.1 Yêu cầu chung
Phương pháp này được tối ưu trên thiết
bị real-time PCR ABI PRISM® 7700 SDS 55) sử dụng
plasmid pMul5
làm chuẩn [33]. Plasmid pMul5 trong các sản phẩm PCR riêng biệt được khuếch
đại từ các hệ thống PCR để khuếch đại đặc hiệu trình tự taxon ở ngô (zSSIIb),
trình tự promotor 35S ở virút khảm súp lơ (p35S), trình tự kết thúc của
nopaline synthase (tNOS), và trình tự đặc hiệu cấu trúc của MON 810, Event176,
Bt11, GA21 và T25.
CHÚ THÍCH plasmid được sử dụng làm chuẩn
để xác định các hàm lượng GM được tính từ các số bản sao tương đối của các trình
tự ADN đặc hiệu GM và các trình tự ADN đặc hiệu taxon.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số bản sao của các trình tự đặc hiệu
taxon (zSSIIb) trong bộ gen được đánh giá cho 20 giống ngô đại diện.
Phương pháp được công bố trong các
tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản và Hàn Quốc [35],[36],[37],[38].
C.7.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia thử
nghiệm trên tổng số 12 mẫu ngô chưa biết có chứa khoảng 0 % đến 10 % (theo khối
lượng) bột ngô khô có nguồn gốc từ dòng Bt11.
CHÚ THÍCH 1 Các hạt ngô giống Bt11 đại diện, dị
hợp tử đối với tình trạng GM
được sử dụng để xác định các giá trị Cf và để chuẩn bị các mẫu chưa biết cho
các thử nghiệm cộng tác. Chuẩn bị các mẫu chưa biết của các hỗn hợp bột ngô
dùng cho xác nhận giá trị sử dụng ở các mức độ 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và
10 % (theo khối lượng) của bột ngô khô có nguồn gốc từ giống ngô trên. Độ đồng
nhất của các mẫu tại mỗi mức độ được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp định
lượng này theo các quy trình của AOAC [34],[39].
Phương pháp đã được xác nhận giá trị sử
dụng cho ngô Bt11 trong một thử nghiệm cộng tác theo quy trình của AOAC [39]. Thử nghiệm
cộng tác được tổ chức bởi Viện Nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (NFRI, Tsukuba, Nhật
Bản), cùng với Trung tâm cấp nhãn hiệu Chất lượng Thực phẩm và Dịch vụ Người
tiêu dùng, Saitama, Nhật Bản và Viện Khoa học Sức khỏe Quốc gia, Tokyo, Nhật Bản.
Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia bao gồm các phòng thử nghiệm của Nhật Bản,
Hàn Quốc và Mỹ thực hiện các thử nghiệm cộng tác trên hệ thống phát hiện trình
tự ABI PRISM® 7700 SDS (Applied Biosystems)55)
trong hai giai đoạn riêng biệt. Tất cả các phòng thử nghiệm tham gia được yêu cầu
phải tuân theo các quy trình tách chiết ADN và PCR định lượng.
Giai đoạn đầu nhằm xác định Cf của
Bt11. Tất cả các phòng thử nghiệm tham gia được nhận các bộ mồi, đoạn dò, mẫu
chuẩn và các ADN được tách chiết từ các hạt ngô giống Bt11, được chuẩn bị bởi
Qiagen DNeasy Plant Maxi kit 56) và sự thích
hợp của nó đã được kiểm tra tại NFRI trước cuộc thử nghiệm [34]. Các ADN đã
được sử dụng để đo các số bản sao của trình tự ADN zSSIIb đặc hiệu taxon
ở ngô và trình tự đặc hiệu cấu trúc Bt11. Tất cả các phép đo trong giai đoạn
này được lặp lại ba lần. Tổng cộng 135 bộ dữ liệu thu được từ các phòng thử
nghiệm tham gia. Các tương quan của các đường chuẩn trong dữ liệu thu được từ
các phòng thử nghiệm tham gia có thể chấp nhận được (r > 0,990). Theo
quy trình thực hiện của AOAC [39], các phòng thử nghiệm có số lạc bị
loại bỏ bằng kiểm định Cochran (p < 0,025) và kiểm định Grubbs (p
< 0,025). Không có phòng thử nghiệm có số lạc được quan sát thấy trong các
kiểm định này, như được trình bày trong Bảng C.34.
Bảng C.34 -
Tóm tắt Cf cho Bt11
Trình tự đích
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia
15
Số lượng số lạc
Cochran
0
Số lượng số lạc Grubbs
0
Số lượng phòng thử nghiệm được giữ
lại
15
Cfa
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a Cf được biểu
thị dạng trung bình ± khoảng tin cậy (a = 0,05).
Người phân tích có thể xác định lại
giá trị Cf bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn ngô dòng Bt11 phù hợp.
Giai đoạn hai thực hiện các thử nghiệm
mù. Các mẫu bột ngô chưa biết được thiết kế thành sáu cặp mù đôi, gồm 0 %, 0,1
%, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột ngô biến đổi gen dòng Bt11 dạng
khô trong ngô thông thường. Mẫu trắng Bt11 0 % được sử dụng để loại bỏ các phòng thử nghiệm
không hợp lệ trước khi phân tích thống kê. Các phòng tham gia được chỉ dẫn tách
chiết ADN từ các mẫu bằng cách sử dụng Qiagen kít. Dữ liệu thu được từ các
phòng thử nghiệm được giữ lại bởi các kiểm định số lạc được sử dụng để tính
toán giá trị trung bình và khoảng tin cậy (α = 0,05). Các giá trị trung bình được
xác định là Cf dùng cho tính toán hàm lượng GMO (%) trong các thử nghiệm mù.
Giá trị trung bình của Cf cho định lượng đặc hiệu cấu trúc Bt11 là 0,5.
Mười bốn phòng thử nghiệm tham gia
trong giai đoạn thứ hai đã phân tích 168 mẫu bằng cách khuếch đại trình tự zSSIIb
và trình tự đặc hiệu cấu trúc Bt11. Các phòng thử nghiệm không báo cáo các mẫu
trắng là 0 % bị coi là không hợp lệ và tất cả các dữ liệu của các phòng thử
nghiệm này bị loại ra trước khi tiến hành các kiểm định số lạc. Trong tất cả
các thí nghiệm, các tương quan của các đường chuẩn có thể chấp nhận được (r
> 0,990). Các phòng thử nghiệm có giá trị bất thường trong cặp mù đôi ở mỗi
mức độ Bt11 bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran và Grubbs [40],[41], tương ứng,
trước khi phân tích thống kê độ chính xác và độ chụm. Hai số lạc Cochran và một
số lạc Grubbs đã được phát hiện trong dữ liệu. Giá trị trung bình, độ chệch, độ
lệch chuẩn tương đối lặp lại (%) và độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) ở mỗi mức
độ trộn được trình bày trong Bảng C.35.
CHÚ THÍCH 2 Các cộng tác viên không
tính toán các kết quả cuối cùng sử dụng Cf được xác định bởi nghiên cứu cộng
tác đầu tiên. Các số bản sao của mỗi trình tự đích thu được trong các xác định
Cf và các thử nghiệm mù được báo cáo cho NFRI và đơn vị % GMO của các
mẫu thử nghiệm mù được chuyển đổi về kết quả cuối cùng bằng cách sử dụng Cf.
Bảng C.35 -
Tóm tắt thống kê độ chính xác và độ chụm cho real-time PCR định lượng Bt11
Mức độ trộn
(%)
0,1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
5
10
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia
Số lượng phòng thử nghiệm không hợp
lệ
Số lượng số lạc Cochran
Số lượng số lạc Grubbs
Số phòng thử nghiệm được giữ lại
Trung bình hàm lượng
GMO (%)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Độ lệch chuẩn lặp lại sra
Giới hạn lặp lại ra (r
= 2,8 x sr)
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)b
Độ lệch chuẩn tái lập sRa
Giới hạn tái lập Ra
(R = 2,8 x sR)
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)b
Dưới 20 bản saoc (giới hạn
phát hiện tuyệt đối trongphương pháp này)
14
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
11
0,1
-9,0
0,020
0,057
22,3
0,020
0,057
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
21/22
14
0
0
0
14
0,5
+2,0
0,121
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
23,7
0,121
0,338
23.7
0/28
14
0
0
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,2
+14,7
0,216
0,606
18,9
0,216
0,606
18.9
0/28
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0
0
0
14
6,1
+21,6
0,830
2.325
13,7
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2.325
13.7
0/28
14
0
0
0
14
12,1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,258
3,524
10,4
1,389
3,889
11.5
0/28
a Được biểu
thị theo đơn vị % GMO.
b Được biểu
thị là tỉ lệ phần
trăm của giá trị trung bình.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.7.2.3 Đặc hiệu
phân tử
C.7.2.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp này được mô tả trong Tài
liệu tham khảo [33]. Thông tin về cấu trúc di truyền đưa vào bộ gen ngô sẵn có
trong tài liệu tham khảo [33] và [46]. Các mồi và đoạn dò TaqMan® 57) để phát triển
phương pháp được thiết kế bằng thông tin mô tả trong Tài liệu tham khảo [46].
Nếu cấu trúc ADN đưa vào Bt11 được sử
dụng cho các sự kiện GM khác, thì có thể thu được kết quả dương tính giả do
trình tự được khuếch đại bắt nguồn từ cấu trúc này.
C.7.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu DDBJ 58) (ngày 3
tháng 12 năm 1999) và các tài liệu đánh giá sự an toàn được công bố bởi Bộ Y tế,
Lao động và Phúc lợi Nhật Bản, và Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Nhật Bản,
sử dụng các trình tự nucleotit như là chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN
2.2.3
57). Các kết quả
của việc tìm kiếm đã xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với trình tự đích
dự kiến.
C.7.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
Kiểm tra các mẫu bột ngô khô chứa 0 %
đến 10 % (phần khối lượng, được chuẩn bị bởi NFRI) ngô biến đổi gen dòng Bt11 bằng
khuếch đại ADN với mồi và đoạn dò thu được sản phẩm PCR dự kiến[33].
Các nền mẫu được kiểm tra là ngô hạt,
bột kiều mạch ngô, bột ngô và bột ngô xay thô.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.7.2.4 Tối ưu hóa
Tối ưu hóa chất phản ứng được thực hiện
trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS 59) (ABI)
sử dụng hóa chất TaqMan® 59)[43].
Thiết kế mồi và đoạn dò được thực hiện
bằng phần mềm Primer Express® (Applied Biosystems)59).
C.7.2.5 Giới hạn phát
hiện
(LOD)
LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn [33].
LOD tương đối được xác nhận trong các
thử nghiệm cộng tác: 0,5 % Bt11.
C.7.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn [33].
LOQ tương đối được xác nhận trong các
thử nghiệm cộng tác: 0,5 % Bt11.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chưa có thông tin cụ thể.
C.7.4 Nguyên tắc
Đoạn trình tự đặc hiệu cấu trúc có chiều
dài 127 bp của Bt11 được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho Bt11.
Sản phẩm PCR
được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu
cho Bt11 được đánh dấu bằng hai loại
thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc
nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan® 59) được sử dụng.
Đoạn trình tự đặc hiệu taxon có chiều
dài 151 bp của zSSIIb được khuếch đại bằng phản ứng real-time PCR riêng
biệt sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho zSSIIb, và các sản phẩm PCR được đo
qua mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan® 59) đặc hiệu zSSIIb.
Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định
lượng số bản sao ADN được tách chiết từ mẫu chưa biết. Đường chuẩn riêng biệt của
mỗi bộ mồi/đoạn dò được tạo thành trong cùng một lần chạy khuếch đại phân tích.
Các đường chuẩn gồm năm nồng độ chứa 20, 125, 1 500, 20 000, 250 000 bản sao
ADN plasmid pMul5. Tại mỗi điểm của năm điểm chuẩn, phép đo được thực hiện ba lần.
Các phản ứng lặp lại ba lần bằng cách sử dụng độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu
thử và đo trên hệ
thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS59) trong
cùng một lần chạy phân tích.
Các giá trị Ct xác định cho
các điểm chuẩn của zSSIIb hoặc đích đặc hiệu cấu trúc Bt11, tương ứng,
được vẽ đồ thị đối với logarit số bản sao ADN plasmid pMul5 59)[33]
để thiết lập một đường chuẩn, số bản sao ADN mẫu kiểm tra có được bằng cách nội
suy từ các đường chuẩn. Để xác định lượng Bt11 trong mẫu kiểm tra, lấy số bản
sao của cấu trúc Bt11 chia cho số bản sao gen zSSIIb và Cf của Bt11 đặc
hiệu cấu trúc, nhân với 100 để có được tỉ lệ phần trăm như mô tả trong C.7.9.
C.7.5 Thuốc thử
C.7.5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng,
xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.7.5.3 TaqMan®
Universal Master Mix 60), 2x.
C.7.5.4 Mẫu chuẩn (Plasmid)
Mẫu chuẩn được sử dụng để xây dựng và xác nhận
giá trị sử dụng của phương pháp này là plasmid pMul5 [33] có trong bộ plasmid
phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319- 04 9 81)[33] 60). Có thể sử dụng các mẫu chuẩn khác với điều kiện hiệu năng được chứng
minh là tương đương hoặc tốt hơn.
C.7.5.5 Các
oligonucleotit
Trình tự của các mồi và đoạn dò của
gen đặc hiệu cấu trúc Bt11 và gen đặc hiệu taxon ở ngô được liệt kê trong Bảng
C.36.
