Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12363:2018 về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm

• Số hiệu: TCVN12363:2018
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2018

Kén hợp tử Cryptosporidium	Bào nang Giardia
Huỳnh quang xanh lá cây bao quanh toàn bộ kén - thường thấy rõ hai đường viền	Huỳnh quang xanh lá cây bao quanh toàn bộ bào nang
Hình cầu hoặc hình hơi bầu dục	Thường có hình elip/hình bầu dục nhưng bào nang đã được làm khô trên lam kính ở vị trí thẳng đứng, chúng có thể xuất hiện ở dạng hình cầu hoặc dạng hình cầu khuyết.
Một số kén sẽ có nếp gấp hoặc hình cầu khuyết: một số kén có thể có ngoại hình "pac-man" điển hình (như nhân vật trò chơi điện tử)	Một số bào nang có các nếp gấp và nhăn
Đường kính từ 4 μm đến 6 μm	Kích thước (theo đường trục ngang của bào nang) (từ 8 μm đến 12 μm) x (từ 7 μm đến 10 μm)

Cẩn thận khi đếm các đối tượng bị méo và hư hỏng nặng, đặc biệt là khi không quan sát thấy được kén hợp tử hoặc bào nang “điển hình”.

Mặc dù đa số các kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia có thể giống như mô tả trong Bảng 1 nhưng vẫn có sự sai lệch so với những mô tả này, đặc biệt đối với những ký sinh trùng đã từng ở trong môi trường một thời gian. Sai lệch phổ biến nhất là sự phát huỳnh quang yếu hoặc "mờ". Phải đưa ra mô tả cho mỗi ký sinh trùng được nhận dạng. Nếu không thể xác nhận rằng các đối tượng là ký sinh trùng (bằng cách nhuộm nhân DIC và/hoặc nhuộm DAPI, hoặc bằng các kỹ thuật phân tử tiếp theo) thì chúng nên được ghi là "có thể đúng" hoặc "giả định".

CHÚ THÍCH 1: Một số loài cả Cryptosporidium và Giardia đã được công nhận. Dải kích thước được mô tả trong Bảng 1 chủ yếu là của G. duodenalis và các loài chính của Cryptosporidium gây bệnh cho người. Một số loài Cryptosporidium có đường kính đến 8 μm (ví dụ: C.andersonl và C.muris) nhưng hiếm khi gây bệnh cho người.

Các đối tượng khác có thể được tách rửa ra từ thực phẩm tươi, có thể có kích thước, cấu trúc và đặc tính nhuộm tương tự như của các kén hợp tử Cryptosporidium hoặc bào nang Giardia. Do đó, điều quan trọng là tất cả các đối tượng có các đặc điểm này phải được khẳng định hoặc bác bỏ bằng các nghiên cứu bổ sung. Nếu không thể khẳng định hoặc bác bỏ do thiếu các điểm đặc trưng như nhân thì các đối tượng này nên được cho là có thể đúng/giả định. Trong những trường hợp này, nên để các chuyên gia từ các phòng thử nghiệm khác kiểm tra các lam kính này để khẳng định hoặc bác bỏ các đối tượng phát hiện được.

CHÚ THÍCH 2: Các kén hợp tử và bào nang kiểm soát tách chiết nội chuẩn cũng phát huỳnh quang phù hợp với chất phát huỳnh quang mà chúng được gắn vào.

8.5.2.3  Nhận biết kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia: DAPI

Mỗi kén hợp tử (báo nang) giả định cần phải được kiểm tra về sự có mặt của các nhân nhuộm DAPI. Chuyển sang dùng bộ lọc UV trên kính hiển vi để quan sát DAPI. Đầu tiên, sử dụng vật kính 40X và vật kính ngâm dầu hoặc ngâm nước 100X, nếu cần. Nhân của các kén hợp tử (bào nang) đã nhuộm DAPI sẽ có huỳnh quang màu xanh da trời.

Các đặc điểm phổ biến của kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia khi nhuộm bằng DAPI và soi bằng kính hiển vi huỳnh quang được liệt kê trong Bảng 2.

Các đặc điểm nhuộm bằng DAPI đối với mỗi kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia giả định phải được ghi lại.

