Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11395:2016 về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm – Phản ứng chuỗi polymerase

• Số hiệu: TCVN11395:2016
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2016

Chủng, typ và phân typ	Số chủng	Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được
		Typ A	Typ B	Typ E	Typ F
C .botulinum typ A phân typ A1^a	3	3	0	0	0
C .botulinum typ A phân typ A2^b	9	9	0	0	0
C .botulinum typ A phân typ A3^c	1	1	0	0	0
C .botulinum typ A phân typ A5^d	4	4	0	0	0
C .botulinum typ A không xác định phân typ^e	69	69	0	0	0
C .botulinum typ Ba phân typ A4^f	1	1	1	0	0
C .botulinum typ Ab phân typ A2^9	4	4	4	0	0
C .botulinum typ B^h	70	0	70	0	0
C .botulinum typ E^i	4	0	0	4	0
C .botulinum typ E^j	11	0	0	11	0
C .botulinum typ F^k	6	0	0	0	6
a  Bộ sưu tập quốc gia C. botulinum typ chủng cấy (NCTC 4587), C. botulinum chủng 62A, C. botulinum NCTC 7272. b  Các chủng phân lập từ Trung tâm chất chuẩn quốc gia Ý về Botulism (NRCB). c  C. botulinum NCTC 2012 Loch Maree. d  các chủng C. botulinum từ Viện Nghiên cứu Thực phẩm (IFR), Vương quốc Anh. e  tổng số 64 chủng từ bộ sưu tập NRCB và năm chủng từ các phòng thí nghiệm tư vấn về Vi khuẩn kỵ khí (CLAB) của Đại học Leipzig, Đức. f  chủng C. botulinum 657Ba từ IFR, Vương quốc Anh. g  chủng được phân lập bởi NRCB, Ý. h  C. botulinum NCTC 7273 và 69 chủng từ bộ sưu tập NRCB. i  Ba chủng từ CLAB và một chủng từ NRCB. j  Bảy chủng được phân lập tại Ý bởi NRCB, bốn chủng cung cấp theo tài liệu tham khảo [17]. k  C. botulinum NCTC 10281: ba chủng được phân lập tại Ý bởi NRCB; hai chủng được phân lập tại Đức bởi CLAB

B.1.2.3.2  Phép thử chọn lọc âm

Tính chọn lọc âm của phương pháp đã được thử nghiệm với 34 sinh vật không phải đích, xem Bảng B.2. Không quan sát được phản ứng chéo với các vi khuẩn không phải đích.

Bảng B.2 - Tính chọn lọc âm của PCR đa mồi sử dụng các chủng không phải đích

Các chủng^a

Số lượng chủng

Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được

Typ A

Typ B

Typ E

...

...

...

C. sporogenes WDCM 00008

1

0

0

0

0

C. perfringens (WDCM 00007 và các chủng ngoài thực địa)

3

0

...

...

...

0

0

C. carnis NCTC 13036

1

0

0

0

0

C. histolyticum NCTC 503

...

...

...

0

0

0

0

C. butyricum NCTC 7423

1

0

0

0

...

...

...

C. barati NCTC 10986

1

0

0

0

0

Bacillus subtilis WDCM 00003

1

0

...

...

...

0

0

B. cereus (NCTC 11143 và các chủng ngoài thực địa)

3

0

0

0

0

Thermophilic Campylobacter spp. (các chủng ngoài thực địa)

...

...

...

0

0

0

0

Escherichia coli (WDCM 00013 và các chủng ngoài thực địa)

3

0

0

0

...

...

...

Salmonella spp. (WDCM 00030 và chủng ngoài thực địa)

2

0

0

0

0

Listeria spp. (WDCM 00017 và WDCM 00109)

2

0

...

...

...

0

0

Brochotrix thermospacta WDCM 00071

1

0

0

0

0

Enterococcusfaecalis WDCM 00087

...

...

...

0

0

0

0

Citrobacterfreundii WDCM 00078

1

0

0

0

...

...

...

Pseudomonas spp. (các chủng ngoài thực địa)

3

0

0

0

0

Yersinia enterocolitica (các chủng ngoài thực địa)

3

0

...

...

...

0

0

Lactobacillusfermentum (chủng ngoài thực địa)

1

0

0

0

0

Aspergillus spp. (các chủng ngoài thực địa)

...

...

...

0

0

0

0

Saccharomyces cervisiae (chủng ngoài thực địa)

1

0

0

0

...

...

...

^a WDCM = World Data Centre for Microorganisms.

B.1.2.4  Độ nhạy

B.1.2.4.1  Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu nhiễm nhân tạo (Tài liệu tham khảo (2])

Các giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo các mẫu nhiễm nhân tạo với các mức nuôi cấy khác nhau (0,1 cfu đến 10 cfu và từ 10 cfu đến 100 cfu trước khi tăng sinh) trong 10 g các nền mẫu thực phẩm khác nhau (cá đóng hộp, xúc xích đóng hộp và mật ong) được nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy (Tài liệu tham khảo [1]). Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm bẩn nhân tạo là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %). Giới hạn phát hiện của phương pháp được quy định là 1 cfu đến 10 cfu hoặc số bào tử trên 10 g trước khi tăng sinh.

B.1.2.4.2  Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu nhiễm tự nhiên (Tài liệu tham khảo [2])

Giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo 382 mẫu nhiễm tự nhiên (ví dụ như mật ong, thực vật và các loại thịt đóng hộp), sử dụng cách thử sinh học trên chuột làm phương pháp đối chứng. Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm tự nhiên là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %.

CHÚ THÍCH: Các thực nghiệm được thực hiện với các phần mẫu thử là 10 g.

B.1.2.5  Kiểm soát phân tích

Tất cả các phép thử đã được thực hiện sử dụng quá trình kiểm chứng dương tính và âm tính đối với PCR, kiểm chứng khuếch đại nội bộ (IAC) được mô tả trong B.1.6.

...

...

...

Việc đánh giá xác nhận đã được thực hiện trên MyCycler^®1) và Mastercycler^®2) Gradient sử dụng 2xMultiplex qPCR MasterMix^®3) (Tài liệu tham khảo [1]) và hỗn hợp mồi theo Bảng B.7 (Tài liệu tham khảo [2], [5]).

B.1.3  Nguyên tắc

Các đoạn ADN đặc hiệu của BoNT/typ gen A, B, E và F, được khuếch đại bằng PCR đa mồi kết hợp với IAC tương đồng sử dụng tám mồi. Việc phát hiện các sản phẩm PCR được thực hiện bằng điện di gel agarose.

B.1.4  Thuốc thử

B.1.4.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

B.1.4.2  Thuốc thử dùng cho PCR

B.1.4.2.1  Nước không chứa nuclease.