Bảng C.36 -
Các oligonucleotit
Tên
Trình tự
ADN oligonucleotit
Nồng độ cuối
trong PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
SSIIb 1-5'
5-CTC CCA ATC CTT TgA CAT CTg C-3'
500 nmol/l
SSIIb 1-3'
5-TCg ATT TCT CTC TTg gTg ACA gg-3’
500 nmol/l
SSIIb-Taq
5'-FAM-AgC AAA gTC AgA gCg CTg CAA
TgC A-TAMRA-3' a
200 nmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bt11 3-5'
5-AAA AgA CCA CAA CAA gCC gC-3'
500 nmol/l
Bt11 3-3'
5-CAA TgC gTT CTC CAC CAA gTA CT-3'
500 nmol/l
Bt11-2-Taq
5-FAM- CgA CCA Tgg ACA ACA ACC CAA
ACA TCA-TAMRA-3' a
200 nmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chiều dài sản phẩm PCR của
SSIIb là 151 bp; chiều dài sản phẩm PCR của Bt11 là 127 bp.
C.7.6 Thiết bị, dụng
cụ
C.7.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
C.7.6.2 Máy chu trình
nhiệt
Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được
thử nghiệm với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS
(Applied Biosystems)61) trong thời gian thử nghiệm cộng tác.
Các thiết bị real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp
các điều kiện phản ứng.
C.7.6.3 Khay và các nắp
ống phản ứng
Khay và các nắp ống phản ứng phải phù
hợp để khuếch đại PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng
quang học 96 giếng ABI PRISM®, hoặc các nắp quang học MicroAmp®
(8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems) 61), tương ứng. Các
khay, lọ nhỏ hoặc nắp ống phản ứng khác cũng có thể được sử dụng nếu cho kết quả
tương đương hoặc tốt hơn.
C.7.7 Cách tiến
hành: Chuẩn bị PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chuẩn bị PCR cho trình tự đích zSSIIb
đặc hiệu taxon và cho trình tự đích đặc hiệu Bt11 phải được thực hiện trong các
ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho
các đoạn dò) chưa được kiểm tra hoặc xác nhận giá trị sử dụng.
Phương pháp này quy định tổng thể tích
PCR 25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng, với các thành phần thuốc thử được
nêu ra trong Bảng C.37 đối với zSSIIb
và trong Bảng C.38 đối với Bt11.
Bảng C.37 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon ở thể tích cuối
cho
mỗi
ống phản ứng.
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)
2,5 μl
Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase
và dNTP)
TaqMan* Universal PCR Master Mix
(ABI)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mồi
SSIIb1-5' và SSIIb1-3 (xem Bảng
C.36)
xem Bảng
C.36
Đoạn dò
SSIIb-Taq ( xem Bảng C.36)
xem Bảng
C.36
Bảng C.38 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại trình tự đặc hiệu Bt11 ở thể tích cuối cho mỗi ống phản
ứng
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2,5 μl
Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase
và dNTP)
TaqMan* Universal PCR Master Mix
(ABI)
12,5 μl
Mồi
Bt11 3-5' và Bt11 3-3' (xem Bảng
C.36)
xem Bảng
C.36
Đoạn dò
Bt11-2-Taq (xem Bảng C.36)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.7.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Mỗi dãy kiểm tra phải bao gồm các kiểm
chứng như quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
Nếu các kiểm chứng không cho ra các kết
quả dự kiến, thì phải hủy kết quả và phân tích phải được lặp lại.
Ít nhất hai phương án lựa chọn thay thế
nên sẵn có để làm kiểm chứng dương/vật liệu so sánh chuẩn, như sau.
a) ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng
cao được tách chiết từ ngô hạt có thể sử dụng nếu số lượng ADN được biết, trên
cơ sở tính toán các số bản sao của trình tự đích từ kích thước bộ gen ngô Bt11.
b) Một plasmid chứa các trình tự đích
có thể được bổ sung ở các nồng độ khác nhau với các số lượng bản sao đã biết. Plasmid này có
trong bộ plasmid phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PS-2 và Nippon Gene No.
310-04981)62) [33].
Theo yêu cầu đảm bảo chất lượng, các
kiểm chứng dương tốt hơn không nên là các vật liệu so sánh chuẩn.
C.7.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ được
nêu trong Bảng C.39 được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM®
7700 SDS (Applied Biosystems)62).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng C.39 -
Các điều kiện phản ứng
Thời gian s
Nhiệt độ °C
Tiền PCR: khử nhiễm
120
50
Tiền PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính khuôn mẫu ADN
600
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
PCR (40 chu trình)
Bước 1
Biến tính
30
95
Bước 2
Gắn mồi và kéo dài
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
59
C.7.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
Nếu ngô biến đổi gen khác với Bt11 có
chứa cùng các trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc, thì phương pháp này chỉ thích hợp
cho định lượng ADN Bt11 khi không có mặt các GMO khác.
Phương pháp này chỉ phù hợp để
đo tỉ lệ giữa trình tự đặc hiệu cấu trúc Bt11 với trình tự zSSIIb đặc hiệu
taxon ở ngô. Tỉ lệ này phản ánh lượng Bt11 trong ngô nghiên cứu. Phương pháp
này chỉ xác nhận giá trị sử dụng cho ngô hạt.
Thử nghiệm cộng tác là một nguồn dữ liệu
giá trị để hỗ trợ cho việc ước lượng độ không đảm bảo đo. Cần xác định bất kỳ
nguồn không đảm bảo đo nào mà không được bao gồm trong dữ liệu của thử nghiệm cộng
tác, như lấy mẫu và những vấn đề khác, theo yêu cầu quốc tế [44],[45].
C.7.9 Hiệu chuẩn và
tính kết quả
Người phân tích phải xác định giá trị
ngưỡng để xác định chu kì ngưỡng (Ct).
Các ví dụ về các thủ tục sau khi phân
tích PCR có sẵn trong Hướng dẫn của nhà sản xuất bộ plasmid phát hiện ngô biến
đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319-04981) 63). Xem
Tài liệu tham khảo [33].
Giá trị Cf cho định lượng đặc hiệu cấu trúc Bt11
và plasmid chuẩn được sử dụng trong các thử nghiệm cộng tác là 0,50. Tính lượng
ngô biến đổi gen trong mẫu thử nghiệm theo phương trình sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trong đó:
NGM là số lượng bản sao
của trình tự đích đặc hiệu GM trong ADN mẫu thử nghiệm;
NTX là số lượng bản sao
của trình tự đích đặc hiệu taxon trong ADN mẫu thử nghiệm.
C.8 Phương pháp đặc
hiệu cấu trúc để định lượng ADN ngô dòng GA21 sử dụng real-time PCR
C.8.1 Giới thiệu
Phụ lục này mô tả phương pháp phát hiện
và định lượng gen đặc hiệu taxon của ngô (gen tổng hợp tinh bột ngô llb: zSSIIb)
và vùng nối tiếp giáp cấu trúc ADN đặc hiệu giữa trình tự peptide vận chuyển tối
ưu và gen tổng hợp 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate ở ngô (m-epsps) có mặt
trong ngô biến đổi gen GA21, dựa trên real-time PCR bằng cách sử dụng plasmid
làm chuẩn để định lượng tương đối dòng ngô GA21 bởi sử dụng hệ số chuyển đổi
(Cf) là tỉ lệ của các số bản sao giữa các trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc với các
trình tự ADN đặc hiệu taxon trong ngô hạt đại diện cho dòng GA21 thuần chủng.
CHỦ THÍCH Cf được sử dụng để tính toán
hàm lượng GMO (%, theo khối lượng) từ số bản sao ADN GMO của trình tự đặc hiệu
đích và trình tự đặc hiệu taxon. Cf có thể được đo bằng tỉ lệ giữa số bản sao trình tự
đặc hiệu đích với trình tự đặc hiệu taxon từ một mẫu chuẩn thích hợp.
Các hạn chế, xem C.8.8
C.8.2 Xác nhận giá
trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp này được tối ưu
trên thiết bị real-time PCR ABI PRISM® 7700 SDS63) sử dụng
plasmid pMul5
làm
chuẩn[33]. Plasmid pMul5 trong các sản
phẩm PCR riêng biệt được khuếch đại từ các hệ thống PCR để khuếch đại đặc hiệu
trình tự taxon ở ngô (zSSIIb), trình tự promotor 35S ở virút khảm súp lơ
(p35S), trình tự kết thúc của nopaline synthase (tNOS), và trình tự đặc hiệu cấu
trúc của MON 810, Event 176, Bt11, GA21 và T25.
CHÚ THÍCH Plasmid được sử
dụng làm chuẩn để xác định các hàm lượng GM được tính từ các số bản sao tương đối
của các trình tự ADN đặc hiệu GM và các trình tự ADN đặc hiệu taxon.
Đã kiểm tra độ lặp lại và độ tái lập của
phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng mẫu chuẩn và bột
ngô khô chưa biết là hỗn hợp của ngô GA21 và ngỏ thông thường [34].
Số bản sao của các trình tự đặc hiệu
taxon (zSSIIb) trong bộ gen được đánh giá cho 20 giống ngô đại diện khác
nhau.
Phương pháp được công bố trong các
tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản và Hàn Quốc [35],[36],[37],[38].
C.8.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia thử
nghiệm trên tổng số 12 mẫu ngô chưa biết có chứa khoảng 0 % đến 10 % (khối lượng)
bột ngô khô có nguồn gốc từ dòng GA21.
CHÚ THÍCH 1 Các hạt ngô giống GA21 đại
diện, dị hợp tử đối với tình trạng GM
được sử dụng để xác định các giá trị Cf và để chuẩn bị các mẫu chưa biết cho các thử
nghiệm cộng tác. Chuẩn bị các mẫu chưa biết của các hỗn hợp bột ngô dùng cho
xác nhận giá trị sử dụng ở các mức độ 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (khối
lượng) của bột ngô khô có nguồn gốc từ giống ngô trên. Độ đồng nhất của
các mẫu tại mỗi mức độ được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp định lượng
này theo các quy trình của AOAC [34],[39].
Phương pháp đã được xác nhận giá trị sử
dụng cho ngô GA21 trong một thử nghiệm cộng tác theo quy trình của AOAC l39].
Thử nghiệm cộng tác được tổ chức bởi Viện Nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (NFRI,
Tsukuba, Nhật Bản), cùng với Trung tâm cấp nhãn hiệu Chất lượng Thực phẩm và Dịch
vụ Người tiêu dùng, Saitama, Nhật Bản và Viện Khoa học Sức khỏe Quốc gia,
Tokyo, Nhật Bản. Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia bao gồm các phòng thử nghiệm
của Nhật Bản, Hàn Quốc và Mỹ thực hiện các thử nghiệm cộng tác trên hệ thống
phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS (Applied
Biosystems)
64) trong hai
giai đoạn riêng biệt. Tất cả các phòng thử nghiệm tham gia được yêu cầu phải
tuân theo các quy trình tách chiết ADN và PCR định lượng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng C.40 -
Tóm tắt Cf cho GA21
Trình tự đích
Đặc hiệu cấu
trúc GA21
Số phòng thử nghiệm tham gia
15
Số lượng số lạc Cochran
0
Số lượng số lạc Grubbs
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
15
Cfa
1,40 ±0,05
a Cf được biểu
thị dạng trung bình ± khoảng tin cậy (α = 0,05)
Người phân tích có thể xác định lại giá trị Cf bằng
cách sử dụng các mẫu chuẩn ngõ dòng GA21 phù hợp.
Giai đoạn hai thực hiện các thử nghiệm
mù. Các mẫu bột ngô chưa biết được thiết kế thành sáu cặp mù đôi, gồm 0 %, 0,1
%, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột ngô biến đổi gen dòng GA21 dạng
khô trong ngô thông thường. Mẫu trắng GA21 0 % được sử dụng để loại bỏ các phòng thử
nghiệm không hợp lệ trước khi phân tích thống kê. Các phòng thử nghiệm tham gia
được chỉ dẫn tách chiết ADN từ các mẫu bằng cách sử dụng Qiagen kit. Dữ liệu
thu được từ các phòng thử nghiệm được giữ lại bởi các kiểm định số lạc được sử
dụng để tính toán giá trị trung bình và khoảng tin cậy (α = 0,05). Các
giá trị trung bình được xác định là Cf dùng cho tính toán hàm lượng GMO (%)
trong các thử nghiệm mù. Giá trị trung bình của Cf cho định lượng đặc hiệu cấu
trúc GA21 là 1,40.
Mười bốn phòng thử nghiệm
tham gia trong giai đoạn thứ hai đã phân tích 168 mẫu bằng cách khuếch đại
trình tự zSSIIb và trình tự đặc hiệu cấu trúc GA21. Các phòng thử nghiệm
không báo cáo các mẫu trắng là 0 % bị coi là không hợp lệ và tất cả các dữ liệu
của các phòng thử nghiệm này bị loại ra trước khi tiến hành các kiểm định số lạc.
Trong tất cả các thí nghiệm, các tương quan của các đường chuẩn có thể chấp nhận
được (r > 0,990). Các phòng thử nghiệm có giá trị bất thường trong cặp
mù đôi ở mỗi mức độ GA21 bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran và Grubbs [40],[41], tương ứng,
trước khi phân tích thống kê độ chính xác và độ chụm. Hai số lạc Cochran được
phát hiện trong dữ liệu. Giá trị trung bình, độ chệch, độ lệch chuẩn tương đối
lặp lại (%) và độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) ở mỗi mức độ trộn được trình
bày trong Bảng C.41[34].
CHÚ THÍCH 2 Các cộng tác viên không tính toán các kết
quả cuối cùng sử dụng Cf được xác định bởi nghiên cứu cộng tác đầu tiên, Các số
bản sao của mỗi trình tự đích thu được trong các xác định Cf và các thử nghiệm
mù được báo cáo cho NFRI và đơn vị % GMO của các mẫu thử nghiệm mù được chuyển
đổi về kết quả cuối cùng bằng cách sử dụng Cf.