...

...

...

Kén hợp tử Cryptosporidium

Bào nang Giardia

Trong các kén, nhân thoa trùng xuất hiện dưới dạng các chấm nhỏ, riêng biệt.

Trong các bào nang, nhân thể tự dưỡng xuất hiện dưới dạng những chấm riêng biệt, thường nằm ở một cực của bào nang.

Nếu kén chứa thoa trùng (không chỉ là vỏ) thì thường thấy cả bốn thoa trùng trong nhân, mặc dù chúng thường không nằm trong cùng một mặt phẳng hội tụ. Chỉnh tiêu cự lên và xuống.

Nếu bào nang có cơ chất và nhân rõ ràng thì thường có hai hoặc bốn, tùy thuộc vào giai đoạn sinh sản của bào nang. Chúng có thể nằm trong trường tiêu cự khác nhau, do đó, điều quan trọng là phải chỉnh tiêu cự lên và xuống.

Đôi khi, nhưng hiếm khi, việc nhuộm DAPI bị khuyếch tán.

Thường thì việc nhuộm DAPI bị khuếch tán, bởi chất liệu nhân không còn phân biệt rõ với các cơ chất khác. Tuy nhiên, có thể quan sát thấy các vạch huỳnh quang cường độ cao nằm ở một cực của nang.

Nếu kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia (chỉ có vỏ kén/nang) mà không có nhân thì không phải nhuộm DAPI nội chuẩn. Các mẫu này sẽ được báo cáo là giả định.

...

...

...

Một số ký sinh trùng giống như kén hợp tử Cryptosporidium hoặc bào nang Giardia nhưng thực ra những ký sinh trùng này lại không thể có được những đặc tinh nhuộm DAPI điển hình như kén hợp tử (bào nang), bao gồm phát huỳnh quang đò các lục lạp, tinh thể, bào tử v.v. . Sự có mặt các đặc tính này cho thấy đối tượng không phải là kén hợp tử (bào nang). Tuy nhiên, cần lưu ý rằng Evans Blue (là phần chất nhuộm màu có trong nhiều sản phẩm mAbs bán sẵn) có thể làm cho một số thành phần trong tế bào phát ra huỳnh quang đỏ. Ngoài ra, nền màu đỏ của Evans Blue không phù hợp để kiểm tra các lam kính có chứa các kén hợp tử (bào nang) kiểm soát được nhuộm bằng Texas Red. DNA của hệ vi sinh vật khác cũng bắt màu khi nhuộm DAPI nên cần chú ý để đảm bảo rằng không nhầm lẫn DNA này với DNA của ký sinh trùng đang nghiên cứu.

8.5.3  Kiểm tra mẫu đã chuẩn bị sử dụng kính hiển vi DIC

8.5.3.1  Yêu cầu chung

Sau khi kiểm tra đối tượng bằng kính hiển vi huỳnh quang sử dụng FITC, Texas Red (hoặc các loại khác) và các bộ lọc DAPI, tiến hành khẳng định kết quả nhận dạng bằng kính hiển vi DIC. Chặn tia cực tím và bật nguồn phát sáng, đảm bảo rằng trên vật kính đã lắp đúng vào tháp kính, bộ lọc DIC và lăng kính hội tụ ánh sáng dưới bàn soi vào đúng vị trí.

Đẩy bộ lọc DIC và lăng kính vào vị trí và chỉnh tối ưu hóa hình ảnh rõ nét bằng cách điều chỉnh cường độ ánh sáng và/hoặc xoay vít điều chỉnh trên lăng kính.

8.5.3.2  Nhận dạng kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia bằng kính hiển vi DIC

Đối với những người sử dụng chưa có kinh nghiệm, trước tiên, kiểm tra lam kính kiểm chứng dương, như là sự nhớ lại về các đặc điểm hình thái bên ngoài hay bên trong, đặc trưng của kén hợp tử Cryptosporidium hoặc bào nang Giardia, quan sát được bằng kính hiển vi DIC.