B.1.4.2.2  Dung dịch đệm PCR, 10x4)

...

...

...

B.1.4.2.3  Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

B.1.4.2.4  ADN polymerase bền nhiệt, 5 lU/ml.

B.1.4.2.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l.

B.1.4.2.6  Oligonucleotid.

Trình tự của các oligonucleotid được nêu trong Bảng B.3.

Bảng B.3 - Trình tự của các oligonucleotid

Typ

Mồi

Trình tự (5' - 3')

...

...

...

A

IA_03_fw

ggg CCT AgA ggT AgC gTA R^aTg

101

IA_04_rev

TCT TY^a A TTT CCA gAA gCA TAT TTT

B

CBMLB1

CAg gAg AAg Tgg AgC gAA AA

...

...

...

CBMLB2

CTT gCg CCT TTg TTT TCT Tg

E

CBMLE1

CCA AgA TTT TCA TCC gCC TA

389

CBMLE2

gCT ATT gAT CCA AAA Cgg TgA

F

...

...

...

Cgg CTT CAT TAg AgA ACg gA

543

CBMLF2

TAA CTC CCC TAg CCC CgT AT

^a trong trình tự của các oligonucleotid R = A,G và Y = C,T

B.1.4.3  Hóa chất điện di gel

B.1.4.3.1  Yêu cầu chung

Điện di gel agarose có thể được thực hiện với dung dịch đệm TAE hoặc dung dịch đệm TBE. Các dung dịch được mô tả trong phương pháp này thường không cần phải hấp áp lực.

B.1.4.3.2  Agarose, thích hợp dùng cho điện di ADN và cho việc tách kích thước dự định của các phân tử ADN.

...

...

...

B.1.4.3.4  Bromophenol xanh, C₁₉H₉Br₄O₅SNa và/hoặc xylen xyanol FF, C₂₅H₂₇N₂O₆S₂Na.

B.1.4.3.5  Chuẩn khối lượng phân tử ADN, ví dụ: chế phẩm thương mại có chứa các đoạn ADN từ khối lượng phân tử rất cao đến khối lượng phân tử rất thấp.

B.1.4.3.6  Axit axetic băng, CH₃COOH, chỉ dùng cho hệ thống đệm TAE.

B.1.4.3.7  Muối dinatri của axit etylendiaminetetraaxetic (Na₂EDTA), C₁₀H₁₄O₈Na₂.

B.1.4.3.8  Ethidium bromide (EthBr), C₂₁H₂₀N₃Br.

B.1.4.3.9  Glycerol, C₃H₈O₃.

B.1.4.3.10  Natri axetat, C₂H₃O₂Na, chỉ dùng cho hệ thống đệm TAE.

B.1.4.3.11  Axit clohydric, j(HCl) = 37 %.

B.1.4.3.12  Natri hydroxit, NaOH.

...

...

...

B.1.4.3.14  Dung dịch đệm Tris-axetat-EDTA (TAE) (1x), c(tris) = 0,050 mol/l, c(C₂H₃O₂Na) = 20 mmol/l, c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l.

Chỉnh đến pH 8,0 bằng axit axetic băng hoặc NaOH. Nên chuẩn bị dung dịch đệm TAE theo dung dịch gốc đậm đặc (đậm đặc tối đa 50 lần). Loại bỏ dung dịch nếu nhìn thấy có kết tủa.

Có thể tiến hành pha loãng các dung dịch đệm điện di đậm đặc, ngay trước khi sử dụng, với nước không tiệt trùng, nước cất một lần hoặc nước đã khử ion.

B.1.4.3.15  Dung dịch đệm Tris-borat-EDTA (TBE) (0,5x), c(tris) = 0,055 mol/l, c(axit boric) = 0,055 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l.

Chỉnh pH đến 8,0 bằng HCl hoặc NaOH. Nên chuẩn bị dung dịch đệm TBE theo dung dịch gốc đậm đặc (đậm đặc tối đa 10 lần). Loại bỏ dung dịch nếu nhìn thấy có kết tủa. Có thể pha loãng các dung dịch đệm điện di đậm đặc ngay trước khi sử dụng với nước không tiệt trùng, nước cất một lần hoặc nước đã khử ion.

B.1.4.3.16  Dung dịch đệm nạp mẫu (5x), j(glycerol) = 50 %, r(bromophenol xanh) = 2,5 g/l và/hoặc r(xylen xyanol) = 2,5 g/l, được hòa tan trong dung dịch đệm điện di (B.1.4.3.14 hoặc B.1.4.3.15).

B.1.4.3.17  Dung dịch ethidium bromide, c(EthBr) = 0,5 mg/l

Nên bảo quản các dung dịch ethidium bromide ở dạng đậm đặc (ví dụ: 10 mg/ml) ở 5 °C ở nơi tối (EthBr nhạy với ánh sáng). Đồng thời nên tránh cân EthBr. Dung dịch gốc cần được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong một lượng nước thích hợp, đựng trong bình đã chứa bột EthBr, hoặc sử dụng các viên EthBr đã biết trước khối lượng. Việc hòa tan EthBr cần thực hiện tránh sánh sáng, có khuấy trộn ở nhiệt độ phòng. Việc hòa tan này thường mất khoảng 1 h.

CẢNH BÁO - Ethidium bromide là một chất gây đột biến, cần thực hiện theo quy trình xử lý an toàn.

...

...

...

B.1.5.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thích hợp với phương pháp và cụ thể như sau:

B.1.5.2  Thiết bị dùng cho PCR

B.1.5.2.1  Pipet và pipet có dầu lọc, có dung tích từ 1 mI đến 1 000 ml.

B.1.5.2.2  Ống ly tâm nhỏ, có dung tích 1,5 ml và 2,0 ml.

B.1.5.2.3  Ống PCR, ống phản ứng 0,2 ml hoặc 0,5 ml, đĩa PCR vi giếng hoặc dụng cụ phù hợp khác.

B.1.5.2.4  Máy chu trình nhiệt.

B.1.5.2.5  Thiết bị sử dụng để phát hiện các sản phẩm PCR.

B.1.5.2.6  Lò vi sóng hoặc nồi cách thủy đun sôi.

...

...

...

B.1.5.2.8  Nguồn cung cấp điện.

B.1.5.2.9  Máy chiếu tia UV hoặc hộp đèn UV.

B.1.5.2.10  Hệ thống ghi dữ liệu gel

B.1.6  Kiểm soát khuếch đại nội bộ (Tài liệu tham khảo [2])

B.1.6.1  Nguyên tắc

Một đoạn ADN plasmid pUC 19 được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu. Các mồi có các đuôi -5' giống với các mồi được sử dụng để phát hiện các gen BoNT/F, trong khi các mồi có đuôi 3' được bổ sung cho pUC 19 xác định trước trình tự ADN có chiều dài và trình tự xác định. Đoạn ADN được sử dụng làm khuôn mẫu cho IAC cạnh tranh.