Bảng C.41 -
Tóm tắt giá trị sử dụng cho định lượng ngô GA21 đặc hiệu cấu trúc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mức độ trộn
(%)
0,1
0,5
1
5
10
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia
14
14
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
14
14
Số lượng phòng thử nghiệm không hợp
lệ
1
1
1
1
1
Số lượng số lạc
Cochran
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0
0
1
0
Số lượng số lạc Grubbs
0
0
0
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số phòng thử nghiệm được giữ lại
12
13
13
12
13
Trung bình hàm lượng
GMO (%)
0,1
0,5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5,8
11,5
Độ chệch của giá trị đúng (%)
-5,4
+7,7
+20,2
+16,6
+ 15,0
Độ lệch chuẩn lặp lại Sra
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,068
0,148
0,476
0,907
Giới hạn lặp lại ra (r = 2,8 sr)
0,054
0,189
0,414
1,332
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại
(%)b
20,5
12,6
12,3
8,2
7,9
Độ lệch chuẩn tái lập sRa
0,019
0,117
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,927
1,565
Giới hạn tái lập Ra
(R
= 2,8 x sR)
0,055
0,329
0,627
2,597
4,382
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)b
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
21,8
18,6
15,9
13,6
Dưới 20 bản saoc (giới hạn
phát hiện tuyệt đối trong phương pháp này)
4/24
0/26
0/26
0/24
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a Được biểu
thị theo đơn vị % GMO.
b Được biểu
thị là tỉ lệ phần
trăm của giá trị trung bình.
c Được biếu
thị là tỉ lệ của số
lượng dữ liệu dưới 20 bản sao được giữ lại với tổng số dữ liệu được
giữ lại.
C.8.2.3 Đặc hiệu phân
tử
C.8.2.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp này được mô tả trong Tài
liệu tham khảo [33]. Thông tin về cấu trúc di truyền đưa vào bộ gen ngô sẵn có
trong Tài liệu tham khảo [33] và [46]. Các mồi và đoạn dò TaqMan® 65) để phát triển
phương pháp được thiết kế bằng thông tin mô tả trong Tài liệu tham khảo [46].
Nếu cấu trúc ADN đưa vào GA21 được sử
dụng cho các sự kiện GM khác, thì có thể thu được kết quả dương tính giả
do trình tự được khuếch đại bắt nguồn từ cấu trúc này.
C.8.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu DDBJ66) (ngày
3 tháng 12 năm 1999) và các tài liệu đánh giá sự an toàn được công bố bởi Bộ Y
tế, Lao động và Phúc lợi Nhật Bản, và Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Nhật
Bản, sử dụng các trình tự nucleotit như là chuỗi truy vấn với chương trình
BLASTN 2.2.3 65). Các kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận một sự
tương đồng hoàn toàn chỉ với trình tự đích dự kiến.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kiểm tra các mẫu bột ngô khô chứa 0 %
đến 10 % (phần khối lượng, được chuẩn bị bởi NFRI) ngô biến đổi gen
dòng GA21 bằng khuếch đại ADN với mồi và đoạn dò đã thu được các sản phẩm PCR dự kiến [33],[34].
Các nền mẫu được kiểm tra là ngô hạt,
bột kiều mạch ngô, bột ngô và bột ngô xay thô.
Các kiểm tra đặc hiệu trước khi thử
nghiệm cộng tác cho thấy không có phản ứng chéo giữa bộ mồi/đoạn dò với
các loài/mẫu không phải đích sau: lúa (Oryza sativa), lúa mì (Triticum
aestivum) và lúa mạch (Hordeum vulgare). Không quan sát thấy phản ứng
chéo ở đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2, ở ngô biến đổi gen các dòng MON
810, Event176, Bt11 và T25.
C.8.2.4 Tối ưu hóa
Tối ưu hóa chất phản ứng được thực hiện
trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS sử dụng hóa chất
TaqMan® 65) [43].
Thiết kế mồi và đoạn dò được thực hiện
bằng phần mềm Primer Express® (Applied Biosystems).
C.8.2.5 Giới hạn phát
hiện
(LOD)
LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn [33].
LOD tương đối được xác nhận trong các
thử nghiệm cộng tác: 0,1 % GA21.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn.
LOQ tương đối được xác nhận trong các
thử nghiệm cộng tác: 0,1 % GA21.
C.8.3 Điều chỉnh
Chưa có thông tin cụ thể.
C.8.4 Nguyên tắc
Đoạn trình tự đặc hiệu cấu trúc có chiều
dài 133 bp của GA21 được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho GA21.
Sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò
oligonucleotit đặc hiệu cho GA21 được đánh dấu bằng hai loại thuốc nhuộm huỳnh
quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh
quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan® 67) được sử dụng.
Đoạn trình tự đặc hiệu taxon có chiều
dài 151 bp của zSSIIb được khuếch đại bằng PCR trong phản ứng real-time
PCR riêng biệt sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho zSSIIb, và các sản phẩm PCR
được đo qua mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan®67) đặc hiệu zSSIIb.
Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định
lượng số bản sao ADN được tách chiết từ mẫu chưa biết. Đường chuẩn riêng biệt của
mỗi bộ mồi/đoạn dò được tạo thành trong cùng một lần chạy khuếch đại phân tích.
Các đường chuẩn gồm năm nồng độ chứa 20, 125, 1 500, 20 000, 250 000 bản sao
ADN plasmid pMul5. Tại mỗi điểm của năm điểm chuẩn, phép đo được thực hiện ba lần.
Các phản ứng lặp lại ba lần bằng cách sử dụng độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu
thử và đo trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS trong
cùng một lần chạy phân tích.
Giá trị Ct xác định cho các
điểm chuẩn của zSSIIb hoặc đích đặc hiệu cấu trúc GA21, tương ứng, được
vẽ đồ thị đối với logarit số bản sao ADN plasmid pMul5 [33] để thiết
lập một đường chuẩn, số bản sao ADN mẫu kiểm tra có được bằng cách nội suy từ
các đường chuẩn. Để xác định lượng GA21 trong mẫu kiểm tra, lấy số bản sao
của cấu trúc GA21 chia cho số bản sao gen zSSIIb và Cf của GA21 đặc hiệu
cấu trúc, nhân với 100 để có được tỉ lệ phần trăm như mô tả trong C.8.9.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.8.5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng,
xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
C.8.5.2 Nước
C.8.5.3 TaqMan®
Universal Master Mix 67), 2 x.
C.8.5.4 Mẫu chuẩn (Plasmid)
Trình tự của mẫu chuẩn được sử dụng để
xây dựng và xác
nhận giá trị sử dụng của phương pháp này là plasmid pMul5[33] có trong bộ plasmid
phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319-04981)67).
Có thể sử dụng các mẫu chuẩn khác với điều kiện hiệu năng được chứng minh là tương đương
hoặc tốt hơn.
C.8.5.5 Các
oligonucleotit
Các trình tự của các mồi và đoạn dò của
gen đặc hiệu cấu trúc GA21
và gen đặc hiệu taxon ở ngô được liệt kê trong Bảng C.42.
Bảng C.42 -
Các oligonucleotit
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trình tự
ADN oligonucleotit
Nồng độ cuối
trong PCR
Trình tự đích gen đặc hiệu taxon
SSIIb 1-5'
5'-CTC CCA ATC CTT TgA CAT CTg C-3’
500 nmol/l
SSIIb 1-3'
5'-TCg ATT TCT CTC TTg gTg ACA gg-3'
500 nmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5'-FAM-AgC AAA gTC AgA gCg CTg CAA
TgC A-TAMRA-3’a
200 nmol/l
Trình tự đích GMO
GA21 3-5'
5'-gAA gCC TCg gCA ACg TCA-3'
500 nmol/l
GA21 3-3’
5-ATC Cgg TTg gAA AgC gAC TT-3'
500 nmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5' -FAM- AAg gAT CCg gTg CAT ggC
Cg-TAMRA- 3'a
200 nmol/l
a FAM:
6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.
Chiều dài sản phẩm PCR của SSIIb
là 151 bp; chiều dài sản phẩm PCR của GA21 là 133 bp.
C.8.6 Thiết bị, dụng
cụ
C.8.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
C.8.6.2 Máy chu
trình nhiệt
Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được
thử nghiệm với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS
(Applied Biosystems) 68) trong thời gian thử nghiệm cộng tác.
Các thiết bị real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp
các điều kiện phản ứng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khay và các nắp ống phản ứng phải phù
hợp để khuếch đại PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng
quang học 96 giếng ABI PRISM®, hoặc các nắp quang học MicroAmp®
(8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems)68), tương ứng. Các khay,
lọ nhỏ hoặc nắp ống phản ứng khác cũng có thể được sử dụng nếu cho kết quả
tương đương hoặc tốt hơn.
C.8.7 Cách tiến
hành: Chuẩn bị PCR
C.8.7.1 Yêu cầu chung
Chuẩn bị PCR cho trình tự đích zSSIIb
đặc hiệu taxon và cho trình tự đích đặc hiệu GA21 phải được thực hiện trong các
ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho
các đoạn dò) chưa được kiểm tra hoặc xác nhận giá trị sử dụng.
Phương pháp này quy định tổng thể tích
PCR 25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng, với thành phần thuốc thử được nêu ra trong
Bảng C.43 đối với zSSIIb và trong Bảng C.44 đối với GA21.
Bảng C.43 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon ở thể tích cuối
cho mỗi ống phản ứng
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase
và dNTP)
TaqMan® Universal PCR
Master Mix
12,5 μl
Mồi
SSIIb1-5' và SSIIb1-3' (xem Bảng
C.42)
xem Bảng
C.42
Đoạn dò
SSIIb-Taq (xem Bảng C.42)
xem Bảng
C.42
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)
2,5 μl
Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase
và dNTP)
TaqMan® Universal PCR Master Mix
12,5 μl
Mồi
GA21 3-5' và GA21 3-3' (xem Bảng
C.42)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đoạn dò
GA21-2-Taq (xem Bảng C42)
xem Bảng
C.42
C.8.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Mỗi dãy kiểm tra phải bao gồm các kiểm
chứng như quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
Nếu các kiểm chứng không cho ra các kết
quả dự kiến, thì phải hủy kết quả và phân tích phải được lặp lại.
Ít nhất hai phương án lựa chọn thay thế nên sẵn
có để làm kiểm chứng dương/vật liệu so sánh chuẩn, như sau.
a) ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng
cao được tách chiết từ ngô hạt có thể sử dụng nếu số lượng ADN được biết, trên
cơ sở tính toán các số bản sao của trình tự đích từ kích thước bộ gen ngỏ GA21.
b) Một plasmid chứa các trình tự đích
có thể được bổ sung ở các nồng độ khác nhau với các số bản sao đã biết. plasmid
này có trong bộ plasmid phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PS-2 và Nippon
Gene No. 310-04981) 68). Xem Tài liệu tham khảo [33].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.8.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ được
nêu trong Bảng C.45 được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM®
7700 SDS (Applied Biosystems).
Trong thử nghiệm cộng tác, chương
trình được sử dụng kết hợp với TaqMan® Universal Master Mix.
Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt
khác có thể yêu cầu điều chỉnh phù hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban
đầu phụ thuộc vào từng loại Master Mix được sử dụng.
Bảng C.45 -
Các điều kiện phản ứng
Thời gian
s
Nhiệt độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tiền-PCR: khử nhiễm
120
50
Tiền-PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính khuôn mẫu ADN
600
95
PCR (40 chu trình)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Biến tính
30
95
Bước 2
Gắn mồi và kéo dài
60
60
C.8.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
Nếu ngô biến đổi gen khác với GA21 có
chứa cùng trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc, thì phương pháp này chỉ thích hợp cho
định lượng ADN GA21 khi không có mặt các GMO khác.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thử nghiệm cộng tác là một nguồn dữ liệu
giá trị để hỗ trợ cho việc ước lượng độ không đảm bảo đo. Cần xác định bất kỳ
nguồn không đảm bảo đo nào mà không được bao gồm trong dữ liệu của thử nghiệm cộng
tác, như lấy mẫu và những vấn đề khác, theo yêu cầu quốc tế [44],[45].
C.8.9 Hiệu chuẩn và
tính kết quả
Người phân tích phải xác định giá trị
ngưỡng để xác định chu kì ngưỡng (Ct).
Các ví dụ về các thủ tục sau khi phân
tích PCR có sẵn trong Hướng dẫn của nhà sản xuất bộ plasmid phát hiện ngô biến
đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319-04981 69)). Xem Tài liệu tham
khảo [33],
Giá trị Cf cho định lượng đặc hiệu cấu
trúc GA21 và plasmid chuẩn được sử dụng trong các thử nghiệm cộng tác là 1,40.
Tính lượng ngô biến đổi gen trong mẫu thử nghiệm theo phương trình sau:
w = 
Trong đó:
NGM là số lượng bản sao
của trình tự đích đặc hiệu GM trong ADN mẫu thử nghiệm;
NTX là số lượng bản sao
của trình tự đích đặc hiệu taxon trong ADN mẫu thử nghiệm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.9.1 Giới thiệu
Phụ lục này mô tả phương pháp phát hiện
và định lượng gen đặc hiệu taxon của ngô (gen tổng hợp tinh bột ngô IIb: zSSIIb)
và vùng nối cấu trúc ADN đặc hiệu giữa trình tự khởi động của virút khảm súp lơ
và gen tổng hợp phosphinothricin acetyltransferase (pat) có nguồn gốc từ vi khuẩn
Streptomyces viridochromogenes có mặt trong ngô biến đổi gen dòng T25, dựa
trên real-time PCR bằng cách sử dụng plasmid làm chuẩn để định lượng tương đối
ngô dòng T25 thông qua sử dụng hệ số chuyển đổi (Cf) là tỉ lệ của
các số bản sao giữa các trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc với các trình tự ADN đặc
hiệu taxon trong ngô hạt đại diện cho dòng T25 thuần chủng.
CHÚ THÍCH Cf được sử dụng để tính toán
hàm lượng GMO (%, theo khối lượng) từ số bản sao ADN GMO của các trình tự đặc
hiệu đích và các trình tự đặc hiệu taxon. Cf có thể được đo bằng tỉ lệ giữa số
bản sao trình tự đặc hiệu đích với trình tự đặc hiệu taxon từ một mẫu chuẩn thích hợp.