Sau đó kiểm tra các kén, nang giả định và kén, nang đã được khẳng định bằng DAPI soi dưới kính hiển vi quang huỳnh quang. Ban đầu sử dụng vật kính 40X và sau đó là vật kính 100X nhúng dầu hoặc nước.

Đo kích thước của mỗi ký sinh trùng hoặc ký sinh trùng giả định theo hai trục và tìm các đặc điểm hình thái bên ngoài hoặc bên trong điển hình của kén hợp tử Cryptosporidium hoặc bào nang Giardia.

...

...

...

Bảng 3 - Các đặc điểm của kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia bằng kính hiển vi DIC

Kén hợp tử Cryptosporidium

Bào nang Giardia

Các kén nguyên vẹn có các thành phần bên trong

Các kén không có thành phần bên trong (thoát ra khỏi kén, vỡ kén)

Các nang nguyên vẹn có các thành phần bên trong

Các nang không có thành phần bên trong (thoát ra khỏi nang, vỡ nang)

Hình cầu hoặc hơi ovan, mịn, không màu và có khúc xạ, vùng trung tâm lồi, bề mặt xuất hiện không đều. Có thể quan sát thấy thành kén dày. Cũng có thể thấy các thoa trùng bên trong kén, cũng như thấy rõ điểm khúc xạ (phần còn lại).

a) Hình cầu hoặc hơi ovan với thành kén dày. Có thể thấy phần khúc xạ còn lại. Điều này cho thấy kén đã vỡ hoặc các thành phần đã thoát ra khỏi kén.

...

...

...

Thành nang dày, phẳng hình elip/ovan và vùng trung tâm lồi.

Nếu đã thấy nhân nhuộm bằng DAPI thì nhân sẽ nằm ở một cực của bào nang. Cũng thấy dấu vết còn lại của sợi trục tiêm mao nằm chéo qua trục dài của bào nang và trung thể nằm ngang ở phần giữa của bào nang.

a) Dạng ovan có thành kén dày, vùng trung tâm xuất hiện phẳng và không rõ nét.

b) Dạng ovan có thành kén dày, có thể có những nếp nhăn, vết nứt và biến dạng.

Đối với một số mẫu, việc kiểm tra kén hợp tử (bào nang) giả định bằng cách sử dụng DIC có thể không thực hiện được do có các mảnh vụn gây nhiễu quá mức. Trong những trường này, cần ghi lại và quyết định nhận dạng phải dựa trên các đặc điểm của FITC-mAbs và DAPI đã được đánh dấu.

CHÚ THÍCH 1: Việc nhận biết các sinh vật sử dụng DIC cần có nhiều kinh nghiệm. Các đặc tính được đưa ra trong Bảng 3 chỉ là để hướng dẫn. Việc nhận biết sai các vật thể có hình dạng kén hợp tử (bào nang) có thể xảy ra ngay cả ở giai đoạn nhận biết này.

CHÚ THÍCH 2: Các vật thể giống như kén hợp tử Cryptosporidium hoặc bào nang Giardia nhưng thực ra lại không phải, có thể có các đặc điểm hình thái bên ngoài hoặc bên trong không điển hình của kén hợp tử (bào nang) và không nhìn thấy bằng kính hiển vi huỳnh quang. Những đặc điểm này bao gồm: gai, thân, phần phụ, lỗ hổng, một hoặc hai nhân lớn làm đầy tế bào, chất diệp lục, các tinh thể, bào tử, v.v. Sự có mặt các đặc điểm này chỉ ra rằng vật thể đó không phải là kén hợp tử (bào nang).

9  Quy trình kiểm soát chất lượng

9.1  Yêu cầu chung

...

...

...

9.2  Kết luận và diễn giải các kiểm chứng

Có thể sử dụng các kiểm chứng tách chiết nội chuẩn (xem 3.5) để xác minh rằng sau bước rửa giải phương pháp này hoạt động có hiệu quả. Nếu không phát hiện được kén hợp tử (bào nang) đánh dấu đã được đưa vào thì quy trình phân tích không đạt.