B.1.6.2  Thuốc thử

B.1.6.2.1  Yêu cầu chung

Về chất lượng thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

...

...

...

B.1.6.2.3  Dung dịch magie clorua, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

B.1.6.2.4  ADN polymerase bền nhiệt, 5 lU/ml.

B.1.6.2.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l.

B.1.6.2.6  Dung dịch kali clorua, c(KCI) = 0,5 mol/l.

B.1.6.2.7  Tris (hydroxymetyl) aminometan hydroclorua, c(C₄H₁₁NO₃HCl) = 0,1 mol/l.

Chỉnh pH đến 8,3 bằng HCl hoặc NaOH.

B.1.6.2.8  Plasmid pUC 19 (nhập số L09137).

B.1.6.2.9  Oligonucleotid

Trình tự của các oligonucleotid được nêu trong Bảng B.4

...

...

...

Mồi

Trình tự (5' - 3')

Kích thước amplicon của IAC
bp

IAC_f

Cgg CTT CAT TAg AgA ACg gAC gTT Tgg TAT ggC TTC ATT C

698

lAC_r

TAA CTC CCC TAg CCC CgT ATT AgA CgT CAg gTg gCA CTT T

B.1.6.3  Cài đặt PCR để xây dựng IAC

...

...

...

Bảng B.5 - Bổ sung thuốc thử

Thuốc thử

Giá trị cuối cùng

Thể tích trên mẫu

ml

Khuôn mẫu ADN (pUC 19), 0,5 mg/ml

0,5 mg

1

Nước không chứa nuclease

...

...

...

26

Dung dịch KCl, c(KCl) = 0,5 mol/l

50 mmol/l

5

Tris-HCl (pH 8,3), c(tris·HCl) = 0,1 mol/l

10 mmol/l

5

Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l

2,5 mmol/l

...

...

...

Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l

0,8 mmol/l

4

Mồi IAC_f, 5 mmol/l

0,1 mmol/l

1

Mồi IAC_f, 5 mmol/l

0,1 mmol/l

1

...

...

...

2,5 IU

1

B.1.6.4  Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt nêu trong Bảng B.6 đã được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá xác nhận sử dụng các chu trình nhiệt MyCycler^® hoặc Mastercycler^® Gradient^2^) và Taq ADN polymerase5). Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể điều chỉnh khi cần. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng. Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng B.6 - Chu trình nhiệt

Khuếch đại

60 s/95°C

60 s/55 °C

2 min/72°C

...

...

...

30

Thời gian kéo dài cuối cùng

10 min/72 °C

B.1.6.5  Sử dụng IAC

Sử dụng phương pháp thích hợp để tinh sạch sản phẩm PCR. Thường 1 500 bản sao/giếng IAC là thích hợp đối với các phương pháp PCR gel-based. IAC được quy định như một IAC cạnh tranh và được xây dựng để cạnh tranh với các mồi khuếch đại gen độc tố thần kinh typ F.

B.1.7  Cách tiến hành

B.1.7.1  Cài đặt PCR

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 50 ml cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.7. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nhỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng B.7 đã chứng minh là phù hợp.

Bảng B.7 - Bổ sung thuốc thử

...

...

...

Thể tích cuối cùng

Thể tích trên mẫu
ml

Khuôn mẫu ADN

10 ng to 50 ng

3

Nước không chứa nuclease

2,6

Dung dịch đệm PCR 10x (không chứa MgCl₂)^a

...

...

...

5

Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l

4,8 mmol/l

9,6

Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l

0,8 mmol/l

4

Các mồi PCR (theo Bảng B.3) 5 mmol/l

0,3 mmol/l cho mỗi mồi

...

...

...

IAC, 1 500 bản sao/ml

1 500 bản sao

1

ADN polymerase bền nhiệt, 5 IU/ml

2 IU

0,8

^a Nếu dung dịch đệm PCR chứa sẵn MgCl₂, thì nồng độ cuối cùng của MgCl₂ trong hỗn hợp phản ứng cần được chỉnh đến 4,8 mmol/l.

B. 1.7.2  Kiểm chứng PCR

B.1.7.2.1  Yêu cầu chung

...

...

...

B.1.7.2.2  Kiểm chứng PCR âm tính

Sử dụng nước không chứa ADN làm kiểm chứng âm tính.

B.1.7.2.3  Kiểm chứng PCR dương tính

Hỗn hợp ADN của clostridia sinh ra BoNT, dương tính đối với tất cả bốn trình tự đích (các gen độc tố thần kinh typ A, B, E và F), khoảng 1 000 bản sao.

B.1.7.2.4  Kiểm soát khuếch đại

Sử dụng IAC hoặc kiểm soát khuếch đại bên ngoài (EAC) phù hợp. Ví dụ của IAC được nêu trong B.1.6.

B.1.7.3  Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt nêu trong Bảng B.8 đã được sử dụng cho các nghiên cứu đánh giá xác nhận với MyCycler^® và với Mastercycler^® Gradient, sử dụng 2x Multiplex qPCR MasterMix (Tài liệu tham khảo [1]) và MasterMix theo Bảng B.7 (Tài liệu tham khảo [2] [5]). Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể phải điều chỉnh cho phù hợp. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng6). Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng B.8 - Chương trình thời gian-nhiệt độ

...

...

...

15 min/95 °C

Khuếch đại

30 s/95 °C

30 s/56 °C

90 s/72 °C

Số lượng chu trình (khuếch đại)

35

Thời gian kéo dài cuối cùng

7 min/72 °C

...

...

...

B.1.7.4.1  Yêu cầu chung

Có thể thực hiện điện di gel agarose với dung dịch đệm TAE hoặc dung dịch đệm TBE. Sử dụng cùng dung dịch đệm để hòa tan agarose và để nạp đầy bình điện di.

B.1.7.4.2  Chuẩn bị gel agarose

Các sản phẩm PCR được khuếch đại nên phát hiện bằng cách sử dụng gel agarose 2,0 %. Cân một lượng thích hợp agarose (B.1.4.3.2) cho vào dung dịch đệm điện di (B.1.4.3.14 hoặc B. 1.4.3.15). Làm sôi dung dịch trong lò vi sóng hoặc trong nồi cách thủy (B.1.5.2.6) cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Bù lượng hao hụt do bay hơi bằng một lượng nước tương đương, xoay bình để trộn (tránh không tạo bọt khí), làm nguội dung dịch xuống khoảng 60 °C và giữ ở nhiệt độ này cho đến khi sử dụng. Chuẩn bị giá đỡ gel (khay đựng gel) với lượng thích hợp. Rót dung dịch agarose vào khay gel và để gel đông đặc ở nhiệt độ phòng (thường là 1 h).