Các hạn chế, xem C.9.8.
C.9.2 Xác nhận giá
trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng
C.9.2.1 Yêu cầu chung
Phương pháp này được tối ưu trên thiết
bị real-time PCR ABI PRISM® 7700 SDS 69) sử dụng
plasmid pMul5 làm chuẩn [33]. Plasmid pMul5 trong các sản
phẩm PCR riêng biệt được khuếch đại từ các hệ thống PCR để khuếch đại đặc hiệu
trình tự taxon ở ngô (zSSIIb), trình tự promotor 35S ở virút khảm súp lơ
(p35S), trình tự kết thúc của nopaline synthase (tNOS), và trình tự đặc hiệu cấu
trúc của MON 810, Event176, Bt11, GA21 và T25.
CHÚ THÍCH Plasmid được sử dụng làm chuẩn để
xác định các hàm lượng GM được tính từ các số bản sao tương đối của các trình tự
ADN đặc hiệu GM và các trình tự ADN đặc hiệu taxon.
Đã kiểm tra độ lặp lại và độ tái lập của
phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng mẫu chuẩn và bột ngô khô
chưa biết là hỗn hợp của ngô T25 và ngô thông thường [34].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp được công bố trong các
tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản và Hàn Quốc [35],[36],[37],[38].
C.9.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Mười lăm phòng thử nghiệm tham gia thử
nghiệm trên tổng số 12 mẫu ngô chưa biết có chứa khoảng 0 % đến 10 % (theo khối
lượng) bột ngô khô có nguồn gốc từ dòng T25.
CHÚ THÍCH 1 Các hạt ngô giống T25 đại diện, dị hợp
tử đối với tình trạng GM
được sử dụng để xác định các giá trị Cf và để chuẩn bị các mẫu chưa biết cho các thử nghiệm cộng
tác. Chuẩn bị các mẫu chưa biết của các hỗn hợp bột ngô dùng cho xác nhận giá
trị sử dụng ở các mức độ 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng)
của bột ngô khô có nguồn gốc từ giống ngô trên. Độ đồng nhất của các mẫu tại mỗi
mức độ được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp định lượng này theo các quy
trình của AOAC [34],[39].
Phương pháp đã được xác nhận giá trị sử
dụng cho ngô T25 trong một thử nghiệm cộng tác theo quy trình của AOAC [39].
Thử nghiệm cộng tác được tổ chức bởi Viện Nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (NFRI,
Tsukuba, Nhật Bản), cùng với Trung tâm cấp nhãn hiệu Chất lượng Thực phẩm và Dịch
vụ Người tiêu dùng, Saitama, Nhật Bản và Viện Khoa học Sức khỏe quốc gia,
Tokyo, Nhật Bản. Mười lăm
phòng thử nghiệm tham gia bao gồm các phòng thử nghiệm của Nhật Bản, Hàn Quốc
và Mỹ thực hiện các thử nghiệm cộng tác trên hệ thống phát hiện trình tự ABI
PRISM® 7700 SDS (Applied Biosystems) 69)
trong hai giai đoạn riêng biệt. Tất cả các phòng thử nghiệm tham gia được yêu cầu
phải tuân theo các quy trình tách chiết ADN và PCR định lượng.
Giai đoạn đầu nhằm xác định Cf của
T25. Tất cả các phòng thử nghiệm tham gia được nhận các bộ mồi, đoạn dò, mẫu
chuẩn và các ADN được tách chiết từ các hạt ngô giống T25, được chuẩn bị bởi
Qiagen DNeasy Plant Maxi 70)
và sự thích hợp của nó đã được kiểm tra tại NFRI trước cuộc thử nghiệm. Các ADN
đã được sử dụng để đo các số bản sao của trình tự ADN zSSIIb đặc hiệu
taxon ở ngô và trình tự đặc hiệu cấu trúc T25. Tất cả các phép đo trong giai đoạn
này được lặp lại ba lần. có tổng cộng 90 bộ dữ liệu thu được từ các phòng thử
nghiệm tham gia. Các tương quan của các đường chuẩn trong dữ liệu thu được từ
các phòng thử nghiệm tham gia có thể chấp nhận được (r > 0,990). Theo
quy trình thực hiện của AOAC [39], các phòng
thử nghiệm có số lạc bị loại bỏ bằng kiểm định Cochran (p < 0,025) và
kiểm định Grubbs (p < 0,025). Không có phòng thử nghiệm có số lạc được
quan sát thấy trong các kiểm định này, như được trình bày trong Bảng C.46.
Bảng C.46 -
Tóm tắt Cf cho T25
Trình tự đích
Đặc hiệu cấu
trúc T25
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
15
Số lượng số lạc
Cochran
0
Số lượng số lạc Grubbs
0
Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại
15
Cfa
0,34 ± 0,01
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Người phân tích có thể xác định lại
giá trị Cf bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn ngô dòng T25 phù hợp.
Giai đoạn hai thực hiện các thử nghiệm
mù. Các mẫu bột ngô chưa biết được thiết kế thành sáu cặp mù đôi, gồm 0 %, 0,1
%, 0,5 %, 1 %, 5 % và 10 % (theo khối lượng) bột ngô ngô biến đổi gen dòng T25 dạng
khô trong ngô thông thường [34]. Mẫu trắng T25 0
% được sử dụng để loại bỏ các phòng thử nghiệm không hợp lệ trước khi phân tích
thống kê. Các phòng tham gia được chỉ dẫn tách chiết ADN từ các mẫu bằng cách sử
dụng Qiagen kít. Dữ liệu thu được từ các phòng thử nghiệm được giữ lại bởi các
kiểm định số lạc được sử
dụng để tính toán giá trị trung bình và khoảng tin cậy (α = 0,05). Các
giá trị trung bình được xác định là Cf dùng cho tính toán hàm lượng GMO (%)
trong các thử nghiệm mù. Giá trị trung bình của Cf cho định lượng đặc hiệu cấu
trúc T25 là 0,34.
Mười bốn phòng thử nghiệm tham gia
trong giai đoạn thứ hai đã phân tích 168 mẫu bằng cách khuếch đại trình tự zSSIIb
và trình tự đặc hiệu cấu trúc T25. Các phòng thử nghiệm không báo cáo các mẫu
trắng là 0 % bị coi là không hợp lệ và tất cả các dữ liệu của các phòng thử
nghiệm này bị loại ra trước khi tiến hành các kiểm định số lạc. Trong tất cả
các thí nghiệm, các tương quan của các đường chuẩn có thể chấp nhận được (r
> 0,990). Các phòng thử nghiệm có giá trị bất thường trong cặp mù đôi ở mỗi
mức độ T25 bị loại bỏ bởi kiểm định Cochran và Grubbs [40],[41], tương ứng,
trước khi phân tích thống kê độ chính xác và độ chụm. Ba số lạc Cochran
và một số lạc Grubbs đã được phát hiện
trong dữ liệu. Giá trị trung bình, độ chệch, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại
(%) và độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) ở mỗi mức độ trộn được trình bày
trong Bảng C.47.
CHÚ THÍCH 2: Các cộng tác viên không
tính toán các kết quả cuối cùng sử dụng Cf được xác định bởi nghiên cứu cộng tác
đầu tiên. Các số bản sao của mỗi trình tự đích thu được trong các xác định Cf
và các thử nghiệm mù được báo cáo cho NFRI và đơn vị % GMO của các mẫu thử nghiệm
mù được chuyển đổi về kết quả cuối cùng bằng cách sử dụng Cf.
Bảng C.47 -
Tóm tắt giá trị sử dụng cho định lượng ngô T25 đặc hiệu cấu trúc
Mức độ trộn
(%)
0,1
0,5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5
10
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia
14
14
14
14
14
Số lượng phòng thử nghiệm không hợp
lệ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0
0
0
0
Số lượng số lạc Cochran
2
0
1
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số lượng số lạc Grubbs
1
0
0
0
0
Số phòng thử nghiệm được giữ lại
11
14
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
14
14
Trung bình hàm lượng
GMO (%)
0,1
0,6
1,2
5,6
10,8
Độ chệch của giá trị đúng (%)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
+ 15,3
+20,0
+11,6
+8,1
Độ lệch chuẩn lặp lại sra
0,033
0,162
0,082
0,690
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giới hạn lặp lại ra (r
= 2,8 x sr)
0,092
0,455
0,228
1,932
4,030
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)b
23,7
28,2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
12,4
13,3
Độ lệch chuẩn tái lập sRa
0,037
0,162
0,138
0,827
1,591
Giới hạn tái lập Ra
(R = 2,8 x sR)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,455
0,386
2,317
4,456
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)b
26,5
28,2
11,5
14,8
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dưới 20 bản saoc (giới hạn
phát hiện tuyệt đối trong phương pháp này)
22/22
1/28
0/26
0/28
0/28
a Được biểu
thị theo đơn vị % GMO.
b Được biểu
thị là tỉ lệ phần
trăm của giá trị trung bình.
c Được biểu
thị là tỉ lệ của số lượng dữ liệu dưới 20 bản sao được giữ lại với tổng số dữ
liệu được giữ lại.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.9.2.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp này được mô tả trong Tài
liệu tham khảo [33], Thông tin về cấu trúc di truyền đưa vào bộ gen ngô sẵn có trong
Tài liệu tham khảo [33] và [46], Các mồi và đoạn dò TaqMan® 71) để phát triển
phương pháp được thiết kế bằng thông tin mô tả trong Tài liệu tham khảo [46].
Nếu cấu trúc ADN đưa vào T25 được sử dụng
cho các sự kiện GM khác, thì có thể thu được kết quả dương tính giả do trình tự
được khuếch đại bắt nguồn từ cấu trúc này.
C.9.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu 71) DDBJ 72) (ngày
3 tháng 12 năm 1999) và các tài liệu đánh giá sự an toàn được công bố bởi Bộ Y
tế, Lao động và Phúc lợi Nhật Bản, và Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Nhật
Bản, sử dụng
các trình tự nucleotit như là chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3 71).
Các kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với trình tự
đích dự kiến.
C.9.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
Kiểm tra các mẫu bột ngô khô chứa 0 %
đến 10 % (phần khối lượng, được chuẩn bị bởi NFRI) ngô biến đổi gen dòng T25 bằng
khuếch đại ADN với mồi và đoạn dò đã thu được các sản phẩm PCR dự kiến [33],[34].
Các nền mẫu được kiểm tra là ngô hạt,
bột kiều mạch ngô, bột ngô và bột ngô xay thô.
Các kiểm tra đặc hiệu trước khi thử
nghiệm cộng tác cho thấy không có phản ứng chéo giữa bộ mồi/ đoạn dò với các
loài/mẫu không phải đích sau: lúa (Oryza sativa), lúa mì (Triticum
aestivum) và lúa mạch (Hordeum vulgare). Không quan sát thấy phản ứng
chéo ở đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2, ở ngô biến đổi gen các dòng MON 810,
Event176, Bt11 và GA21.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tối ưu hóa chất phản ứng được
thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS 73)
(ABI) sử dụng hóa chất TaqMan® 73) [43].
Thiết kế mồi và đoạn dò được thực hiện
bằng phần mềm Primer Express® (Applied Biosystems)73).
C.9.2.5 Giới hạn
phát hiện
(LOD)
LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn [33].
LOD tương đối được xác nhận trong các
thử nghiệm cộng tác: 0,5 % T25.
C.9.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích: 20 bản sao plasmid của mẫu chuẩn [33].
LOQ tương đối được xác nhận trong các
thử nghiệm cộng tác: 0,5 % T25.
C.9.3 Điều chỉnh
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.9.4 Nguyên tắc
Đoạn trình tự đặc hiệu cấu trúc có chiều
dài 149 bp của T25 được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho T25. Sản
phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit
đặc hiệu cho T25 được đánh dấu bằng hai loại thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm
phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa
chất TaqMan® 73) được sử dụng.
Đoạn trình tự đặc hiệu taxon có chiều
dài 151 bp của zSSIIb được khuếch đại bằng phản ứng real-time PCR riêng
biệt sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho zSSIIb, và các sản phẩm PCR được đo
qua mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan® 73) đặc hiệu zSSIIb.
Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định
lượng số bản sao ADN được tách chiết từ mẫu chưa biết. Đường chuẩn riêng biệt của
mỗi bộ mồi/đoạn dò được tạo thành trong cùng một lần chạy khuếch đại phân tích.
Các đường chuẩn gồm năm nồng độ chứa 20, 125, 1 500, 20 000, 250 000 bản sao
ADN plasmid pMul5. Tại mỗi điểm của năm điểm chuẩn, phép đo được thực hiện ba lần.
Các phản ứng lặp lại ba lần bằng cách sử dụng độ pha loãng thích hợp của ADN mẫu
thử và đo trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS 74) trong
cùng một lần chạy phân tích.
Giá trị Ct xác định cho các điểm chuẩn
của zSSIIb hoặc đích đặc hiệu cấu trúc T25, tương ứng, được vẽ đồ thị đối
với logarit số bản sao ADN plasmid pMul5 để thiết lập một đường chuẩn. Xem Tài
liệu tham khảo [33]. Số bản sao ADN
mẫu kiểm tra thu được bằng cách nội suy từ các đường chuẩn. Để xác định lượng
T25 trong mẫu kiểm tra, lấy số bản sao của cấu trúc T25 chia cho số bản sao gen
zSSIIb và Cf của T25 đặc hiệu cấu trúc, nhân với 100 đề có được tỉ lệ phần
trăm như trong C.9.9.
C.9.5 Thuốc thử
C.9.5.1 Yêu cầu
chung
Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng,
xem 6.6 của TCVN 7608 (ISO 24276).
C.9.5.2 Nước
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.9.5.4 Mẫu chuẩn (Plasmid)
Mẫu chuẩn được sử dụng để xây dựng và xác nhận
giá trị sử dụng của phương pháp này là plasmid pMul5 có trong bộ plasmid phát
hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319- 04981)74).