Nếu không sử dụng kiểm chứng tách chiết nội chuẩn thì có thể tạo ra mẫu kiểm chứng dương tính (xem 3.6) bằng cách thêm chuẩn mẫu bổ sung với khoảng 100 kén hợp tử Cryptosporidium và/hoặc bào nang Giardia (xem Phụ lục B). Dùng pipet nhỏ mẫu huyền phù thêm chuẩn lên bề mặt của lá rau hoặc quả mọng. Việc kiểm soát quá trình kiểm chứng dương nên thực hiện theo định kỳ (ví dụ: cứ 20 mẫu kiểm tra 1 mẫu kiểm chứng dương, nhưng tối thiểu kiểm tra 4 lần). Nếu không có (kén) nang nào được phát hiện thì quy trình phân tích không đạt.

Việc kiểm soát chứng âm (xem 3.7) cần tiến hành định kỳ tùy theo yêu cầu của mục đích thử nghiệm. Nếu phát hiện được các (kén) nang trong mẫu kiểm chứng âm tính thì chứng tỏ đã có sự lây nhiễm chéo xảy ra trong quá trình phân tích, và bất kỳ mẫu nào mà xét nghiệm cho kết quả dương tính thì đều phải được coi là dương tính giả.

9.3  Vệ sinh thiết bị, dụng cụ

Tất cả các thiết bị, dụng cụ tái sử dụng phải được rửa kỹ trong nước có chứa chất tẩy rửa và sau đó tráng sạch trong nước khử ion để loại bỏ bất kỳ (kén) nang nào có thể đã bám vào thiết bị.

Các dụng cụ sử dụng cho quá trình kiểm chứng dương cần được rửa riêng (nếu có thể, ở một khu vực riêng biệt) tránh xa khỏi các dụng cụ dùng để phân tích mẫu.

Việc sử dụng các vật liệu dùng một lần (ví dụ: túi đựng dùng cho máy trộn) để tránh lây nhiễm chéo, nhưng không khả thi đối với tất cả các thiết bị, dụng cụ (ví dụ: ống Leighton). Khả năng nữa là sử dụng các bộ thiết bị như nhau cho các quy trình kiểm chứng dương. Tuy nhiên, thực hiện đầy đủ các biện pháp rửa thích hợp và kiểm soát chất lượng (như chạy các mẫu kiểm chứng âm ngay sau khi chạy mẫu kiểm chứng dương, sử dụng cùng một thiết bị nhưng được rửa sạch) có thể là đủ.

Việc phân tích các mẫu kiểm chứng âm cần được ghi lại giống như khi phân tích mẫu kiểm chứng dương.

...

...

...

10  Báo cáo kết quả

10.1  Biểu thị kết quả

Kết quả cần nêu rõ số lượng kén hợp tử Cryptosporidium và/hoặc bào nang Giardia phát hiện được trên khối lượng mẫu sản phẩm tươi được kiểm tra.

Nếu sử dụng các kiểm chứng tách chiết nội chuẩn thì số lượng kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia đã đánh dấu trước và số lượng kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia phát hiện được phải được so sánh với số lượng đã được thêm chuẩn vào mẫu và tính phần trăm thu hồi đối với từng mẫu. Nếu sử dụng mẫu kiểm chứng dương thì số lượng kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia phát hiện được phải được so sánh với số lượng đã được thêm chuẩn vào mẫu và tính phần trăm thu hồi.

10.2  Báo cáo kết quả thử nghiệm

Báo cáo kết quả thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này:

b) Tất cả các chi tiết cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử, bao gồm nền mẫu, nguồn mẫu và chuỗi sản xuất được biết đến và bất kỳ chi tiết về lô hoặc mã nhận dạng lô hàng;

c) Ngày lấy mẫu;

...

...