B.1.7.4.3  Điện di gel agarose

Cẩn thận tháo lược mẫu ra khỏi gel. Chuyển gel (trên khay) vào bể điện di, sao cho các giếng nằm gần với catot (điện cực âm). Đổ đầy bể điện di bằng dung dịch đệm điện di (B.1.4.3.14 hoặc B.1.4.3.15). Phủ lên trên gel bằng khoảng 2 mm của cùng dung dịch đệm.

Trộn dung dịch đệm với các sản phẩm PCR (10 ml) (B.1.4.3.16) theo tỷ lệ 1 đến 5 (ví dụ: cho 2,5 ml dung dịch đệm vào 10 ml sản phẩm PCR), trộn và sử dụng micropipet để đưa hỗn hợp này vào các giếng. Nếu các mẫu chưa biết nghi ngờ quá đặc, thì cần pha loãng để nạp vào gel.

Để xác định kích thước của sản phẩm PCR, bổ sung dung dịch đệm (B.1.4.3.16) và chuẩn khối lượng phân tử ADN (B.1.4.3.5) theo tỷ lệ 1 đến 5. Chất chuẩn khối lượng phân tử ADN được nạp vào gel ít nhất là trước giếng mẫu đầu tiên và sau giếng mẫu cuối cùng.

Tiến hành điện di ở nhiệt độ phòng với điện áp và cường độ dòng điện thích hợp (thường điện áp ổn định tối đa là 5 V/cm và nên quan tâm đến khoảng cách giữa các điện cực). Trong các điều kiện quy định, ADN tích điện âm, vì vậy di chuyển từ cực âm đến cực dương. Thời gian điện di phụ thuộc vào khoảng cách dịch chuyển yêu cầu, dòng điện được cung cấp, dung dịch đệm được sử dụng, sự điện thấm và nồng độ agarose trong gel.

...

...

...

Sau khi kết thúc điện di, ủ gel từ 15 min đến 50 min trong dung dịch ethidium bromide (B.1.4.3.17) ở nhiệt độ phòng, tốt nhất là để ở nơi tối với lắc nhẹ. Nếu cần, giảm màu nền bằng khử màu gel trong nước từ 10 min đến 30 min.

Cách khác để nhuộm màu sau điện di, có thể bổ sung EthBr vào gel trước khi rót. Trong trường hợp này, EthBr được cho vào gel để có nồng độ cuối cùng là 0,01 mg/ml gel khi gel đã được làm nguội đến 60 °C. Để giảm thiểu các vấn đề di chuyển của EthBr trong gel, có thể bổ sung một số EthBr vào bể đệm điện di. Sau khi điện di gel, thường không cần có bước khử màu.

CHÚ THÍCH: Việc nhuộm có thể được thực hiện bằng cách sử dụng chất nhuộm màu xen giữa ADN khác.

B.1.7.4.5  Ghi hình gel

Chuyển gel lên bề mặt chiếu sáng, bật đèn UV và ghi lại huỳnh quang ADN bằng cách chụp ảnh hoặc ghi video.

Các trình tự đích được coi là phát hiện được nếu kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với chiều dài dự kiến của các trình tự ADN đích. Xem Bảng B.9. Để giải thích các kết quả, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

Bảng B.9 - Kích thước sản phẩm khuếch đại

Typ

Mồi

...

...

...

A

IA_03_fw/IA_04_rev

101

B

CBMLB1/CBMLB2

205

E

CBMLE1/CBMLE2

389

...

...

...

CBMLF1/CBMLF2

543

IAC

lAC_f/ACr

698

B.1.7.5  Khẳng định kết quả PCR dương tính

Kết quả PCR dương tính phải được khẳng định, ví dụ: bằng trình tự của các sản phẩm PCR. Có thể sử dụng các phương pháp thích hợp khác để khẳng định.

B.1.7.6  Hạn chế của phương pháp

Phương pháp này đã được thử nghiệm để phát hiện các typ và phân typ hiện có của các độc tố thần kinh của clostridia typ A, B, E và F. Tại thời điểm công bố, chưa có xác nhận liệu các mồi được liệt kê trong Bảng B.3 có thể phát hiện các phân typ mới của BoNT/A, B, E và F hay không.

...

...

...

B.2.1  Giới thiệu

Điều này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và phát hiện các gen mã hóa các typ độc tố thần kinh botulinum A, B, E và F, sử dụng điện di gel agarose.

Về những hạn chế xem B.2.7.6.

B.2.2  Đặc tính hiệu năng

B.2.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này đã được điều chỉnh đối với ADN được chiết từ typ A, B, E, và F của C. botulinum từ các chủng đối chứng và từ mẫu bị nhiễm tự nhiên.

Các phần của phương pháp này đã được công bố trong Tài liệu tham khảo [5].

B.2.2.2  Đánh giá lý thuyết của phương pháp

Đánh giá lý thuyết đã được thực hiện bằng cách nghiên cứu trình tự tương đồng với các cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ (Tài liệu tham khảo [16], 2009/09/20). Kết quả nghiên cứu đã khẳng định việc nhận biết hoàn toàn với các trình tự đích dự kiến.

...

...

...

B.2.2.3.1  Phép thử chọn lọc dương

Phép thử chọn lọc dương của phương pháp đã được thử nghiệm với 19 chủng C. botulinum typ A, 19 chủng C .botulinum typ B, 17 chủng C. botulinum typ E và 9 chủng C. botulinum typ F, xem Bảng B.10.

Bảng B.10 - Phép thử chọn lọc dương của PCR đa mồi sử dụng các chủng đích

Chủng, typ và phân typ

Số chủng

Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được

Typ A

Typ B

Typ E

...

...

...

C. botulinum typ A

19

19

0

0

0

C. botulinum typ B

19

0

...

...

...

0

0

C. botulinum typ E

17

0

0

17

0

C. botulinum typ F

...

...

...

0

0

0

9

CHÚ THÍCH: Các chủng được phân lập tại Ý bởi NRCB, IFR, Phòng thử nghiệm tư vấn về vi khuẩn kỵ khí (CLAB) của trường đại học Leipzig, Đức.

B.2.2.3.2  Phép thử chọn lọc âm

Phép thử chọn lọc âm của phương pháp đã được thử nghiệm với 34 sinh vật không phải đích, xem Bảng B.11. Không quan sát được phản ứng chéo với các vi khuẩn không phải đích.

