Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12463:2018 về Sữa - Xác định dư lượng narasin và monensin - Phương pháp sắc ký lỏng

• Số hiệu: TCVN12463:2018
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2018

Nồng độ chất chuẩn, ng/ml	Thể tích dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (3.21), ml	Thể tích cuối cùng, ml	Nồng độ cuối cùng, ng/ml	Loại mẫu ^a)
10000	1	20	500	C
10000	2,2	50	440	C
10000	2	50	400	C
10000	1,6	50	320	C
10000	0,8	50	160	C
10000	0,5	50	100	B,C,S
10000	0,4	50	80	B,C,S
500	4	50	40	B,C,S
500	2	50	20	B,C,S
500	1	50	10	B,C,S
500	0,5	50	5	B,C,S
500	0,25	50	2,5	B,C,S
500	0,1	50	1	B,C,S
500	0,05	50	0,5	B,C,S
500	0,025	50	0,25	B
^a) B: Bò, C: gà, S: lợn.

3.23  Dung dịch nội chuẩn gốc, 1 000 µg/ml

Cân 10 mg ± 0,1 mg chất chuẩn đối chứng nigericin (3.18), cho vào bình định mức 10 ml (4.2). Hòa tan và pha loãng bằng metanol đã trung hòa (3.11) đến vạch.

3.24  Dung dịch nội chuẩn làm việc, 1 µg/ml

Cho 0,05 ml dung dịch nội chuẩn gốc (3.23) vào bình định mức 50 ml (4.2) và pha loãng bằng etyl axetat (3.5) đến vạch.

3.25  Dung dịch chuẩn gốc kiểm soát chất lượng (QC) monensin, 1 000 µg/ml

Cân 10 mg ± 0,1 mg monensin (3.16), cho vào bình định mức 10 ml (4.2). Hòa tan và pha loãng bằng metanol đã trung hòa (3.11) đến vạch.

3.26  Dung dịch chuẩn gốc QC narasin, 1 000 µg/ml

Cân 10 mg ± 0,1 mg chất chuẩn đối chứng narasin (3.17), cho vào bình định mức 10 ml (4.2). Hòa tan và pha loãng bằng metanol đã trung hòa (3.11) đến vạch.

3.27  Dung dịch QC monensin, 20 µg/ml

...

...

...

3.28  Dung dịch bổ sung QC monensin

Pha loãng dung dịch QC monensin (3.27) trong etyl axetat (3.5), dùng sơ đồ pha loãng như trong Bảng 2.

Bảng 2 - Chuẩn bị dung dịch bổ sung kiểm soát chất lượng monensin

Nồng độ monensin,

µg/ml

Thể tích dung dịch QC monensin (3.27),

ml

Thể tích cuối cùng,

ml

...

...

...

ng/ml

Nồng độ nền mẫu,

ng/g^a

20

4

20

4000

200

20

...

...

...

20

2000

100

20

1,5

25

1200

60

20

...

...

...

20

1000

50

20

0,75

25

600

30

20

...

...

...

20

500

25

20

0,5

25

400

20

20

...

...

...

20

300

15

20

0,25

20

250

12,5

20

...

...

...

25

200

10

20

0,2

25

160

8

20

...

...

...

25

100

5

20

0,1

25

80

4

20

...

...

...

25

40

2

20

0,025

25

20

1

^a Nồng độ nền mẫu được tính theo thể tích 250 µl bổ sung đối với 5 g nền mẫu. Chuẩn bị dung dịch bổ sung kiểm soát chất lượng dựa vào MRL hoặc dùng sai của nền mẫu được phân tích.

...

...

...

Cho 1 ml dung dịch chuẩn gốc QC narasin (3.26) vào bình định mức 50 ml (4.2). Hòa tan và thêm etyl axtetat (3.5) đến vạch.

3.30  Dung dịch bổ sung QC narasin

Pha loãng các dung dịch QC narasin 1 000 µg/ml (3.25) và 20 µg/ml (3.29) trong etyl axtetat (3.5), dùng sơ đồ pha loãng như trong Bảng 3.

Bảng 3 - Chuẩn bị dung dịch bổ sung kiểm soát chất lượng narasin

Nồng độ narasin,

µg/ml

Thể tích dung dịch QC narasin (3.25 hoặc 3.29),

ml

Thể tích cuối cùng

...