...

e) Ngày phòng thử nghiệm nhận được mẫu;

f) Ngày bắt đầu phân tích;

g) Khối lượng mẫu phân tích;

h) Phương pháp đã sử dụng, đặc biệt bao gồm mọi thao tác không nêu trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

i) Số lượng kén hợp tử Cryptosporidium và bào nang Giardia phát hiện được và bất kỳ chi tiết có liên quan đến việc nhận dạng và xác nhận chúng (ví dụ: kích cỡ, phép nhuộm DAPI, chi tiết hình thái);

j) Sự không có mặt của sinh vật, nghĩa là không phát hiện được, sẽ được biểu thị là "không phát hiện được" trên khối lượng mẫu được phân tích;

k) Đã bao gồm hoặc không bao gồm các kiểm chứng mẫu. Báo cáo phần trăm thu hồi, xác định cho từng mẫu bằng kiểm soát tách chiết nội chuẩn hoặc cho từng lô bằng quá trình kiểm chứng dương và giới hạn phát hiện tính được;

i) Ngày kết thúc phân tích;

m) Họ tên và chữ ký của người phân tích; nếu có nhiều hơn một người phân tích thực hiện thì cần chỉ rõ người nào phân tích đã thực hiện phân tích công đoạn nào.

...

...

...

Phụ lục A

(Quy định)

Chuẩn bị thuốc thử

A.1  Thuốc thử chung

A.1.1  Muối đệm phosphat (PBS)

Natri clorua (NaCl)

8,0 g

Dinatri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

1,15 g

...

...

...

0,2 g

Kali clorua (KCl)

0,2 g

Nước đã khử ion

1 000 ml

Hoà tan các thành phần trong 800 ml nước và chỉnh pH đến 7,3 ± 0,2 bằng HCl 1mol/l hoặc NaOH 1 mol/l, sau đó thêm nước đến 1 lít.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng 20 °C ± 5 °C trong thời gian tối đa là sáu tháng.

A.2  Các thuốc thử để rửa tách các ký sinh từ sản phẩm tươi

A2.1  Dung dịch đệm glyxin 1 mol/l, pH 5,5

...

...

...

Hoà tan thành phần trong 800 ml nước và chỉnh pH đến 5,5 ± 0,2 bằng HCl 1 mol/l hoặc NaOH 1 mol/l, sau đó thêm nước đến 1 lít.

Bảo quản dung dịch này ở 5 °C ± 3 °C trong thời gian tối đa là 3 tháng.

A.2.2  Dung dịch đệm glyxin 1 mol/l, pH 3,5

Glyxin (C₂H₅NO₂) 75,07 g

Hoà tan các thành phần trong 800 ml nước và điều chỉnh pH đến 3,5 ± 0,2 bằng HCl 1 mol/l hoặc NaOH 1 mol/l, sau đó thêm nước đến 1 lít.

Bảo quản ở 5 0C ± 3°C trong thời gian tối đa là 3 tháng.

A.3  Các thuốc thử sử dụng trong việc cô đặc, cố định, nhuộm, phát hiện và QC

A.3.1  Axit clohydric (HCI), 0,1 mol/l.

A.3.2  Natri hydroxit (NaOH), 1 mol/l.

...

...

...

1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO)

2,0 g

Glycerol

60 ml

PBS (A.1.1)

40 ml

Để chuẩn bị, hòa tan DABCO trong PBS và thêm glycerol. Chỉnh pH đến 7,1 + 0,2 bằng HCl 0,1 mol/l hoặc NaOH 1 mol/l. Cho vào lọ và bảo quản ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C cho đến khi sử dụng.

A.3.4  Dung dịch DAPI gốc

DAPI

...

...

...

Metanol

0,5 ml

Để chuẩn bị, cho 0,5 ml metanol vào lọ chứa 1 mg DAPI (5.2.7).

Bảo quản dung dịch này ở nơi tối trong 5 °C ± 3 °C, tối đa đến 12 tháng.

A.3.5  Dung dịch DAPI làm việc

Dung dịch DAPI gốc (A.3.4)

10 μl

PBS

50 ml

...

...

...

Bảo quản dung dịch này ở nơi tối trong 20 °C ± 5 °C tối đa đến 1 tháng.

A.3.6  Dung dịch natri azid gốc

Natri azld (NaN3)

100 mg

Nước đã khử ion

5 ml

Để chuẩn bị, hòa tan natri azid trong nước

Bảo quản dung dịch này ở 5 °C ± 3 °C trong một năm. Natri azit rất độc khi tiếp xúc với da, với mắt, nuốt phải hoặc hít phải. Việc phơi nhiễm quá mức có thể dẫn đến tử vong. Phải tuân thủ hướng dẫn an toàn.