Bảng B.11 - Phép thử chọn lọc âm của PCR đa mồi sử dụng các chủng không phải đích

Các chủng

...

...

...

Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được

Typ A

Typ B

Typ E

Typ F

C. sporogenes WDCM 00008

1

0

0

...

...

...

0

C. perfringens (WDCM 00007 và các chủng ngoài thực địa)

3

0

0

0

0

C. carnis NCTC 13036

1

...

...

...

0

0

0

C. histolyticum NCTC 503

1

0

0

0

0

...

...

...

1

0

0

0

0

C. barati NCTC 10986

1

0

0

...

...

...

0

B. subtilis WDCM 00003

1

0

0

0

0

B. cereus (NCTC 11143 và các chủng ngoài thực địa)

3

...

...

...

0

0

0

Thermophilic Campylobacter spp. (các chủng ngoài thực địa)

2

0

0

0

0

...

...

...

3

0

0

0

0

Salmonella spp. (WDCM 00030 và chủng ngoài thực địa)

2

0

0

...

...

...

• 0

Listeria spp. (WDCM 00017 and WDCM 00109)

2

0

0

0

0 -

B. thermospacta WDCM 00071

1

...

...

...

0

0

0

E.faecalis WDCM 00087

1

0

0

0

0

...

...

...

1

0

0

0

0

Pseudomonas spp. (các chủng ngoài thực địa)

3

0

0

...

...

...

0

Y. enterocolitica (các chủng ngoài thực địa)

3

0

0

0

0

L.fermentum (các chủng ngoài thực địa)

1

...

...

...

0

0

0

Aspergillus spp. (các chủng ngoài thực địa)

2

0

0

0

0

...

...

...

1

0

0

0

0

B.2.2.4  Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu bị nhiễm nhân tạo (Tài liệu tham khảo [5])

Các giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo các mẫu nhiễm nhân tạo với các mức nuôi cấy khác nhau (0,1 cfu đến 10 cfu và từ 10 cfu đến 100 cfu trước khi tăng sinh) trong 10 g các nền mẫu thực phẩm khác nhau, (cá đóng hộp, xúc xích đóng hộp và mật ong) được khảo sát, sử dụng phương pháp nuôi cấy (Tài liệu tham khảo [5]). Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm nhân tạo là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %. Giới hạn phát hiện của phương pháp được quy định là 1 cfu đến 10 cfu hoặc số bào tử trên phần mẫu thử trước khi tăng sinh.

CHÚ THÍCH: Các thực nghiệm được thực hiện với các phần mẫu thử 10 g.

B.2.2.5  Phân tích kiểm chứng

...

...

...

B.2.2.6  Thiết bị, dụng cụ và thuốc thử

Việc đánh giá xác nhận đã được thực hiện trên Mastercycler^® Gradient^2) sử dụng 2x Multiplex qPCR MasterMix^®,3) và MasterMix theo Bảng B.16.

B.2.3  Nguyên tắc

Các đoạn ADN đặc hiệu của BoNT/typ gen A, B, E và F, được khuếch đại bằng PCR đa mồi kết hợp với IAC tương đồng, sử dụng tám mồi. Việc phát hiện các sản phẩm PCR được thực hiện bằng việc sử dụng phương pháp điện di gel agarose.

B.2.4  Thuốc thử

B.2.4.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

B.2.4.2  Thuốc thử dùng cho PCR

B.2.4.2.1  Nước, không chứa nuclease.

...

...

...

Thông thường dung dịch đệm PCR được cung cấp cùng với ADN polymerase, có thể có hoặc không có MgCl₂ ở nồng độ do nhà sản xuất quy định. Nồng độ MgCl₂ cuối cùng được quy định theo phương pháp cụ thể và được cho trong Bảng B.14. Cũng có thể dùng thuốc thử có bán sẵn. Nếu không thì tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.2.4.2.3  Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

B.2.4.2.4  ADN polymerase bền nhiệt, 5 lU/ml.

B.2.4.2.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l.

B.2.4.2.6  Oligonucleotid.

Trình tự của các oligonucleotid được liệt kê trong Bảng B.12.

Bảng B.12 - Trình tự của các oligonucleotide

Typ

Mồi

...

...

...

Kích thước amplicon
bp

A

CBMLA3-F

ATT CAg gAT ggA AAg TAT CAC TTA AT

698

CBMLA3-R

TTC TAC gCC TgC CTg TgA Tg

B

CBMLB1

...

...

...

205

CBMLB2

CTT gCg CCT TTg TTT TCT Tg

E

CBMLE1

CCA AgA TTT TCA TCC gCC TA

389

CBMLE2

gCT ATT gAT CCA AAA Cgg TgA

...

...

...

CBMLF1

Cgg CTT CAT TAg AgA ACg gA

543

CBMLF2

TAA CTC CCC TAg CCC CgT AT

B.2.4.3  Hóa chất điện di gel

Theo quy định trong B. 1.4.3.

B.2.5  Thiết bị, dụng cụ

Theo quy định trong B.1.5.

...

...

...

B.2.6.1  Nguyên tắc

Một đoạn ADN plasmid pUC 19 được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu. Các mồi có các đuôi 5' giống với các mồi được sử dụng để phát hiện các gen BoNT/F, trong khi các mồi có đuôi 3' được bổ sung cho pUC 19 xác định trước trình tự ADN có chiều dài và trình tự xác định. Đoạn ADN được sử dụng làm khuôn mẫu cho IAC cạnh tranh.

B.2.6.2  Thuốc thử

B.2.6.2.1  Yêu cầu chung

Về chất lượng thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

B.2.6.2.2  Nước, không chứa nuclease.

B.2.6.2.3  Dung dịch magie clorua, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

B.2.6.2.4  ADN polymerase bền nhiệt, 5 lU/ml.

B.2.6.2.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l.

...

...

...

B.2.6.2.7  Tris (hydroxymetyl) aminometan hydrochlorua, c(C₄H₁₁NO₃.HCl) = 0,01 mol/l.

Chỉnh pH đến 8,3 bằng HCl hoặc NaOH.

B.2.6.2.8  pUC 19 plasmid (nhập số L09137).

B.2.6.2.9  Oligonucleotid

Trình tự của các oligonucleotid được nêu trong Bảng B.13.

Bảng B.13 - Trình tự oligonucleotid

Mồi

Trình tự (5' - 3')

Kích thước amplicon của IAC
bp

...

...

...

Cgg CTT CAT TAg AgA ACg GAT gTC gTg CCA gCT gCA TTA A

800

IOF-new- R

TAA CTC CCC TAg CCC CgT ATgCC ggA TCA AgA gCT ACC AAC

B.2.6.3  Cài đặt PCR để xây dựng IAC

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 50 ml cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.14. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nhỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng B.14 được chứng minh là phù hợp.