...

...

Nồng độ cuối cùng

ng/ml

Nồng độ nền mẫu

ng/g^a

1000

0,96

50

19200

960

...

...

...

0,48

50

9600

480

1000

0,24

50

4800

240

...

...

...

2,5

25

2000

100

20

1,25

25

1000

50

...

...

...

0,75

25

600

30

20

0,5

20

500

25

...

...

...

0,3

20

300

15

20

0,15

20

150

7,5

...

...

...

CHÚ THÍCH  Có thể chuẩn bị các chất chuẩn với thể tích khác nhau với điều kiện có cùng nồng độ. Dung dịch gốc có thể được chỉnh đối với độ tinh khiết của chất chuẩn đối chứng trong suốt quá trình chuẩn bị. Các dung dịch gốc và cất chuẩn hiệu chuẩn bền đến 35 ngày khi được bảo quản ở 4 °C.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Pipet định mức, loại A, bằng thủy tinh, có các kích cỡ thích hợp hoặc pipet dịch chuyển dương.

4.2  Bình định mức, loại A, có các dung tích thích hợp.

4.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến ± 0,00001 g.

4.4  Cân, có thể cân chính xác đến ± 0,01 g.

4.5  Ống đong chia vạch, bằng thủy tinh, kích cỡ các loại.

4.6  Ống ly tâm bằng polypropylen, đáy nhọn, dung tích 50 ml, có nắp đậy.

...

...

...

4.8  Máy trộn vortex nhiều ống.

4.9  Máy làm khô bằng nitơ, ví dụ: Techne DB-3A dri-block 3) hoặc loại tương đương.

4.10  Bộ phân phối chân không, có khóa bằng PTFE và giá để ống nghiệm dài 16 mm hoặc loại tương đương.

4.11  Bể siêu âm.

4.12  Cột chiết pha rắn (SPE), ví dụ: Waters silica Sep-Pak Plus 690 mg hoặc Waters silica Sep-Pak Vac 6 ml, 500 mg ^4).

4.13  Hệ thống sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần, loại ba tứ cực, ví dụ API 4000 ^5) hoặc loại tương đương.

4.14  Hệ thống sắc ký lỏng, ví dụ: Waters 2695 ^4), hoặc loại tương đương.

4.15  Cột sắc ký lỏng, ví dụ: Aqua C₁₈,150 mm x 2,0 mm, cỡ hạt 5 µm ^6), hoặc loại tương đương.

4.16  Nồi cách thủy, có thể kiểm soát ở nhiệt độ nhất định.

...

...

...

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

6.1.1  Đồng hóa và bảo quản mẫu

Cho 5,0 g ± 0,1 g mẫu vào ống ly tâm 50 ml (4.6) trộn bằng máy trộn vortex (4.8) để đồng hóa.

Bảo quản tất cả mẫu ở nhiệt độ - 20 °C hoặc thấp hơn khi chưa xử lý hoặc chưa lấy phần mẫu thử. Nên bảo quản mẫu bổ sung cùng với các mẫu phân tích để xác nhận tính ổn định khi bảo quản. Mẫu có thể được làm lạnh đến 72 h. Có thể đông lạnh sữa để bảo quản, nếu cần. Sữa để bảo quản cần phải đồng nhất vì sẽ khó đồng hóa sau khi rã đông.

6.1.2  Chuẩn bị phần mẫu kiểm soát chất lượng và phần mẫu thử kiểm soát

6.1.2.1  Chuẩn bị tối thiểu ba phần mẫu kiểm soát trong ngày phân tích.

...

...

...

b) Có thể lấy nhiều phần dịch lỏng SPE từ mỗi phần mẫu kiểm soát (khoảng ba phần từ mỗi phần mẫu thử). Xác định số phần dịch lỏng cần thiết đối với các dung dịch chuẩn tương ứng với nền mẫu và các phần dịch lỏng còn lại làm kiểm soát âm tính (hai phần đối với các mẫu kiểm soát; các phần dịch lỏng còn lại có thể được dùng để pha loãng, nếu cần).