A.3.7  Môi trường bảo quản ký sinh trùng

...

...

...

1 ml

Nước đã khử ion

100 ml

Để chuẩn bị, cho 1 ml dung dịch natri azid gốc (A.3.6) vào 100 ml nước khử ion.

Bảo quản dung dịch này ở 5 °C ± 3 °C tối đa đến 1 tháng.

Phụ lục B

(Quy định)

Chuẩn bị huyền phù kiểm soát quá trình dương tính

...

...

...

Chuẩn bị các dung dịch huyền phù kiểm soát quá trình dương tính để sử dụng cho kháng thể đơn dòng và nhuộm DAPI để soi kính hiển vi. Các dung dịch này được chuẩn bị cho việc thêm chuẩn vào các mẫu nhằm xác định hiệu quả thu hồi của quy trình thử nghiệm. Phụ lục C cung cấp thông tin về phần trăm thu hồi đạt được bằng phương pháp này.

B.2  Xác định mật độ kén hoặc nang trong dung dịch huyền phù gốc

Các huyền phù gốc của kén hợp tử (bào nang) sử dụng cho phép kiểm chứng dương cần được đếm và sau đó sử dụng để chuẩn bị liều kiểm soát quá trình dương tính.

Có thể sử dụng công thức dưới đây để xây dựng liều nuôi cấy hoặc thể tích thêm chuẩn từ các kén hợp tử (bào nang) gốc:

C  là nồng độ cần thiết cho mỗi ml liều bổ sung:

S  là nồng độ gốc;

V  là thể tích dung dịch gốc cần thiết để tạo 1 ml liều yêu cầu

V = C/S

VÍ DỤ: Nếu cần một liều nồng độ 10 000 kén hợp tử (bào nang) trong mỗi 0,1 ml thì nồng độ cần thiết là 100 000 kén hợp tử (bào nang) trên mỗi ml.

...

...

...

Nếu nồng độ của dung dịch gốc là 214 000 kén hợp tử (bào nang) trên mỗi ml

S = 214 000

Thể tích dung dịch gốc cần thiết để pha được 1 ml nồng độ 100 000

V = 100 000/214 000 = 0,467 ml hoặc 467 μl.

Do đó, thêm nước vào 467 μl dung dịch gốc để đủ có 1 ml. Như vậy sẽ cho phép chuẩn bị được 10 liều 0,1 ml, mỗi liều chứa 10 000 kén hợp tử (bào nang).

Bảo quản ở 5 °C ± 3 °C, không được bảo quản huyền phù đông lạnh và phải thường xuyên kiểm tra chất lượng. Huyền phù kén và nang không được để quá ba tháng. Các huyền phù gốc phải được kiểm tra bằng kính hiển vi để bảo đảm rằng không bị vón cục hoặc kết mảng. Có thể làm tan các mảng vón cục bằng cách lắc mạnh.

B.3  Dữ liệu hiệu năng đối với các huyền phù kiểm chứng dương

Chuẩn bị 10 ml dịch huyền phù kén hợp tử Cryptosporidium và/hoặc bào nang Giardia bằng cách pha loãng một thể tích tương ứng dịch huyền phù gốc đậm đặc để thu được nồng độ cuối cùng khoảng 1 x 10^3 sinh vật/ml, nghĩa là có khoảng 100 kén và nang mỗi sinh vật trong 100 μl.

Xoay trộn huyền phù trong 30 s và sau đó phân phối các lượng 100 μl vào các giếng của lam kính hiển vi.

...

...

...

Tính giá trị trung bình của mỗi sinh vật có trên từng lam kính, độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên. Ghi lại kết quả. Đảm bảo rằng, hệ số biến thiên cho mỗi mẻ các liều thêm chuẩn được chuẩn bị thủ công, sẽ nhỏ hơn 20. Nếu thấy có sai lệch lớn hơn thì chuẩn bị một mẻ mới. Phải đảm bảo rằng số lượng trung bình các sinh vật trong mỗi liều trong khoảng từ 80 đến 120.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phần trăm thu hồi đạt được bằng các phương pháp

Kén hợp tử Cryptosporidium

Loại mẫu

Phần trăm thu hồi

Tài liệu tham khảo

...