Có thể được sử dụng các mẫu chuẩn khác với điều kiện hiệu năng được chứng minh
là tương đương hoặc tốt hơn.
C.9.5.5 Các
oligonucleotit
Trình tự oligonucleotit của các mồi và
đoạn dò của gen đặc hiệu cấu trúc T25 và gen đặc hiệu taxon ở ngô được liệt
kê trong Bảng C.48, trong đó các mồi và đoạn dò được trộn lẫn thành hỗn hợp mồi-đoạn
dò.
Bảng C.48 -
Các oligonucleotit
Tên
Trình tự
ADN oligonucieotit
Nồng độ cuối
trong PCR
Trình tự đích gen đặc hiệu taxon
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5’-CTC CCA ATC CTT TgA CAT CTg C-3'
500 nmol/l
SSIIb 1-3'
5'-TCg ATT TCT CTC TTg gTg ACA gg-3'
500 nmol/l
SSIIb-Taq
5'-FAM-AgC AAA gTC AgA gCg CTg CAA
TgC A-TAMRA-3'
200 nmol/l
Trình tự đích GMO
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5'-gCC AgT TAg gCC AgT TAC CCA-3'
500 nmol/l
T25 1-3’
5'-TgA gCg AAA CCC TAT AAg AAC CCT -
3'
500 nmol/l
T25-2-Taq
5'-FAM-TgC Agg CAT gCC CgC TgA AAT c
-TAMRA-3’
200 nmol/l
a FAM:
6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.9.6 Thiết bị, dụng
cụ
C.9.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
C.9.6.2 Máy chu trình
nhiệt
Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được
thử nghiệm với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS
(Applied Biosystems) 75) trong thời gian thử nghiệm cộng tác. Các
thiết bị real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp các
điều kiện phản ứng.
C.9.6.3 Khay và các nắp
ống phản ứng
Khay và các nắp ống phản ứng phải phù
hợp để khuếch đại PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang
học 96 giếng ABI PRISM®, hoặc các nắp quang học MicroAmp®
(8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems) 75), tương ứng. Các
khay, lọ nhỏ hoặc nắp ống phản ứng khác cũng có thể được sử dụng nếu cho kết quả
tương đương hoặc tốt hơn.
C.9.7 Cách tiến
hành: Chuẩn bị PCR
C.9.7.1 Yêu cầu chung
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp quy định tổng thể tích PCR
25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với các thành phần thuốc thử được nêu ra trong Bảng C.49 đối với
zSSIIb và trong Bảng C.50 đối với T25.
Bảng C.49 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon ở thể tích cuối
cho mỗi ống phản ứng
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)
2,5 μl
Đệm phản ứng (bao gồm ADN polymerase
và dNTP)
TaqMan® Universal PCR
Master Mix (ABI)
12,5 μl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
SSIIb1-5’ và SSIIb1-3' (xem Bảng
C.48)
xem Bảng
C.48
Đoạn dò
SSIIb-Taq (xem Bảng C.48)
xem Bảng
C.48
Bảng C.50 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại trình tự đặc hiệu T25 ở thể tích cuối cho mỗi ống phản ứng
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (50 ng ADN bộ gen ngô)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đệm phản ứng (bao gồm
ADN polymerase và dNTP)
TaqMan® Universal PCR
Master Mix (ABI)
12,5 μl
Mồi
T25 1-5' và T25 1-3' (xem Bảng C.48)
xem Bảng
C.48
Đoạn dò
T25-2-Taq (xem Bảng C.48)
xem Bảng
C.48
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mỗi dãy kiểm tra phải bao gồm các kiểm
chứng như quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
Nếu các kiểm chứng không cho ra các kết
quả dự kiến, thì phải hủy kết quả và phân tích phải được lặp lại.
Ít nhất hai phương án lựa chọn thay thế nên sẵn
có để làm kiểm chứng dương/vật liệu so sánh chuẩn, như sau.
a) ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng
cao được tách chiết từ ngô hạt có thể sử dụng nếu số lượng ADN được biết, trên
cơ sở tính các số bản sao của trình tự đích từ kích thước bộ gen ngô T25.
b) Một plasmid chứa các trình tự đích
có thể được bổ sung ở các nồng độ khác nhau với các số lượng bản sao đã biết. Plasmid
này có trong bộ Plasmid phát hiện ngô biến đổi gen (Fasmac No. PS-2 và Nippon
Gene No. 310-04981) 76). Xem Tài liệu tham khảo [33].
Theo yêu cầu đảm bảo chất lượng, các
kiểm chứng dương tốt nhất không nên là các vật liệu so sánh chuẩn.
C.9.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ được
nêu trong Bảng C.51 được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM®76)
7700 SDS (Applied Biosystems) 76).
Trong thử nghiệm cộng tác, chương
trình được sử dụng kết hợp với TaqMan® Universal Master Mix76).
Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu điều chỉnh phù hợp cụ
thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại Master Mix được
sử dụng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thời gian
s
Nhiệt độ
°C
Tiền PCR: khử nhiễm
120
50
Tiền PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính khuôn mẫu ADN
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
95
PCR (40 chu trình)
Bước 1
Biến tính
30
95
Bước 2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
60
59
C.9.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
Nếu ngô biến đổi gen khác với T25 có
chứa cùng các trình tự ADN đặc hiệu cấu trúc, thì phương pháp này chỉ thích hợp
cho định lượng ADN T25 khi không có mặt các GMO khác.
Phương pháp này chỉ phù hợp để đo tỉ lệ giữa
trình tự đặc hiệu cấu trúc T25 với trình tự zSSIIb đặc hiệu taxon ở ngô.
Tỉ lệ này phản ánh lượng T25 trong ngô nghiên cứu. Phương pháp này chỉ xác nhận
giá trị sử dụng cho ngô hạt.
Thử nghiệm cộng tác là một nguồn dữ liệu
giá trị để hỗ trợ cho việc ước lượng độ không đảm bảo đo. Cần xác định bất kỳ
nguồn không đảm bảo đo nào mà không được bao gồm trong dữ liệu của thử nghiệm cộng
tác, như lấy mẫu và những vấn đề khác, theo yêu cầu quốc tế [44],[45].
C.9.9 Hiệu chuẩn và
tính kết quả
Người phân tích phải xác định giá trị
ngưỡng để xác định chu kì ngưỡng (Ct).
Các ví dụ về các thủ tục sau khi phân
tích PCR có sẵn trong Hướng dẫn của nhà sản xuất bộ plasmid phát hiện ngô biến
đổi gen (Fasmac No. PM-2 và Nippon Gene No. 319-04.981 76)). Xem Tài liệu tham
khảo [33].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
w = 
Trong đó:
NGM là số lượng bản sao
của trình tự đích đặc hiệu GM trong ADN mẫu thử nghiệm;
NTX là số lượng bản sao
của trình tự đích đặc hiệu taxon trong ADN mẫu thử nghiệm.
Phụ lục D
(Tham khảo)
Các phương
pháp đặc hiệu sự kiện
D.1 Phương pháp
đặc hiệu sự kiện để định lượng ADN tương đối và tuyệt đối ngô dòng Bt11 dựa
trên real-time PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại
đặc hiệu và định lượng ADN nguồn gốc từ ngô biến đổi gen dòng Bt11 (Zea
mays) trong thực phẩm. Phương pháp này xác định nồng độ là các số bản sao
tuyệt đối, và phải được kết hợp với một phương pháp đặc hiệu taxon-đích ở ngô
(ví dụ: A.1) để tính toán nồng độ tương đối của ADN Bt11 trong thực phẩm. Việc
tính toán giá trị tương đối cũng được mô tả.
Các hạn chế, xem D.1.8.
D.1.2 Xác nhận giá
trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng
D.1.2.1 Yêu cầu
chung
Phương pháp được tối ưu cho ADN tách
chiết từ ngô hạt Bt11 được nghiền thành bột mịn, tinh khiết, lá ngô Bt11 và mẫu
chuẩn được chứng nhận là bột
ngô Bt11 (IRMM-412 77) [10]) dạng khô,
được chuẩn bị từ ngô hạt nghiền là hỗn hợp ngô biến đổi gen dòng Bt11 và ngô
thông thường.
Đã kiểm tra độ tái lập của phương pháp
trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng 12 mẫu chưa biết (6 cặp mù đôi)
là các hỗn hợp của 100 % ADN Bt11 và ADN ngô hoang dại ở các số bản sao tương ứng
khác nhau của trình tự đích.
Số bản sao của trình tự đích trong mỗi bộ gen
đơn bội được xác định là 1[47]
Phương pháp ban đầu được phát triển
cho các máy chu trình nhiệt LightCycler® (Roche Diagnostics) 77)
đã được công bố [47] và sau đó được sửa đổi [15] để thích ứng
với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700/7900 SDS trước khi
xác nhận giá trị sử dụng trong một thử nghiệm cộng tác. Quy trình thực hiện được sửa
đổi được trình bày tại đây.
D.1.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các mẫu chứa ngô ngọt hoang dại và ngô
ngọt Bt11 ở các nồng độ ADN khác nhau được sử dụng. Các nguồn bảo quản, dự trữ
ADN của ngô không biến đổi gen và ADN của ngô ngọt Bt11 100 % nhận được từ
Syngenta.
Phương pháp chiết ADN đã sử dụng cơ bản
dựa vào dung dịch ly giải Magnesil và tách ADN từ tính. Các chi tiết về ADN như
sau:
- ADN bộ gen từ lá hoang dại của ngô
ruộng lai (Brasco);
- ADN bộ gen hạt ngô ngọt Bt11
(GH0937).
Các mẫu để xây dựng đường chuẩn, mẫu
kiểm chứng và mẫu chưa biết được sản xuất bởi IHCP. Vật liệu ngô chứa 2,5 % ngô
Bt11 đã được sử dụng
để chuẩn bị năm mẫu (S1 đến S5) chứa nồng độ đã biết của trình tự đặc hiệu-đích
ngô Bt11 về các số bản sao tuyệt đối như sau S1: 2367; S2: 1183; S3: 592; S4:
148; S5: 49 đã được sử dụng để thiết lập một đường chuẩn cho định lượng tuyệt đối
các số bản sao Bt11 trong các mẫu chưa biết. Để biết chi tiết về việc xác nhận
giá trị sử dụng của adh1, xem D.1. Các số bản sao tuyệt đối trong các mẫu
được biết đã được xác định bằng cách chia khối lượng ADN mẫu (được xác định bằng
định lượng huỳnh quang sợi đôi ADN bằng PicoGreen, Molecular Probes, cat. No.
P-7589) cho giá trị 1C trung bình được công bố cho các bộ gen ngô (2,725 pg)[14].
Mười hai mẫu chưa biết (sáu cặp mù
đôi, U1 đến U12) của ADN ngô chứa khoảng 77 và 1541 bản sao ngô Bt11 được phân
tích trên hai khay PCR bởi các phòng thử nghiệm tham gia. Các số bản sao tương ứng
với hàm lượng Bt11 từ 0,1 % đến 2,0 %. Các mẫu đã được chuẩn bị bằng cách trộn
ADN ngô Bt11 loại 100% và ADN ngô hoang dại thành các số bản sao tương ứng khác
nhau của trình tự đích. Ngoài ra, hai kiểm chứng đích ADN âm tính (ngô hoang dại
và ngô Bt176) và một khuếch đại kiểm chứng thuốc thử (nước không có axit
nucleic) đã được sử dụng.
Khuếch đại real-time PCR được lặp lại
3 lần cho các mẫu đối chứng và các mẫu tạo thành đường chuẩn và lặp lại 4 lần
cho các mẫu chưa biết.
Ban đầu, 14 phòng thử nghiệm từ chín
quốc gia EU khác nhau đã tham gia vào thử nghiệm cộng tác. Các hệ thống phát hiện
trình tự ABI PRISM® 7700/7900 SDS và ABI PRISM® 7000 đã được sử dụng.
Các kết quả của một phòng thử nghiệm đã bị loại trừ khỏi việc phân tích dữ liệu
do không sử dụng master-mix của quy trình này trong phân tích. Sau đó, các giá trị
số lạc đã được xử lý bằng các kiểm định Cochran và kiểm định Grubb theo quy
trình được điều chỉnh phù hợp IUPAC [12]
Đối với định lượng tương đối kết hợp với
hệ thống adh1 của ngô (xem A.1), hệ thống phát hiện đặc hiệu Bt11 cho độ
lệch chuẩn tương đối tái lập
trong khoảng từ 12,7 đến 33,5 % đối với định lượng tương đối (Bảng D.1). Chi tiết
về thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng D.1.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng D.1 - Dữ
liệu xác nhận giá trị sử dụng cho định lượng tương đối đặc hiệu ngô Bt11 với adh1 làm gen chuẩn
Mức độ trộn
0,1 %
0,3 %
0,7 %
1,0 %
1,3%
2,0 %
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2003
2003
2003
2003
2003
2003
Số lượng phòng thử nghiệm có kết quả
phản hồi
13
13
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
13
13
13
Số lượng mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
2
2
2
2
2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số lượng phòng thử nghiệm có số lạc
2
2
1
3
1
3
Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại
11
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
12
10
12
10
Số lượng mẫu được chấp nhận
22
22
24
20
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
20
Giá trị kỳ vọng (%)
0,1
0,3
0,7
1,0
1,3
2,0
Giá trị trung bình (%)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,3
0,7
1,0
1,2
1,8
Giá trị trung vị (%)
0,1
0,3
0,7
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,2
1,9
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)
33,5
19,0
24,4
12,7
27,0
18,4
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,11
0,17
0,48
0,36
0,92
0,95
D.1.2.3 Đặc hiệu phân
tử
D.1.2.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp được thiết kế dựa vào một
trình tự đích được mô tả trong EMBL/GenBank/DDBJ 78) với
mã số tiếp cận AY 123624 [47]. Trình tự này bao gồm một phần bộ gen
Zea mays (ngô) và một phần của cấu trúc gen chèn được tích hợp trong ngô biến đổi
gen sự kiện Bt11.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn
dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ78)
bằng sử dụng các trình tự nucleotit như là các chuỗi truy vấn với chương
trình BLASTN trên http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ [ngày 9 tháng 10 năm
2003]. Kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với
các trình tự đích dự kiến. Mồi xuôi và đoạn dò TaqMan® 78) phù hợp 100
% với một phần bên trong của plasmid pUC18 (mã số tiếp cận L08752), và do đó
nhiều trình tự ADN tổng hợp được khôi phục. Mồi ngược kéo dài qua vùng biên giới
tích hợp 3’ Bt11, ví dụ: vùng nối tiếp giáp giữa đoạn chèn (trình tự bắt nguồn
từ pUC18) và ADN bộ gen cây ký chủ (tương đồng cao với mã số tiếp cận AF030935,
một sự lặp lại đặc hiệu thùy phồng 180 bp đặc hiệu ở ngô). Mồi này đã tìm lại
được chỉ với mã số tiếp cận đích AY123624 [47] với 100 %
phù hợp, và bốn dòng vô tính người và chuột có 17 nucleotit phù hợp trong số 20
nucleotit.