6.1.2.2  Chuẩn bị các phần mẫu thử 5,0 g ± 0,1 g kiểm soát chất lượng bổ sung, trong ngày phân tích.

a) Thêm các dung dịch bổ sung QC monensin và narasin kiểm soát chất lượng (3.28 và 3.30) vào phần mẫu thử, nếu cần.

b) Cho 500 µl dung dịch nội chuẩn (3.24) vào 5,0 g ± 0,1 g phần mẫu thử và trộn đều.

6.1.2.3  Dung dịch bổ sung kiểm soát chất lượng và dung dịch nội chuẩn được thêm vào các phần mẫu kiểm soát chất lượng và phần mẫu thử kiểm soát, trộn đều bằng máy trộn vortex (4.8) và để yên phần mẫu thử trong khoảng 10 min đến 30 min trước khi bắt đầu tiến hành quy trình chiết.

6.1.2.4  Thực hiện đối với các mẫu kiểm soát chất lượng và mẫu kiểm soát như nêu trong quy trình chiết trong 6.2.

6.2  Chiết mẫu

a) Chuẩn bị theo 6.1.

b) Thêm 15 ml ± 1 ml dung môi chiết và trộn đều bằng cách đảo chiều nhẹ vật chứa (20 lần).

...

...

...

c) Ly tâm 5 min với gia tốc khoảng 1734 g (4.7) ở 4 °C.

d) Làm đông lạnh lớp phía dưới bằng cách cho ống vào tủ đông giữ ở - 80 °C trong 15 min đến 20 min.

CHÚ THÍCH  Có thể để trong tủ đông ở - 20 °C, nhưng thời gian cấp đông phải được chỉnh tương ứng.

e) Gạn dịch lỏng vào ống đong chia vạch dung tích 50 ml (4.5).

f) Đặt ống trong nồi cách thủy (4.16) để ở 35 °C khoảng 5 min để hóa lỏng lượng chứa

g) Thêm lần hai, 15 ml ± 1 ml dung môi chiết vào sữa và trộn đều bằng cách đảo chiều nhẹ (20 lần).

h) Ly tâm 10 min ở khoảng 1734 g và 4 °C.

i) Làm đông lạnh lớp phía dưới bằng cách giữ ống ở - 80 °C từ 15 min đến 20 min.

CHÚ THÍCH  Có thể để trong tủ đông ở - 20 °C, nhưng thời gian cấp đông phải được chỉnh tương ứng.

...

...

...

l) Để hỗn hợp dịch chiết cân bằng đến nhiệt độ phòng sau đó thêm dung môi chiết vừa đủ đến 30 ml.

m) Thêm 2,0 g ± 0,2 g natri sulfat khan (3.8) và trộn bằng máy trộn vortex (4.8) trong 5 min.

n) Dùng máy li tâm (4.7), li tâm 5 min ở khoảng 1734 g và 4 °C.

o) Tiến hành tiếp theo 6.3.

6.3  Tinh sạch bằng SPE silic dioxit

a) Gắn cột SPE silic dioxit (4.12) vào bộ phân phối chân không (4.10).

b) Thêm 1,0 g ± 0,2 g natri sulfat khan (3.8) vào đáy cột SPE (4.12) và làm ẩm với khoảng 5 ml metanol (3.2), sau đó là 5 ml etyl axtetat (3.5) và 5 ml dung môi chiết (3.9), để dung môi khô đến bề mặt của cột.

c) Chuyển 5 ml dịch chiết mẫu lên cột SPE (4.12) và cho chảy đến khô trên bề mặt cột ở tốc độ dòng khoảng 2 ml/min. Loại bỏ nước thải của cột.

d) Rửa cột bằng 5 ml hexan (3.4) và loại bỏ nước thải.

...

...

...

f) Khi dùng cột SPE Waters Sep-Pak Plus thì rửa giải bằng 5 ml dung môi rửa giải (3.13) vào trong ống nghiệm. Khi dùng cột SPE Waters Sep-Pak Vac thì rửa giải bằng 8 ml dung môi rửa giải (3.13) vào ống nghiệm.

g) Làm bay hơi dịch rửa giải đến khô dưới dòng nitơ, dùng máy làm khô bằng nitơ (4.9) trong nồi cách thủy ở 35 °C đến 40 °C (4.16). Lấy ống nghiệm ra khỏi bộ bay hơi ngay khi dịch rửa giải đạt trạng thái khô.

h) Hòa tan cặn bằng 1,0 ml metanol (3.2). Đối với dịch chiết kiểm soát được dùng làm chất chuẩn tương ứng với nền mẫu, hòa tan bằng 1,0 ml dung dịch dùng cho đường chuẩn (3.22) thích hợp.

i) Trộn bằng máy trộn vortex (4.8) trong 15 s, siêu âm 2 min và trộn lại bằng máy trộn vortex.

j) Chuyển vào lọ LC để phân tích LC-MS/MS.