Bảng B.14 - Bổ sung thuốc thử

Thuốc thử

Giá trị cuối cùng

...

...

...

Khuôn mẫu ADN (pUC 19), 0,5 mg/ml

0,5 mg

1

Nước không chứa nuclease

27

Dung dịch KCl, c(KCl) = 0,05 mol/l

50 mmol/l

5

...

...

...

10 mmol/l

5

Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l

2,5 mmol/l

5

Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l

0,8 mmol/l

4

Mồi IAC_f, 5 mmol/1

...

...

...

1

Mồi IAC_r, 5 mmol/l

0,1 mmol/l

1

Khuôn mẫu ADN polymerase, 5 IU

2,5 IU

1

B.2.6.4  Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt nêu trong Bảng B.15 đã được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá xác nhận sử dụng các chu trình nhiệt MyCycler^® hoặc Mastercycler^®1^) Gradient^2^) và Taq ADN polymerase^3^).

...

...

...

Bảng B.15 - Chu trình nhiệt

Kích hoạt và làm biến tính ban đầu

15 min/95 °C

Khuếch đại

60 s/95 °C

60 s/55 °C

2 min/72 °C

Số lượng chu trình (khuếch đại)

30

...

...

...

10 min/72 °C

B.2.6.5  Sử dụng lAC

Sử dụng bộ kit thử thích hợp có bán sẵn để tinh sạch các sản phẩm PCR. Thường 1 500 bản sao/giếng IAC là thích hợp đối với các phương pháp PCR gel-based. IAC được quy định như một IAC cạnh tranh và được xây dựng để cạnh tranh với các mồi khuếch đại gen độc tố thần kinh typ F.

B.2.7  Cách tiến hành

B.2.7.1  Cài đặt PCR

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 50 ml cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.16. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nhỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng B.16 được chứng minh là phù hợp.

Bảng B.16 - Bổ sung thuốc thử

Thuốc thử

Thể tích cuối cùng

...

...

...

Khuôn mẫu ADN

10 ng đến 50 ng

3

Nước không chứa nuclease

2,6

Dung dịch đệm PCR 10x (không chứa MgCl₂)^a

1x

5

...

...

...

4,8 mmol/l

9,6

Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l

0,8 mmol/l

4

Các mồi PCR (theo Bảng B.3) 5 mmol/l

0,3 mmol/l cho mỗi mồi

3 cho mỗi mồi

IAC, 1 500 bản sao/ml

...

...

...

1

ADN polymerase bền nhiệt, 5 lU/ml

2 IU

0,8

^a Nếu dung dịch đệm PCR chứa sẵn MgCl₂, thì nồng độ cuối cùng của MgCl₂ trong hỗn hợp phản ứng cần được chỉnh đến 4,8 mmol/l.

B.2.7.2  Kiểm chứng PCR

B.2.7.2.1  Yêu cầu chung

Cần thực hiện các phép kiểm chứng trong B.2.7.2.2 đến B.2.7.2.4 của TCVN 11134 (ISO 22174).

B.2.7.2.2  Kiểm chứng PCR âm tính

...

...

...

B.2.7.2.3  Kiểm chứng PCR dương tính

Hỗn hợp ADN của clostridia sinh ra BoNT, dương tính đối với tất cả bốn trình tự đích (các gen độc tố thần kinh typ A, B, E và F), khoảng 1 000 bản sao.

B.2.7.2.4  Kiểm soát khuếch đại

Sử dụng IAC hoặc EAC phù hợp. Ví dụ của IAC được nêu trong B.2.6.

B.2.7.3  Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt nêu trong Bảng B.17 đã được sử dụng cho các nghiên cứu đánh giá xác nhận sử dụng chu trình nhiệt Mastercycler^® Gradient và Tag polymerase. Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể phải điều chỉnh cho phù hợp. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng. Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng B.17 - Chương trình thời gian-nhiệt độ

Kích hoạt và làm biến tính ban đầu

15 min/95 °C

...

...

...

30 s/95°C

30 s/60°C

85 s/72°C

Số lượng chu trình (khuếch đại)

27

Thời gian kéo dài cuối cùng

3 min/72 °C

B.2.7.4  Phát hiện sản phẩm PCR (điện di gel)

B.2.7.4.1  Yêu cầu chung

...

...

...

B.2.7.4.2  Ghi hình gel

Chuyển gel lên bề mặt chiếu sáng, bật đèn UV và ghi lại huỳnh quang ADN bằng cách chụp ảnh hoặc ghi video.

Các trình tự đích được coi là phát hiện được nếu kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với chiều dài dự kiến của các trình tự ADN đích. Xem Bảng B.18. Việc phát hiện các đoạn có kích thước 205 bp, 389 bp, 543 bp và/hoặc 698 bp cho thấy rằng dung dịch ADN mẫu chứa ADN của clostridia sinh ra BoNT tương ứng có thể khuếch đại được.

Bảng B.18 - Kích thước sản phẩm khuếch đại

Typ

Mồi

Kích thước sản phẩm
bp

A

CBMLA3-F/CBMLA3-R

...

...

...

B

CBMLB1/CBMLB2

205

E

CBMLE1/CBMLE2

389

F

CBMLF1/CBMLF2

543

...

...

...

IOF-new-F/IOF-new-R

800

B.2.7.5  Khẳng định kết quả PCR dương tính

Kết quả PCR dương tính phải được khẳng định, ví dụ: bằng trình tự của các sản phẩm PCR. Có thể sử dụng các phương pháp thích hợp khác để khẳng định.

B.2.7.6  Hạn chế và diễn giải của phương pháp

Phương pháp này đã được thử nghiệm để phát hiện các typ và phân typ hiện có của các độc tố thần kinh của clostridia typ A, B, E và F. Tại thời điểm công bố, chưa có xác nhận liệu các mồi được liệt kê trong Bảng B.12 có thể phát hiện các phân typ mới của BoNT/A, B, E và F hay không.

Phụ lục c

(Tham khảo)

...

...

...

C.1  Phương pháp 1 - Phân tích PCR đa mồi

C.1.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả một phương pháp real-time PCR đa mồi probe-based dựa trên công nghệ TaqMan^®7) để phát hiện các các gen mã hóa độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F.

Về những hạn chế của phương pháp, xem C.1.6.5.

C.1.2  Đặc tính hiệu năng

C.1.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận đối với ADN được tách chiết từ các chủng đối chứng khác nhau của C. botulinum typ A B, E, F và từ mẫu bị nhiễm tự nhiên.

Phương pháp này đã được xuất bản trong Tài liệu tham khảo [6].

C.1.2.2  Đánh giá lý thuyết của phương pháp

...