D.1.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
Độ đặc hiệu đã được kiểm tra đối với
ADN được tách chiết từ các mẫu chuẩn được chứng nhận sẵn có của các cây trồng
biến đổi gen khác (IRMM-410R [đậu tương GTS 40-3-2], IRMM-411 [ngô Bt 176] và
các dãy IRMM-413 [ngô MON810]78)),
và đối với ADN veCtor nhân dòng pUC18 tinh khiết ở nồng độ lên đến 1 x 109.
Không có sự khuếch đại nào được phát hiện ở các mẫu chuẩn được chứng nhận, và
không thể phát hiện ADN pUC18 khi các số bản sao khuôn mẫu ít hơn hơn 1 x 109
trong PCR[47].
Trình tự đích là một trình tự bản sao
đơn trong bộ gen Bt11 đơn bội.
D.1.2.4 Tối ưu hóa
Phương pháp ban đầu đã được mô tả cho
LightCycler® và hóa chất TaqMan®78) và được điều chỉnh
thích hợp và tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700/7900 SDS
trước khi tiến hành xác nhận giá trị sử dụng trong các thử nghiệm cộng tác[15]. Thiết kế mồi
và đoạn dò được thực hiện bằng phần mềm OLIGO-Applet (TIB-MOLBIOL, Germany)78).
D.1.2.5 Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích là 10 bản sao của trình tự đích[47].
Số bản sao trình tự đích thấp nhất
trong các thử nghiệm cộng tác là 77.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
D.1.2.6 Giới hạn định
lượng
(LOQ)
LOQ tuyệt đối của phòng thử nghiệm
phân tích từ 40 đến 100 bản sao của trình tự đích 1471 Số bản sao trình tự đích
thấp nhất trong thử nghiệm cộng tác là 77.
Nồng độ tương đối thấp nhất của trình
tự đích trong thử nghiệm cộng tác là 0,1 %.
D.1.3 Điều chỉnh
Chưa có thông tin cụ thể.
D.1.4 Nguyên tắc
Đoạn ADN có kích thước 70 bp của vùng
biên giới tiếp giáp tích hợp đầu 3’ đặc hiệu sự kiện ngô Bt11 được khuếch đại bằng
cách sử dụng hai mồi đặc hiệu: mồi xuôi nhằm vào một trình tự bắt nguồn từ
pUC18 (vùng bên trong tới trình tự ADN được chèn vào) và mồi ngược nhằm vào
vùng biên giới tiếp giáp tích hợp đầu 3’ (11 nucleotit từ trình tự bắt nguồn từ
pUC18, 9 nucleotit từ bộ gen ngô). Các sản phẩm PCR tích lũy đo ở cuối mỗi chu
trình PCR (real-time) bằng một đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu (phù hợp 100 % với
một trình tự bắt nguồn từ pUC18) được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh
quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh
quang. Vì mục đích đó,
hóa chất TaqMan® 79) được sử dụng.
Các tín hiệu huỳnh quang đo được vượt
qua giá trị ngưỡng quy định bởi người phân tích sau một số chu trình nhất định.
Con số này được gọi là giá trị Ct. Đối với định lượng tổng số ADN Bt11 trong một
mẫu chưa biết, giá trị Ct được chuyển đổi thành một giá trị của số bản sao
tương ứng bằng cách so sánh với một đường chuẩn mà các giá trị Ct của đường này
liên quan trực tiếp với các số bản sao biết trước (phân tích hồi quy).
Khuếch đại tương tự đối với trình tự
đích đại diện ở ngô, ví dụ: adh1
(xem A.1). Đối với định lượng tương đối, số bản sao Bt11 và các trình tự đích ở
ngô được so sánh, xem D.1.9.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
D.1.5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng,
xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
D.1.5.2 Nước
D.1.5.3 Đệm PCR
(không có MgCI2), 10x
D.1.5.4 Dung dịch MgCl2, c(MgCI2)
= 25 mmol/l
D.1.5.5 Dung dịch
dNTP,
c(dNTP) = 2,5 mmol/l (mỗi loại).
D.1.5.6 Các
oligonucleotit
Chi tiết của các oligonucleotit được
liệt kê trong Bảng D.2.
Bảng D.2 -
Các oligonucleotit
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trình tự
ADN oligonucleotit
Nồng độ cuối
trong PCR
Bt113JFor
5'-gCg gAA CCC CTA TTT gTT TA-3'
750 nmol/l
Bt113Jrev
5'-TCC AAg AAT CCC TCC ATg Ag-3'
750 nmol/l
Bt113JFT
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
250 nmol/l
a FAM:
6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.
Chiều dài của đoạn khuếch đại ngô Bt11
is 70 bp.
Cần thiết có một bộ gồm các mồi và đoạn
dò riêng biệt cho gen chuẩn, xem ví dụ A.1 cho adh1 ngô.
D.1.5.7 Enzym ADN
polymerase chịu nhiệt
Enzym ADN polymerase của AmpliTaq Gold® 80).
D.1.5.8 Uracil
N-glycosylase
(tùy chọn)
D.1.5.9 Hỗn hợp phản ứng
khuếch đại
Chi tiết của các hỗn hợp phản ứng khuếch
đại được liệt kê trong Bảng D.3.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
Khuôn ADN (≤ 250 ng ADN
cho các chuẩn, tối đa 200 ng cho các mẫu chưa biết)
5 μl
ADN polymerase
AmpliTaq Gold®
1,5 μl
dUTP
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hệ thống khử nhiễm
AmpErase uracil N-glycosylase
0,3 U
Đệm phản ứng
Đệm A của TaqMan® (chứa chuẩn thụ động
ROX)a
1 x
MgCl2
4 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Xem D.1.6.1
xem D.1.6.1
dNTP
dATP, dCTP, dGTP
200 μmol/l mỗi
loại
Đoạn dò
Xem D.1.6.1
xem D.1.5.6
a ROX =
carboxy-X-rhodamine.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
D.1.6 Thiết bị, dụng
cụ
D.1.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
D.1.6.2 Máy chu trình
nhiệt
Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định ban
đầu được thử nghiệm với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM®7700/7900 SDS
(Applied Biosystems). Các hệ thống phát hiện real-time PCR khác có thể sử dụng
sau khi điều chỉnh phù hợp các điều kiện phản ứng. Phương pháp ban đầu đã được
phát triển và công bố cho LightCycler® 80) [47].
D.1.6.3 Các ống phản ứng
Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch
đại PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt real-time, ví dụ: khay phản ứng 96 giếng,
các ống quang học MicroAmp® (Applied Biosystems). Phương pháp ban đầu
được phát triển và công bố cho LightCycler và các ống mao quản bằng thủy tinh® 80) [47].
D.1.7 Cách tiến
hành: Chuẩn bị PCR
D.1.7.1 Yêu cầu chung
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp quy định tổng thể tích PCR
25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng, với các thành phần thuốc thử như được liệt kê
trong Bảng D.3.
Phương pháp được tối ưu trên hệ thống
phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700/7900 SDS 81)
(Applied Biosystems). Các chi tiết được trình bày trong Bảng D.3.
D.1.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Mỗi dãy kiểm tra phải bao gồm các kiểm
chứng như quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
Nếu các kiểm chứng không cho ra các kết
quả dự kiến, thì phải hủy kết quả và phân tích phải được lặp lại.
Ít nhất một phương án lựa chọn thay thế nên sẵn
có để làm kiểm chứng dương/vật liệu so sánh chuẩn, như sau.
- ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng cao
được tách chiết từ ngô Bt11 (ví dụ: dãy CRM IRMM-412 81) có thể sử dụng nếu số
lượng ADN được biết (ví dụ: được xác định bằng PicoGreen như mô tả trong
A.1.2.2), trên cơ sở tính toán các số bản sao của trình tự đích từ kích thước bộ
gen ngô [15].
D.1.7.3 Chương trình
thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ được
nêu trong Bảng D.4 được điều chỉnh phù hợp với hệ thống phát hiện trình tự ABI
PRISM®7700/7900 SDS, và sửa đổi từ chương trình ban đầu được công bố
cho LightCycler®81). Việc đề xuất các thuốc thử và các nồng độ phù hợp
cho LightCycler® 81) cần tham khảo tại công bố gốc[47].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thời gian
s
Nhiệt độ
°C
Tiền PCR: Khử nhiễm (tùy chọn)
120
50
Tiền PCR: hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính khuôn ADN
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
95
PCR (50 chu trình)
Bước 1
Biến tính
15
95
Bước 2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
60
60
D.1.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
Sự có mặt của các chất ức chế PCR có thể
có tác động lớn tới độ chính xác của số bản sao Bt11 ước đoán trong các mẫu
phân tích. Do đó việc không có mặt của các chất ức chế PCR cần xác nhận (xem
TCVN 7606 (ISO 21571) cho các phương pháp tách chiết ADN), ví dụ: bằng cách thiết
lập các dãy pha loãng ADN khuôn mẫu và kiểm tra sự tương ứng giữa các pha loãng
và sự khác biệt trong các giá trị Ct (ví dụ: một Ct tương ứng với gấp đôi của nồng
độ ADN khuôn mẫu).
Một phương pháp đặc hiệu taxon-đích
phù hợp [xem ví dụ A.1 (adh1 ở ngô)] có thể được sử dụng để thực hiện kiểm
tra sự ức chế PCR trước khi thực hiện định lượng Bt11.
Đối với định lượng tương đối GMO trong
các mẫu chưa biết, ví dụ: sử dụng phương pháp này kết hợp với phương pháp đặc
hiệu-taxon đích như trong A.1, điều quan trọng là số lượng khuôn mẫu ADN (ng)
tuyệt đối là như nhau ở cả PCR đặc hiệu taxon-đích và PCR đặc hiệu GMO. Nếu
không, các bản sao tuyệt đối của các phản ứng không thể so sánh trực tiếp, và cần
thiết phải điều chỉnh các số bản sao tương ứng. Nếu không, nồng độ GMO tương đối
không thể tính toán được.
D.1.9 Hiệu chuẩn và
tính kết quả
Các điểm chuẩn được tạo ra bởi các chuẩn
là các số bản sao tuyệt đối xác định của ADN bộ gen ngô Bt11 chứa trình tự
đích. Dựng đường chuẩn bằng cách vẽ đồ thị các giá trị Ct đối với logarit số bản
sao đích của các điểm chuẩn. Điều này có thể thực hiện được, ví dụ, bằng cách sử
dụng bảng tính của Microsoft Excel 82), hoặc trực tiếp bằng
các tùy chọn có sẵn với phần mềm hệ thống phát hiện trình tự.
Đường chuẩn được sử dụng để xác định nồng
độ ngô Bt11 (trong các số bản sao tuyệt đối) của các mẫu chưa biết. Mặc dù các
ADN mẫu có thể bị phân hủy do quá trình chế biến thực phẩm hoặc có thể chứa các thành
phần khác với ngô, điều này không ảnh hưởng đến nồng độ ngô Bt11 được tính toán (trong
các số bản sao tuyệt đối) của các mẫu chưa biết. Đối với định lượng tương đối,
hàm lượng GMO đơn bội, w, được xác định theo công thức sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trong đó:
NBt11 là Số bản sao tuyệt
đối của đích đặc hiệu Bt11 (được xác định bằng phương pháp này);
Nngô là số bản
sao tuyệt đối của đích đặc hiệu taxon-đích (được xác định bằng một phương pháp
cho ngô, ví dụ: A.1).
D.2 Phương pháp đặc
hiệu sự kiện để định lượng tương đối ADN ngô dòng MON 810 sử dụng real-time PCR
D.2.1 Giới thiệu
Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại
đặc hiệu và định lượng một phần đặc hiệu của gen ngô (Zea mays) đặc hiệu-taxon
(gen [hmg] mã hóa protein nhóm dễ biến đổi [48]) và của bản sao đơn vùng biên
giới tích hợp ADN của trình tự bộ gen và trình tự yếu tố được chèn có nguồn gốc
từ CaMV (promoter 35S), là kết quả của sự tái tổ hợp in vitro có mặt trong ngô
(Monsanto) MON 810 (“YieldGuard”) được biến đổi
gen để bảo vệ ngô khỏi côn trùng, để định lượng số lượng tương đối ADN ngô dòng
MON 810.
Các hạn chế, xem D.2.8.
D.2.2 Xác nhận giá
trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng
D.2.2.1 Yêu cầu chung
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đã kiểm tra độ tái lập và độ chính xác
của phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng dãy CRM
IRMM-413 nêu trên.
Số bản sao của các gen đích trong mỗi
bộ gen chưa được đánh giá.
Phương pháp ban đầu đã được phát triển
cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS 83).