CHÚ THÍCH  Nếu phần mẫu thử có chứa hàm lượng chất phân tích cao hơn hoặc nghi ngờ cao hơn dải đường chuẩn thì pha loãng với thể tích xác định của dịch chiết kiểm soát.

6.4  Xác định

6.4.1  Điều kiện vận hành sắc ký lỏng

Các điều kiện vận hành sau đây được cho là thích hợp:

...

...

...

- Nhiệt độ của bộ bơm mẫu tự động: 5°C;

- Thể tích bơm: 2 µl;

- Thời gian chạy: 10 min;

- Thời gian lưu: monensin 2,28 min, narasin 2,27 min, nigericin 2,88 min;

- Gradient: xem Bảng 4.

Bảng 4 - Các điều kiện gradient dùng cho sắc ký lỏng

Thời gian,

min

Tốc độ dòng,

...

...

...

Pha động A (3.14),

%

Pha động B (3.15),

%

0

0,6

5

95

5,4

...

...

...

5

95

5,5

1,1

0

100

8,4

1,1

0

...

...

...

8,5

0,6

5

95

10

0,6

5

95

6.4.2  Điều kiện vận hành LC-MS/MS

...

...

...

Bảng 5 - Điều kiện vận hành máy đo phổ khối lượng: quá trình chuyển tiếp

Hợp chất

Xác định

Khẳng định

Monensin

693,5 " 675,5

693,5 " 675,5

693,5 " 501,6

693,5 " 479,4

...

...

...

787,5 " 431,3

787,5 " 431,3

787,5 " 531,4

787,5 " 279,2

Nigericin

747,6 " 729,6

6.4.3  Các thông số máy đo phổ khối lượng  

Xem Bảng 6 về các thông số đối với máy API 4000 (4.13).

...

...

...

Hợp chất

Khối lượng Q1

amu

Khối lượng Q3

amu

Thế bắn phá (CE)

volt

Điện thế bắn đầu ra (CXP)

volt

...

...

...

693,5

675,5

501,6

479,4

50

67

70

22

18

...

...

...

Narasin

787,5

431,3

531,4

279,2

67

60

73

15

...

...

...

21

Nigericin

747,6

729,6

55

25

Nguồn ion:

Độ phân giải (Q1 và Q3):

Thời gian ngưng:

...

...

...

Khí chắn (CUR):

Khí 1 (GS1):

Khí 2 (GS2):

Điện áp phun ion (IS):

Điện thế bắn phá (DP):

Điện thế đầu vào (EP):

Nhiệt độ (TEM):

Bộ làm nóng bề mặt (ihe):

Turbospray

...

...

...

250 ms

12

20

50

20

5500 V

70 V

12 V

700 °C

...

...

...

a) Đảm bảo rằng hệ LC-MS/MS thích hợp được cân bằng theo khuyến cáo của nhà sản xuất trước khi phân tích mẫu.

b) Bơm 2 µl metanol (3.2) hoặc metanol đã trung hòa (3.11) (đã dùng để định mức các thể tích mẫu và thể tích dung dịch chuẩn) và quan sát không có chất gây nhiễu sắc ký có mặt ở thời gian lưu của monensin hoặc narasin.

c) Bơm 2 µl dung dịch chuẩn tương ứng với nền mẫu monensin ở mức dung sai hoặc gần mức dung sai và quan sát pic monensin có mặt ở thời gian lưu dự kiến đối với m/z 693 > 675, 693 > 501 và 693 > 479. Thể tích bơm phải được chỉnh để tạo tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) 100 : 1 đối với chất chuẩn tương ứng với dung sai. Tỷ lệ S/N đối với tất cả ba lần chuyển tiếp MS/MS trong chất chuẩn và mẫu phải lớn hơn 3.