...

...

34^b

Rzezutka et al (2010) ^[^22^]

Súp lơ

16^b

Rzezutka et al. (2010) ^[^22^]

Xà lách

25

Cook et al. (2007) ^[8]

Tỏi tây

...

...

...

Rzezutka et al. (2010) ^[^22^]

Rau diếp

19^b

Rzezutka et al. (2010) ^[^22^]

Rau diếp/cải bắp

24,5 ± 3,5^b

Amoros et al. (2010) ^[^2^]

Rau diếp (Gem)

3^b

...

...

...

Rau diếp (rau diếp xoăn)

49,2^b

Cook et al. (2007) ^[8]

Rau diếp (Romaine)

13^b

Cook et al. (2007) ^[8]

Xà lách (Webb's)

59,0 ± 12,0^a

Cook et al. (2006a) ^[9]

...

...

...

62^b

Cook et al. (2007) ^[8]

Mùi tây

59^b

Cook et al. (2007) ^[8]

Cải thảo

10^b

Rzezutka et al. (2010) ^[^22^]

Quả mâm xôi

...

...

...

Cook et al. (2006a) ^[9]

Hành trộn salad

46^b

Cook et al. (2007) ^[8]

Hành trộn salad

35^b

Rzezutka et al. (2010) ^[^22^]

Cải bắp trắng

4 - 47^b

...

...

...

^a Dựa trên độ thu hồi (vi sinh vật) đích

^b Dựa trên việc thu hồi kiểm chứng tách chiết nội chuẩn

Bào nang Giardia

Loại mẫu

Phần trăm thu hồi

Tài liệu tham khảo

Rau trộn

38^b

Cook et al. (2007) ^[8]

...

...

...

16,7 ± 8,1^b

Amoros et al. (2010) ^[2]

Rau diếp (Gem)

31^b

Cook et al. (2007) ^[8]

Rau diếp (Iceberg)

65^b

Cook et al. (2007) ^[8]

Rau diếp (Romaine)

...

...

...

Cook et al. (2007) ^[8]

Xà lách hỗn hợp

53^b

Cook et al. (2007) ^[8]

Mùi tây

43^b

Cook et al. (2007) ^[8]

Hành trộn salad

38^b

...

...

...

^a Dựa trên độ thu hồi đích

^b Dựa trên việc thu hồi kiểm chứng tách chiết nội chuẩn.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 12365 (ISO 16140), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp

[2] AMOROS I., ALONSO J.L., CUESTA G. Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts on salad products irrigated with contaminated water.J. Food Prot. 2010, 73 (6) pp. 1138-1140

[3] OIE, WORLD ORGANIZATION FOR ANIMAL HEALTH. 2012), Chapter 2.9.4 - Cryptosporidiosis. pp 1190-1213. In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Online version at http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health standards/tahm/2.09.10 TOXO.pdf

[4] ENVIRONMENT AGENCY. (2010). The Microbiology of Drinking Water (2010) - Part 14 - Methods for the isolation, identification and enumeration of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts. Available online at http://www.environment-agency.gov.uk/static/documents/Research/ Part 14-oct20-234.pdf

[5] BIER J.W. Isolation of parasites on fruits and vegetables. Southeast Asian I. Trop. Med. Public Health. 1991, 22 0 pp. 144-145

...

...

...

[7] CAMPBELL A.T., GR0N B., JOHNSEN S.E. 1997. Immunomagnetic separation of Cryptosporidium oocysts from high turbidity water sample concentrates. In: Proceedings of the 1997 International Symposium on Waterborne Cryptosporidium (eds: Fricker, C.R., Clancy, J.L., Smith, H.V.) American Waterworks Association

[8] COOK N., NICHOLS R.A., WILKINSON N., PATON C.A., BARKER K., SMITH H.V. Development of a method for detection of Giardia duodenalis cysts on lettuce and for simultaneous analysis of salad products for the presence of Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts. Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73 (22) pp. 7388-7391