D.2.2.2 Thử nghiệm cộng
tác
Phương pháp này được xác nhận giá trị
sử dụng trong một thử nghiệm cộng tác bởi Viện Đánh giá Rủi ro Liên bang (BfR)
phối hợp với Hiệp hội các nhà Hóa Ngũ cốc Hoa Kì (AACC), Trung tâm Nghiên cứu
chung (JRC) của Ủy ban Châu Âu (EC), Viện Vật liệu Chuẩn và Đo lường (IRMM), Viện
Sức khỏe và Bảo vệ Người tiêu dùng (IHCP) và GeneScan, Berlin. Nghiên cứu này được thiết
kế để đáp ứng những tiêu chí theo quy định trong quy trình được điều chỉnh phù
hợp IUPAC [12].
Mười lăm phòng thử nghiệm thực hiện
nghiên cứu bằng cách sử dụng hoặc thiết bị phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700, ABI
PRISM® 7900 (Applied Biosystems) 83) hoặc hệ thống phát
hiện real-time PCR iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories).
Mười bốn phòng thử nghiệm đã
báo cáo các kết quả.
Đối với tách chiết ADN, sử dụng hệ thống
tách chiết ADN GENE Spin (GeneScan)83) theo các hướng dẫn của nhà sản
xuất.
Tiến hành một tách chiết ADN cho mỗi mẫu
chưa biết. Mỗi mẫu thử nghiệm được phân tích bằng PCR 3 lần lặp lại.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Một thử nghiệm cộng tác mù đôi đã được
thiết kế. Mỗi phòng thử nghiệm được nhận mỗi mức độ của mẫu chuẩn được chứng nhận
(CRM) ngô GM dòng MON 810 trong hai mẫu chưa biết.
Chi tiết về các thử nghiệm cộng tác được
liệt kê trong Bảng D.5.
Bảng D.5 - Dữ
liệu xác nhận giá trị sử dụng cho định lượng MON 810 đặc hiệu sự kiện
Mẫu 1
< 0,02 %
Mẫu 2
0,10%
± 0,03 %
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5 %
± 0,04 %
Mẫu 4
1,00 %
± 0,05 %
Mẫu 5
2,0 %
± 0,1 %
Mẫu 6
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Năm thử nghiệm cộng tác
2003/04
2003/04
2003/04
2003/04
2003/04
2003/04
Số phòng thử nghiệm báo cáo kết quả
11
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
14
14
14
14
Số phòng có số lạc a
1
1
0
2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0
Số phòng thử nghiệm được
giữ lại
10
13
14
12
14
14
Giá trị trung bình (%)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,1023
0,4613
0,8327
1,7814
4,5154
Độ lệch chuẩn lặp lại sr
0,00736
0,03641
0,9606
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,28385
1,29374
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)
26,27
35,60
20,82
16,51
15,93
28,65
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,0206
0,1019
0,269
0,3848
0,7948
3,6225
Độ lệch chuẩn tái lập sR
0,02326
0,04646
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,26534
0,56609
1,65451
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)
83,03
45,43
43,5
31,86
31,78
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giới hạn tái lập R
(R = 2,8 x sR)
0,0651
0,1301
0,5619
0,743
1,5851
4,6326
a Giá trị số lạc được xác định với
các kiểm định Grubbs và Cochran.
D.2.2.3 Đặc hiệu phân
tử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các bộ mồi đã được thiết kế để khuếch
đại một trình tự ADN đặc hiệu cho vùng nối nhân tạo (vùng ranh giới tiếp giáp)
giữa cấu trúc gen được
tích hợp và bộ gen vật chủ, mà không xảy ra trong tự nhiên.
D.2.2.3.2 Đặc hiệu lý
thuyết
Không thấy có sự tương đồng về trình tự
giữa các trình tự ADN của ngô không biến đổi gen với cây trồng khác trong các
tìm kiếm tại ngân hàng dữ liệu (cơ sở dữ liệu GenBank®; BlastN®
2.2.1 tìm kiếm từ
01/10/2013 84)). Một tìm kiếm với chương trình
BLASTN84) trên http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast [ngày 14 tháng 9
năm 2004] cho các kết quả 100 % tương tự tới mã số tiếp cận AF434709 mô tả các
vị trí tích hợp đặc hiệu MON 810 trong bộ gen ngô.
D.2.2.3.3 Xác định thực
nghiệm đặc hiệu
Các bột ngô khô CRM IRMM-41384)
chứa < 0,02 % đến 5 % ngô biến đổi gen dòng MON 810 đã được xác định.
Các kiểm tra đặc hiệu trước khi nghiên
cứu đã cho thấy không có phản ứng chéo của bộ mồi/đoạn dò với mẫu/loài không phải
đích sau: ADN đậu tương.
Không có phản ứng chéo được quan sát
thấy với các sự kiện ngô biến đổi gen sau: Event176, Bt11, T25, GA21 và đậu
tương GTS 40-3-2.
D.2.2.4 Tối ưu hóa
Tối ưu hóa các nồng độ thuốc thử được
tiến hành trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS và
trên hệ thống GenAmp 5700 SDS sử dụng hóa chất TaqMan® 85).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
D.2.2.5 Giới hạn phát
hiện
(LOD)
LOD tuyệt đối đã không được đánh giá
trong thử nghiệm cộng tác. Theo phòng thử nghiệm phân tích, LOD tuyệt đối, được
xác định trong TCVN 7608 (ISO 24276), là 5 bản sao trình tự đích.
LOD tương đối đã không được đánh giá
trong thử nghiệm cộng tác. Theo phòng thử nghiệm phân tích, LOD tương đối, được
xác định trong TCVN 7608 (ISO 24276) ít nhất là 0,1 %.
D.2.2.6 Giới hạn định
lượng (LOQ)
LOQ tuyệt đối đã không được đánh giá
trong thử nghiệm cộng tác. Theo phòng thử nghiệm phân tích, giới hạn định lượng
tuyệt đối được xác định là 10 bản sao trình tự đích.
LOQ tương đối đã không được đánh giá
trong thử nghiệm cộng tác. Theo phòng thử nghiệm phân tích, giới hạn định lượng
tương đối được xác định ít nhất là 0,1 % (bằng với điểm nồng độ thấp nhất của
đường chuẩn được sử dụng).
D.2.3 Điều chỉnh
Chưa có thông tin cụ thể.
D.2.4 Nguyên tắc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Để định lượng tương đối hàm lượng ADN ngô dòng
MON 810, sử dụng đồng thời các mồi và đoạn dò đặc hiệu để khuếch đại đoạn 79 bp
của gen hmg trong các mẫu chuẩn ngô.
D.2.5 Thuốc thử
D.2.5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử được
sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).
D.2.5.2 Nước
D.2.5.3 Đệm PCR
(không có MgCI2), 10x
D.2.5.4 Dung dịch MgCl2, c(MgCl2)
= 25 mmol/l
D.2.5.5 Dung dịch
dNTP,
c(dNTP) = 2,5 mmol/l (mỗi loại)
D.2.5.6 Các
oligonucleotit
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng D.6 -
Các oligonucleotit
Tên
Trình tự
ADN ligonucleotit
Nồng độ cuối trong
PCR
Trình tự đích gen đối chứng
ZM1-F
5’-TTg gAC TAg AAA TCT CgT gCT gA-3’
300 nmol/l
ZM1-R
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
300 nmol/l
Đoạn dò ZM1
5'-FAM - CAA TCC ACA CAA ACg
CAC gCg TA-TAMRA-3'a
160 nmol/l
Trình tự đích GMO
Mail- F1
5’-TCg AAg gAC gAA ggA CTC TAA
CgT-3'
300 nmol/l
Mail- F2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
300 nmol/l
Đoạn dò Mail-S2
5’-FAM-AAC ATC CTT TgC CAT TgC CCA
gC-TAMRA P-3'
180 nmol/l
a FAM:
6-carboxylfluorecein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine
Chiều dài sản phẩm PCR đặc hiệu gen hmg
là 79 bp; chiều dài sản phẩm PCR đặc hiệu MON 810 là 92 bp.
D.2.5.7 Enzym ADN
Polymerase chịu nhiệt
Enzym ADN polymerase của AmpliTaq Gold® 86)
D.2.5.8 Uracil N-glycosylase (tùy chọn)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các chi tiết của hỗn hợp phản ứng khuếch
đại được liệt kê trong Bảng D.7
D.2.6 Thiết bị, dụng
cụ
D.2.6.1 Yêu cầu chung
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
D.2.6.2 Máy chu trình
nhiệt
Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định ban
đầu được thử nghiệm với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700
SDS và GeneAmp® 5700 SDS (Applied Biosystems)87). Các
hệ thống phát hiện real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh
các điều kiện phản ứng phù hợp.
D.2.6.3 Các ống phản ứng
Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch
đại PCR đối với mỗi máy chu trình nhiệt, ví dụ: Khay phản ứng quang học 96-giếng
ABI PRISM®, hoặc các nắp quang học MicroAmp® (8 nắp ống/
dải, phẳng) (Applied Biosystems)87).
D.2.7 Cách tiến
hành: Chuẩn bị PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chuẩn bị PCR cho trình tự đích đặc hiệu
taxon và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt.
Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang đánh dấu khác nhau cho các đoạn
dò) chưa được kiểm tra hoặc xác nhận giá trị sử dụng.
Phương pháp quy định tổng thể tích PCR
25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng, với các thành phần thuốc thử như được liệt kê
trong Bảng D.7
Bảng D.7 - Hỗn
hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng
Tổng thể tích phản ứng
25 μl
ADN khuôn được bổ sung (2,3 ng đến
150 ng ADN ngô)
5 μl
ADN polymerase
AmpliTaq Gold®
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hệ thống khử nhiễm
dUTP
400 μmol/l
AmpErase uracil N-glycosylase
0,5 U
Đệm phản ứng
Đệm A của TaqMan® (chứa
chuẩn thụ động ROX)a
1 x
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6,5 mmol/l
Mồi
Xem Bảng D.6
Xem Bảng
D.6
dNTP
dATP, dCTP, dGTP
200 pmol/l
mỗi loại
Đoạn dò
Xem Bảng D.6
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a ROX =
carboxy-X-rhodamine.
D.2.7.2 Các kiểm chứng
PCR
Có thể sử dụng các mẫu chuẩn được chứng
nhận MON 810 (vật liệu chứa < 0,02 % đến 5 % ngô biến đổi gen) được sản
xuất bởi IRMM, Geel, Bỉ (dãy IRMM-413) làm kiểm chứng dương và vật liệu so sánh
chuẩn.
Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần
bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
D.2.7.3 Chương trình
thời gian - nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ được
nêu trong Bảng D.8 được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM®
7700 SDS (Applied Biosystems)88). Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử
dụng, chương trình được sử dụng kết hợp với enzym ADN polymerase của AmpliTaq
Gold® 88). Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có
thể yêu cầu những điều chỉnh thích hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban
đầu phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.
Bảng D.8 mô tả các điều kiện phản ứng.
Bảng D.8 -
Quy trình thực hiện: Các điều kiện phản ứng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nhiệt độ °C
Tiền-PCR: Khử nhiễm (tùy chọn)
120
50
Tiền-PCR: Hoạt hóa ADN polymerase và
biến tính ADN khuôn
600
95
PCR (45 chu trình)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bước 1
Biến tính
15
95
Bước 2
Gắn mồi và kéo dài
60
60
D.2.8 Các hạn chế
và diễn giải các kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH Nếu ADN ngô bị
loại bỏ hoặc bị phân hủy nhiều trong suốt quá trình chế biến thực phẩm (ví dụ:
dầu tinh luyện) hoặc nếu ngô chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong mẫu phân tích, thì số bản sao đặc
hiệu GM và/hoặc số bản sao đặc hiệu đổi chứng ngô sẽ bằng hoặc dưới giới hạn định
lượng và các phương pháp này sẽ không áp dụng được.
D.2.9 Hiệu chuẩn và
tính kết quả
Sau khi xác định một giá trị ngưỡng
trong giai đoạn khuếch đại logarit [ví dụ: giá trị trong khoảng 0,01 đến 0,1 của
thuốc nhuộm phát huỳnh quang được chuẩn hóa (Rn)], phần mềm thiết bị tính toán
các giá trị Ct cho mỗi phản ứng. Các giá trị Ct đo được cho các điểm chuẩn được
chuẩn bị từ các CRM dành cho các phân tích định lượng (CRM IRMM-413) trong hệ
thống PCR đặc hiệu MON 810 hoặc đặc hiệu taxon ở ngô, tương ứng, được vẽ đồ thị
đối với logarit tự nhiên của các số bản sao ADN. Các số bản sao ADN của mẫu
chưa biết có được bằng cách nội suy từ các đường chuẩn.
Dựng đường chuẩn bằng cách vẽ đồ thị
các giá trị Ct đối với logarit số bản sao đích của các điểm chuẩn. Điều này có
thể thực hiện được, ví dụ, bằng cách sử dụng bảng tính của Microsoft Excel 88),
hoặc trực tiếp bằng các tùy chọn có sẵn với phần mềm hệ thống
phát hiện trình tự.
Để xác định lượng ADN MON 810 trong mẫu
thử nghiệm, lấy số bản sao MON 810 chia cho số lượng bộ gen ngô tương đương và
nhân với 100 để có được giá trị phần trăm. Đối với giá trị 1C, xem Tài liệu
tham khảo [14],
Ngoài chương trình chạy phân tích định
lượng, cần phải thực hiện một chương trình chạy giám sát.
Chạy giám sát cần được bao gồm trong thử nghiệm cộng tác và có thể làm quy
trình phân tích hoàn thiện hơn. Chạy giám sát quan trọng nhất khi các nền mẫu
phân tích không cho kết quả với hiệu lực rõ ràng về hàm lượng và chất lượng
ADN. Bằng cách kiểm tra hai mức pha loãng khác nhau của chất chiết axit nucleic
trong chạy giám sát (ví dụ: dung dịch ADN ở mức pha loãng 1:10 và 1:40), có thể
xác định khả năng có mặt của các chất ức chế khuếch đại và có thể xác định mức
pha loãng thích hợp của chất chiết axit nucleic thu được từ mẫu kiểm tra phù hợp
với phạm vi đường chuẩn của phân tích định lượng.