CHÚ THÍCH  Các thể tích bơm lớn hơn có thể làm cho các mẫu kiểm soát chứa monensin nhỏ hơn 10 % so với dung sai đáp ứng tiêu chí khẳng định.

d) Bơm 2 µl dung dịch chuẩn tương ứng với nền mẫu narasin ở mức dung sai hoặc gần mức dung sai và quan sát pic narasin có mặt ở thời gian lưu dự kiến đối với m/z 787 > 531, 787 > 431 và 787 > 279. Thể tích bơm phải được chỉnh để tạo tỷ lệ S/N 100 : 1 đối với chất chuẩn tương ứng với dung sai. Tỷ lệ S/N đối với tất cả ba lần chuyển tiếp MS/MS trong chất chuẩn và mẫu phải lớn hơn 3.

CHÚ THÍCH  Các thể tích bơm lớn hơn có thể làm cho các mẫu kiểm soát chứa monensin nhỏ hơn 10 % so với dung sai đáp ứng tiêu chí khẳng định.

e) Nếu thay đổi các nền mẫu hoặc bắt đầu lần chạy mới trên hệ thống LC-MS/MS thì cần bơm đủ số lần bơm ổn định do trôi hệ thống. Nên bơm khoảng 20 lần.

f) Bơm các lần riêng rẽ các dung dịch chuẩn tương ứng với nền mẫu và các lần bom riêng rẽ các dịch chiết mẫu. Nên bơm một dãy dung dịch chuẩn hoàn chỉnh ở thời điểm bắt đầu và kết thúc từng dãy mẫu.

g) Đo diện tích pic của chất phân tích: tỷ số diện tích pic nội chuẩn đối với monensin và narasin trong các dung dịch chất chuẩn, kiểm soát chất lượng và phần mẫu thử chưa biết.

...

...

...

a) Dựng đường chuẩn từ các dung dịch chuẩn (3.22), sử dụng phép phân tích hồi quy tuyến tính bình phương nhỏ nhất của tỷ lệ diện tích pic so với nồng độ của dung dịch chuẩn. Đường chuẩn không đi qua gốc tọa độ.

b) Thiết lập độ tuyến tính của hệ thống bằng cách phân tích phần không tuyến tính của đường chuẩn.

- Các phần không tuyến tính cho thấy mô hình ngẫu nhiên khi được dựng đồ thị theo nồng độ.

- Các dung dịch hiệu chuẩn có thể bị loại khi ít nhất 75 % toàn bộ dung dịch hiệu chuẩn vẫn còn phần không tuyến tính không lớn hơn 15 % ở tất cả các mức (trừ dung dịch hiệu chuẩn thấp nhất 20 % là có thể chấp nhận) và bao gồm ít nhất năm nồng độ hiệu chuẩn trong đường chuẩn cuối cùng.

7  Tính kết quả

Nồng độ narasin và monensin trong mẫu thử, X, biểu thị bằng nanogam trên gam (ng/g), được tính theo Công thức (1):

 (1)

Trong đó

PAR là tỷ lệ diện tích pic của mỗi chất phân tích so với diện tích pic của chất nội chuẩn tương ứng;

...

...

...

m là độ dốc của đường thẳng từ phân tích hồi quy đường chuẩn;

CF là hệ số hiệu chính đối với độ pha loãng, nếu có, được tính bằng Công thức (2):

 (2)

Trong đó:

V₁ là thể tích cuối cùng của dịch chiết mẫu, tính bằng mililít (ml);

V₂ là thể tích dịch chiết thu được ban đầu, tính bằng mililít (ml);

b là thể tích dịch chiết đã sử dụng cho tinh sạch bằng SPE, tính bằng mililít (ml);

m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g).

8  Báo cáo thử nghiệm

...

...

...

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

...

...

...

Nền mẫu

Dải

mg/ml

Nồng độ nền mẫu tương đương^a

ng/g

Sữa bò

từ 0,25 đến 40

từ 0,30 đến 48

^a Nồng độ tương đương được hiệu chính với hệ số pha loãng phân tích tương ứng.

...

...

...

2) Có sẵn từ Sigma-Aldrich, Gillingham, Dorset, UK. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

3) Sản phẩm của Bibby Scientific Ltd., Staffordshire, UK. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

^4) Các sản phẩm của Waters, Milford, MA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

^5^) Sản phẩm của Applied Biosystem, CA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

^6^) Sản phẩm của Phenomenex, Torrance, CA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.