...

...

C.1.2.3  Tính chọn lọc

C.1.2.3.1  Phép thử chọn lọc dương

Phép thử chọn lọc dương của phương pháp đã được thử nghiệm với 14 chủng C. botulinum typ A, 20 chủng C. botulinum typ B, 2 chủng C. botulinum typ E và 1 chủng C. botulinum typ F, xem Bảng C.1.

Bảng C.1 - Phép thử chọn lọc dương của PCR đa mồi sử dụng các chủng đích

Chủng, typ và phân typ

Số chủng

Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được

Typ A

Typ B

...

...

...

Typ F

C. botulinum typ A

14

14

0

0

0

C. botulinum typ B

20

...

...

...

20

0

0

C. botulinum typ E

2

0

0

2

0

...

...

...

1

0

0

0

1

CHÚ THÍCH: Các chủng được phân lập tại Phòng thử nghiệm tư vấn về vi khuẩn kỵ khí (CLAB) của trường đại học Leipzig, Đức; trường Đại học Giessen, Đức; Viện Thú y của Đức, Cơ quan An toàn thực phẩm và Y tế Bavarian của Đức.

C.1.2.3.2  Phép thử chọn lọc âm

Phép thử chọn lọc âm của phương pháp đã được thử nghiệm với 34 sinh vật không phải đích. Không quan sát được phản ứng chéo với các vi khuẩn không phải đích, xem Bảng C.2.

Bảng C.2 - Phép thử chọn lọc âm của PCR đa mồi sử dụng các chủng không phải đích

...

...

...

Số lượng chủng

Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được

Typ A

Typ B

Typ E

Typ F

C. sporogenes WDCM 00008

1

0

...

...

...

0

0

C. perfringens (WDCM 00007 và các chủng ngoài thực địa)

3

0

0

0

0

C. carnis NCTC 13036

...

...

...

0

0

0

0

C. histolyticum NCTC 503

1

0

0

0

...

...

...

C. butyricum NCTC 7423

1

0

0

0

0

C. barati NCTC 10986

1

0

...

...

...

0

0

B. subtilis WDCM 00003

1

0

0

0

0

B. cereus (NCTC 11143 và các chủng ngoài thực địa)

...

...

...

0

0

0

0

Campylobacter spp. chịu nhiệt (các chủng ngoài thực địa)

2

0

0

0

...

...

...

E. coli (WDCM 00013 và các chủng ngoài thực địa)

3

0

0

0

0

Salmonella spp. (WDCM 00030 và chủng ngoài thực địa)

2

0

...

...

...

0

0

Listeria spp. (WDCM 00017 và WDCM 00109)

2

0

0

0

0

B. thermospacta WDCM 00071

...

...

...

0

0

0

0

E. faecalis WDCM 00087

1

0

0

0

...

...

...

C. freundii WDCM 00078

1

0

0

0

0

Pseudomonas spp. (các chủng ngoài thực địa)

3

0

...

...

...

0

0

Y. enterocolitica (các chủng ngoài thực địa)

3

0

0

0

0

L.fermentum (chủng ngoài thực địa)

...

...

...

0

0

0

0

Aspergillus spp. (các chủng ngoài thực địa)

2

0

0

0

...

...

...

S. cerevisiae (chủng ngoài thực địa)

1

0

0

0

0

C.1.2.4  Độ nhạy

C.1.2.4.1  Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu bị nhiễm nhân tạo (Tài liệu tham khảo [5])

Các giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo các mẫu nhiễm nhân tạo với các mức nuôi cấy khác nhau (0,1 cfu đến 10 cfu và từ 10 cfu đến 100 cfu trước khi tăng sinh) trong 10 g các nền mẫu thực phẩm khác nhau (cá đóng hộp, xúc xích đóng hộp và mật ong) được nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy (Tài liệu tham khảo [4]). Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm nhân tạo là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %. Giới hạn phát hiện của phương pháp được quy định là 1 cfu đến 10 cfu hoặc số bào tử trên phần mẫu thử trước khi tăng sinh.

...

...

...

C.1.2.4.2  Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu bị nhiễm tự nhiên

Giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo 20 mẫu nhiễm tự nhiên (ví dụ như mật ong, thực vật và các loại thịt đóng hộp), sử dụng phương pháp nuôi cấy làm phương pháp đối chứng. Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm tự nhiên là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %.

CHÚ THÍCH: Các thực nghiệm được thực hiện với các phần mẫu thử là 10 g.

C.1.2.5  Kiểm soát phân tích

Tất cả các phép thử đã được thực hiện sử dụng các phép kiểm soát quá trình dương tính và âm tính và bổ sung đối với PCR một IAC khác loại.

C.1.2.6  Thiết bị, dụng cụ và thuốc thử

Việc đánh giá xác nhận đã được thực hiện trên stratagene MX 3000P8) và với Stratagene MX 3005P9), sử dụng 2x Brilliant Multiplex qPCR MasterMix10) (Tài liệu tham khảo [6]).

C.1.3  Nguyên tắc

Các đoạn ADN cụ thể của BoNT/typ gen A, B, E và F, được khuếch đại bằng real-time PCR đa mồi. Các sản phẩm PCR được phát hiện bằng đo huỳnh quang tại các đầu dò.

...

...

...

C.1.4.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

C.1.4.2  Nước không chứa nuclease.

C.1.4.3  MasterMix sẵn để sử dụng cho real-time PCR

MasterMix sẵn để sử dụng có chứa dung dịch đệm PCR, dung dịch MgCl₂, dung dịch dNTP, hệ thống khử nhiễm tùy chọn (dUTP bao gồm uracil N-glycosylase) và Taq polymerase và phần lớn thích nghi với chu trình nhiệt được sử dụng. Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.1.4.4  Plasmid pUC 19 (nhập số L09137).

C.1.4.5  Oligonucleotid

Trình tự của các oligonucleotid được liệt kê trong Bảng C.3.

Bảng C.3 - Trình tự của các oligonucleotid

...

...

...

Mồi

Trình tự (5' - 3')

A

CBOT A fw

TCT TAC gCg AAA Tgg TTA Tgg

CBOT A re

TgC CTg CAC CTA AAA gAg gA

CBOT A S

^CHEX-Tgg TTT TgA ggA gTC ACT TgA A-TAMRA^b

...

...

...

CBOTB fw

AggA gAA gTg gAg CGR^eAAA

CBOTB re

TTC CCT TgA TgC AAA ATg AT

CBOTB S

^aFAM-CCT ggg CCA gTT TTA AAT gA-TAMRA^b

E

CBOT E fw

TCA gCA CCT ggA CTT TCA gA

...

...

...