Thư mục tài
liệu tham khảo
[1] DIVIACCO, S., NORIO, P., ZENTILIN, L,
MENZO, S., CLEMENTI, M., BIAMONTI, G., RIVA, S , FALASCHI, A., and GIACCA, M. A
novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by
coamplification of competitive templates. Gene, 1992, 122(2), 313-320
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[3] ORLANDO, C, PINZANI, P. and PAZZAGLI,
M. Developments in quantitative PCR. CM Chem. Lab. Med,1998, 36(5),
255-269
[4] YANG, B., YOLKEN, R., and VISCIDI,
R. Quantitative polymerase chain reaction by monitoring enzymatic activity of ADN
polymerase. Anal. Biochem., 1993, 208(1): 110-116
[5] THOMPSON, M., and WOOD, R.
Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in Analytical Chemistry
Laboratories, J. Pure App. Chem., 1995, $7(4) 649-666
[6] Alinorm 03/23 Criteria for
Evaluating Acceptable Methods of Analysis for Codex Purposes. Codex
Alimentarius Twenty-sixth Session, Rome, Italy, 30 June - 5 July 2003
[7] http://www.eurachem.uLpt/guides/mvai.htm
ISBN 0-948926-12-0
[8] Eurachem Guide: “The fitness
for Purpose of Analytical methods - A laboratory Guide to Method Validation and
Related Topics”, Eurachem
Working Group, Dec 1998
[9] Eurachem/CITAG Guide: Quantifying
Uncertainty in Analytical Measurement, Ellisson, S.L.R., Rosslein, M.,
Williams, A., 2000, 2nd Ed.
[10] IRMM Certified Reference
Material Reports and Certificates, http://www.irmm.irc.be/rm/cert-
reports.html
[11] HERNANDEZ, M., DUPLAN, M.-N.,
BERTHIER, G., VATTILINGOM,
M., HAUSER, W., FREYER, R., PLA, M. and
BERTHEAU, Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems
for specific detection and
quantification of lea mays L. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 2004, 52; 4632-4637
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[13] DELLAPORTA, S.L., WOOD, J..
HICKS, J.B. A plant ADN
minipreparation: version II. Plant MoL Biol. Rep.
Vol.1,1983,4:19-2156
[14] ARUMUGUNATHAN, K., EARLE, E.D.
Nuciear ADN content of some important plant species. Plant Mot.
Biol.Rep.
1991,9:208-218
[15] Community Reference Laboratory
(2004a). GMO specific real-time PCR system. Protocol for event-specific
quantitation of Bt11 in maize. Protocol published by the European Commission,
Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection. http://gmo-cri.irc.it/detectionrnethocls/Bt11-protocoLpdf.
6 pp
[16] Community Reference Laboratory
(2004b). Validation of the GMO specific detection method
developed by NVI/INRA for Bt11 in sweet maize. Report published by
the European Commission, Joint Research Centre, Institute for Health and
Consumer Protection.
http://gmo-
crl.jrc.rt/summaries/CRL%20Bt11%20Sweet%20maize%20validation%20report.pdf. 9 pp
[17] JAENICKE-DESPRES, V., BUCKLER,
E.S., SMITH, B.D., GILBERT, M.T.P., COOPER, A., DOEBLEY, J. and PAABO, S. Early Allelic
SeleCtion in Maize as Revealed by Ancient ADN. Science, 2003, 302:
1206-1208
[18] PAUWELS, J., KRAMER, G.N.,
SCHIMMEL, H., ANKLAM, E., LIPP, M.
BRODMANN, P. The
Certification of Reference Materials of Soya bean Powder with different Mass
Fractions of RoundupReady®
Soya bean,
EC certification report EUR 18683 EN, 1999, ISBN 92-828-5925-8
[19] PAULI, U., LINIGER, M., SCHROTT, M.,
SCHOUWEY, B., HOBNER. Ph., BRODMANN, P., and EUGSTER, A. Quantitative Detection of
Genetically Modified Soybean and Maize: Method Evaluation in a Swiss Ring
Trial. Mitt. Lebens. undHyg. 2001,92:145-158
[20] HUBNER, Ph., WAIBLINGER,
H-U., PIETSCH, K., and
BRODMANN, P. Validation of PCR Methods for Quantitation of Genetically Modified
Plants in
Food. J. AOAC int, 2001, 84:1855-1864
[21] VODKIN, L.O., RHODES, P.R.,
GOLDBERG, R.B. Ca Lectin gene insertion has the structural
features of a transposable element. C0//.1983, 34: 1023-1031
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[23] SLMB-Methode 52B/2.1.3/2000
(CD-Rom, EidgenOssische Materialzentrale, PO Box, CH 3000, Bern)
[24] GRUBBS, F.E. Procedures for detecting outlying
observations in samples. Technometrics, 1969, 11:1-21
[25] HEMMER, W. Foods Derived from
Genetically Modified Organisms and Detection Methods. In: BATSreport
(Agency for Biosafety research and assessment of technology Impacts of the
Swiss priority, Programme Biotechnology of the Swiss National Science
Foundation, Basel, Switzerland), 1997,2,97
[26] BRUNT, A., CRABTREE, K., DALLWITZ,
M., GIBBS, A., WATSON, L. Viruses of Plants: Descriptions
and Lists from the VIDE Database. 1996,1484 pp. C.A.B. International, U.K.
[27] Qiu, S.G., WINTERMANTEL, W.M.,
SHA, Y., and SCHOELZ, J.E. Light-Dependent Systemic Infection of
Solanaceous Species by Cauliflower Mosaic Virus Can Be Conditioned by a Viral
Gene Encoding an Aphid Transmission Factor. Virology, 1997,227, pp 180-188
[28] WOLF, C, SCHERZINGER, M., WURZ, A.,
PAULI, U., HOBNER, Ph.
and LOTHY, J. DeteCtion of cauliflower mosaic virus by the polymerase chain reaction: testing
of food components for falsepositive 35S-promoter screening results. Eur Food
Res Technol. 2000, 210: 367-372
[29] TRAPMANN, S., LE GUERN, L,
KRAMER, G.N., SCHIMMEL, H., PAUWELS, J., ANKLAM, E., VAN DEN
EEDE, E., BRODMANN, P. The
Certification of a new set of Reference Materials of Soya bean Powder with
different Mass Fractions of
Roundup ReadyTM Soya bean, 2000. EC certification report EUR 19573 EN,
ISBN 92-828-9639-0
[30] LEE, L.G., CONNELL, C.R., and
BLOCH W. Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic
probes. Nucleic Acids Research, 1993,21(16), 3761-6
[31] HUPFER, C, HOTZEL, H., SACHSE,
K., ENGEL, K.-H. Detection of the
genetic modification in heat treated products of Bt maize by polymerase chain reaction. Lm.
Unters. Forsch., 206 (Band A), 1998, pp. 203-207.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[33] KURJBARA, H., SHiNDO, Y.,
MATSUOKA, T., TAKU80, K., FUTO, S.,
AOKI, M., HIRAO, T., AKIYAMA, H., GODA, Y., TOYODA, M. and HfNO, A. Novel
Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean.
J.AOAC Int. 2002, 85, 1077-1089
[34] SHINDO, Y., KURIBARA, H.,
MATSUOKA, T., FUTO, S., SAWADA, C.,
SHONO, J., AKIYAMA, H.,
GODA, Y., TOYODA, M.
and HINO, A. Validation of Real-Time PCR Analyses for Line-specific
Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean Using New Reference
Molecules. J.AOAC Int. 2002, 85, 1119-1126
[35] InstruCtion Manual for Testing
and Analysing Genetically Modified Food -Quantitative PCR, Japanese
Agricultural Standard Testing and Analysis Handbook Series (Centre for Food
Quality, Labelling and Consumers Services, Saitama, Japan). 20G2
[36] Testing for Foods Produced by
Recombinant ADN Techniques, Ministry of Health, Labor and Welfare (Ministry of
Health, Labour and Welfare, Japan), 2002
[37] Guideline of Detection Methods
of Genetically Modified Foods, Korean Food and Drug Administration, Korea
[38] Testing Manual for Genetically Modified Agricultural Products by National
Agricultural Quality Services, Korea
[39] Official Methods of Analysis
of AOAC INTERNATIONAL, 17th Ed., 2000, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg,
MD, Appendix D, pp 2-11
[40] COCHRAN, W.G. The distribution of
the largest of a set of estimated variances as a fraction of their
total. Annals of Eugenics, 1949, 11:47-52
[41] GRUBBS. F.E. Sample criteria for
testing outlying observations.. Ann. Math. Statist. Assn. 1950, 21:
27-58
[42] KOPPEL, E., STADLER, M., LUTHY, J.,
HUBNER, P. Sensitive method for the Detection of the Genetically Engineered Soy Bean “Roundup
Ready®, Mitt. Gebiete. Hyg. 1997, 88: 164-175
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[44] Eurachem Guide: “Quantifying
Uncertainty in Analytical Measurement’, Eilisson, L.R., Rosslein,
M.,Williams, A., 2000
[45] Eurachem/CITAG Guide. Traceabiliiy
in Chemical Measurement, Eilisson, L.R., Kina, B., Rosslein, M., Salit,
M..Williams. A., 2003
[46] MATSUOKA, T., KURIBARA,
H., TAKUBO, K.(AKIYAMA, H., MIURA, H., GODA, Y., KUSAKABE,
Y., ISSHIKI, K., TOYODA, M., & HJNO, A. DeteCtion of Recombinant ADN
Segments introduced to Genetically modified Maize (Zea mays). J. Agric. Food
Chem. 2002, 50, 2100-2109
[47] RØNNING, S.8., VAJTILINGOM, M„
BERDAL, K.G. & HOIST-JENSEN, A. Event specific reaMIme quantitative PCR for
genetically modified 8t11maze (Zea mays). European Food Res. Technoi.
2003, 216: 347-354
[48] KRECH, A.B., WURZ, A, STEMMER, C, FEIX, G.,
GRASSER, K.D. Structure of genes
encoding chromosomal HMG1 proteins from maize. Gene, 1999, 234:45-50
[49] Institute for Reference Materials
and Measurements (SRMM): Certified Reference Materials ERM-XYOOOxy.
CERTIFICATION REPORT. The certification of dry-mixed maize powder with
different mass fractions of
MON810 maize Certified Reference Materials ERM BF413a, BF413b, BF413C, BF413d,
BF413e, BF413f. http:AVww.erm-crm.org. 2004
[50] HOLLAND, P.M., ABRAMSON, R.D. and
GELFAND D.H. Detection of
specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’ to 3' exonuclease activity of Thermus
aquaticus ADN polymerase. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88(16),
7276-80
[51] TCVN 6910-1:2001 (ISO
5725-1:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả
đo - Phần 1:
Nguyên tắc và định nghĩa chung
[52] TCVN 6910-2:2001 (ISO
5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả
đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương
pháp đo tiêu chuẩn
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[54] TCVN 6910-4:2001 (ISO
5725-4:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả
đo - Phần 4: Các
phương pháp cơ bản xác định độ đúng của phương pháp đo tiêu chuẩn
[55] TCVN 6910-5:2002 (ISO 5725-5:1998),
Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 5: Các
phương pháp xác định độ chụm của phương pháp đo tiêu chuẩn
[56] TCVN 6910-6:2002 (ISO
5725-6:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả
đo - Phần 6: Sử dụng
các giá trị độ chính xác trong thực tế
[57] HINO, A., MATSUOKA, T., KURIBARA, H.
FUTO, S., OGAWA, M., YOSHIMURA, T., SHiNDO, Y.2000,
WO02/34943 A1 (patent pending)
[58] GELFAND, D.H., HOLLAND, P.M.,
SAIKI, R.K, and WATSON, R.M. 1993, US Patent 5,210,015
[59] DING J., JIA J., YANG L, WEN
H., ZHANG C., LIU W. et
al. Validation of a rice specific gene, sucrose phosphate synthase, used as the
endogenous reference gene for quanlitative and realtime quantitative PCR detection of
transgenes. J. Agric. Food Chem. 2004, 52 pp. 3372-3377
[60] ENGL. Definition of minimum
performance requirements for analytical methods of GMO testing. Brussels:
European Network of GMO Laboratories. 8 p. Available (viewed 2013-03-21) at:
http://qmo-crl.irc.ec.europa.eu/doc/Min Perf Requirements Analytical
methods.pdf
[61] TCVN ISO/IEC 17025, Yêu cầu chung về năng
lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn.
[62] YANGL., PAN A., JIA J., DING J.,
CHEN J., HUANG C. et al.
Validation of a tomato specific gene, LAT52, used as an endogenous
reference gene in qualitative and real-time quantitative PCR detection of
transgenic tomatoes. J. Agric. Food Chem. 2005, 53 pp. 183-190
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[64] Available (viewed 2013-03-21) at:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cqi
MỤC LỤC
Lời nói đầu
Lời giới thiệu
1 Phạm vi áp dụng
2 Tài liệu viện
dẫn
3 Thuật ngữ và
định nghĩa
4 Nguyên tắc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6 Thiết bị, dụng
cụ
7 Hướng dẫn
liên quan đến quy trình
8 Diễn giải kết
quả
9 Biểu thị kết
quả
10 Báo cáo thử
nghiệm
Phụ lục A (Tham khảo) Các phương pháp
đặc hiệu taxon-đích
Phụ lục B (Tham khảo) Các phương pháp
sàng lọc
Phụ lục C (Tham khảo) Các
phương pháp đặc hiệu cấu trúc
Phụ lục D (Tham khảo) Các phương pháp
đặc hiệu sự kiện
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66