[9] COOK N., PATON C.A., WILKINSON N., NICHOLS R.A., BARKER K., SMITH H.V. Towards standard methods for the detection of Cryptosporidium parvum on lettuce and raspberries. Part 1: development and optimization of methods. lnt.J. Food Microbiol. 2006a, 109 (3) pp. 215-221

[10] COOK N., PATON C.A., WILKINSON N., NICHOLS R.A., BARKER K., SMITH H.V. Towards standard methods for the detection of Cryptosporidium parvum on lettuce and raspberries. Part 2: validation. Int.J. Food Microbiol. 2006b, 109 (3) pp. 222-228

[11] Dl BENEDETTO M.A., CANNOVA L., DI PIAZZA F., AMODIO E., BONO F., CERAME G. Hygienic- sanitary quality of ready-to-eat salad vegetables on sale in the city of Palermo (Sicily). Ig. Sanita Pubbl. 2007, 63 (6) pp. 659-670

[12] Dl BENEDETTO M.A., Dl PIAZZA F., OLIVERI R., CERAME G., VALENTI R., FIRENZE A. Development of a technique for recovering Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts from fresh vegetables. Ann. Ig. 2006,18 (2) pp. 101-107

[13] MACARISIN D., SANTI'N M., BAUCHAN G., FAYER R. Infectivity of Cryptosporidium parvum oocysts after storage of experimentally contaminated apples./. Food Prot. 2010,73 (10) pp. 1824-1829

[14] MCCUIN R.M., BUKHARI Z., SOBRINHO J., CLANCY J.L. Recovery of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from source water concentrates using immunomagnetic separation. /. Microbiol. Methods. 2001, 45 (2) pp. 69-76

[15] RIPABELLI G., LEONE A., SAMMARCO M.L., FANELLI I., GRASSO G.M., MCLAUCHLIN J. Detection of Cryptosporidium parvum oocysts in experimentally contaminated lettuce using filtration, immunomagnetic separation, light microscopy, and PCR. Foodborne Pathog. Dis. 2004, 1 (4) pp.216-222.

...

...

...

[17] ROBERTSON L.J., & GJERDE B. Isolation and enumeration of Giardia cysts, Cryptosporidium oocysts, and Ascaris eggs from fruits and vegetables. J. Food Prot. 2000, 63 (6) pp. 775-778

[18] ROBERTSON L.J., & GJERDE B. Occurrence of parasites on fruits and vegetables in Norway.l. Food Prot. 2001, 64 (11) pp. 1793-1798

[19] ROBERTSON L.J., & GJERDE B. Factors affecting recovery efficiency in isolation of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from vegetables for standard method development. J. Food Prot. 2001, 64 (11) pp. 1799-1805

[20] ROBERTSON L.J., & SMITH H.V. Foodborne Protozoan Parasites. Nova Publishers, 2012

[21] ROCHELLE P.A., DE LEON R., JOHNSON A., STEWART M.H., WOLFE R.L. Evaluation of immunomagnetic separation for recovery of infectious Cryptosporidium parvum oocysts from environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65 (2) pp. 841-845

[22] RZEZUTKA A., NICHOLS R.A., CONNELLY L., KAUPKE A., KOZYRA I., COOK N. Cryptosporidium oocysts on fresh produce from areas of high livestock production in Poland. Int. J. Food Microbiol. 2010, 139 (1-2) pp. 96-101

[23] SHIELDS J.M., MINJUNG LEE M., MURPHY H.R. Use of a common laboratory glassware detergent improves recovery of Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis from lettuce, herbs and raspberries. Int. J. Food Microbiol. 2012, 153 (1-2) pp. 123-128

[24] SMITH H. (2005). Development and validation of a standard method to detect Cryptosporidium, Cyclospora and other parasitic protozoa on fruit and vegetables: A final technical report by the Scottish parasite diagnostic laboratory to the food standards agency. FSA Project Code: B09009. Available at http://www.foodbase.org.uk/results.php7f report id=781

[25] UTAAKER K.S., HUANG Q., ROBERTSON L.J. A reduced-cost approach for analyzing fresh produce for contamination with Cryptosporidium oocysts and/or Giardia cysts. Food Res. Int. 2015. DOI: 10.1016/j.foodres.2015.05.010