CAT gTT gTT CTA TAT CAC TTg TTC CA

CBOT E S

^aFAM-TCC AAA ATg ATg CTT ATA TAC CAA AA-TAMRA^b

F

CBOT F fw

ATA Cgg ggC TAg ggg AgT TA

CBOT F re

AAA TCC TgA CCT CCA AAg gTT

CBOT F S

...

...

...

Kiểm soát cation khuếch đại nội bộ

IAC_pUC_fw

TgT gAA ATA CCg CAC AgA Tg

IAC_pUC_re

AgC Tgg CgT AAT AgC gAA g

IAC_pUC_S

^dROX-gAg AAA ATA CCg CAT CAg gC-TAMRA^b

^a FAM: 6-carboxyfluorescein.

^b TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.

...

...

...

^d ROX = carboxy-X-rhodamine.

° Trong trình tự oligonucleotid R là (A,G).

CHÚ THÍCH: Việc sử dụng các nhãn huỳnh quang khác đối với các đầu dò chưa được kiểm tra và đánh giá xác nhận.

C.1.5  Thiết bị, dụng cụ

C.1.5.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thích hợp đối với phương pháp và cụ thể như sau:

C.1.5.2  Thiết bị dùng cho PCR

C.1.5.2.1  Pipet và pipet có đầu lọc, dung tích 1 ml và 1 000 ml.

C.1.5.2.2  Ống ly tâm nhỏ, dung tích 1,5 ml và 2,0 ml.

...

...

...

C.1.5.2.4  Thiết bị Real-time PCR.

C.1.6  Cách tiến hành

C.1.6.1  Cài đặt PCR

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 25 ml cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong các Bảng C.4 và C.5. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng C.4 và C.5 đã chứng minh là phù hợp.

Hai hệ thống đa kênh được sử dụng, một hệ thống để phát hiện các gen mã hóa typ A và B và IAC và một hệ thống để phát hiện các gen mã hóa typ E và F.

Bảng C.4 - Bổ sung thuốc thử (hệ thống Real-time PCR ba kênh, BoNT/A, B và IAC)

Thuốc thử

Thể tích cuối cùng

Thể tích trên mẫu
ml

...

...

...

Tối đa 250 ng

5

TaqMan^®7^) ADN polymerase

2x Brilliant Multi- plex qPCR MasterMix^10)

1 x

12,5

Dung dịch đệm PCR

Dung dịch MgCl₂

Dung dịch dNTP

...

...

...

0,3 mmol/l cho mỗi mẫu

0,75 cho mỗi mẫu

Các đầu dò PCR đối với BoNT/A, B và IAC (theo Bảng C.3), 10 mmol/l

0,2 mmol/l cho mỗi mẫu

0,5 cho mỗi mẫu

Nước không chứa nuclease

0,5

pUC 19-plasmid, 1 fg

...

...

...

1

Bảng C.5 - Bổ sung thuốc thử (hệ thống real-time PCR hai kênh, BoNT/E và F)

Thuốc thử

Thể tích cuối cùng

Thể tích trên mẫu
ml

Khuôn mẫu ADN

Tối đa 250 ng

5

TaqMan^®7^) ADN polymerase

...

...

...

1 x

12,5

Dung dịch đệm PCR

Dung dịch MgCl₂

Dung dịch dNTP

Mồi PCR đối với BoNT/E và F (theo Bảng C.3), 10 mmol/l

0,5 mmol/l cho mỗi mẫu

1,25 cho mỗi mẫu

Đầu dò PCR đối với BoNT/E và F (theo Bảng C.3), 10 mmol/l

...

...

...

0,5 cho mỗi mẫu

Nước không chứa nuclease

1,5

C.1.6.2  Kiểm chứng PCR

C.1.6.2.1  Yêu cầu chung

Cần thực hiện các phép kiểm chứng trong C.1.6.2.2 đến C.1.6.2.4 của TCVN 11134 (ISO 22174).

C.1.6.2.2  Kiểm chứng PCR âm tính

Sử dụng nước không chứa ADN làm kiểm chứng âm tính.

...

...

...

Hỗn hợp ADN của clostridia sinh ra BoNT, dương tính đối với tất cả bốn trình tự đích (các gen độc tố thần kinh typ A, B, E và F), khoảng 100 bản sao.

C.1.6.2.4  Kiểm soát khuếch đại

Sử dụng IAC hoặc EAC phù hợp. Ví dụ IAC khác loại được nêu trong C.1.6.

C.1.6.3  Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt nêu trong Bảng C.6 đã được sử dụng cho việc nghiên cứu đánh giá xác nhận, sử dụng hệ thống Stratagene MX 3000P^8^) và Stratagene MX 3005P^9) kết hợp với 2x Brilliant Multiplex qPCR MasterMix^®10^). Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể cần phải điều chỉnh cho phù hợp. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng. Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trừ khi có quy định khác.

Bảng C.6 - Chu trình nhiệt

Kích hoạt và làm biến tính ban đầu

10 min/95 °C

Số lượng chu trình (khuếch đại)

...

...

...

Khuếch đại

15 s/95 °C

60 s/55°C

C.1.6.4  Giải thích kết quả

Giá trị ngưỡng để xác định chu trình ngưỡng, Ct, được xác định bởi người phân tích hoặc bằng phần mềm của máy chu trình cụ thể. Mẫu dương tính cho đồ thị khuếch đại với ít nhất là pha mũ của đường khuếch đại điển hình, xem TCVN 11133 (ISO 22119)^[15^]. Đường khuếch đại của các mẫu này đi qua ngưỡng xác định thiết lập sau một số chu trình nhất định. Mẫu có tín hiệu huỳnh quang trên ngưỡng được coi là dương tính.

C.1.6.5  Hạn chế của phương pháp

Phương pháp này đã được thử nghiệm để phát hiện các typ và phân typ hiện có của các độc tố thần kinh của clostridia typ A, B, E và F. Tại thời điểm công bố, chưa có xác nhận liệu các mồi nêu trong Bảng C.3 có thể phát hiện các phân typ mới của BoNT/A, B, E và F hay không.

C.2  Phương pháp 2 - Phân tích PCR

C.2.1  Giới thiệu

...

...

...

Về những hạn chế xem C.2.6.5.

C.2.2  Đặc tính hiệu năng

C.2.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận đối với ADN được tách chiết từ các chủng đối chứng typ A, B, E, và F của C. botulinum và từ các mẫu bị nhiễm tự nhiên (Tài liệu tham khảo [2]).

C.2.2.2  Đánh giá lý thuyết của phương pháp

Đánh giá lý thuyết đã được thực hiện bằng cách nghiên cứu trình tự tương đồng với các cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ (Tài liệu tham khảo [16], 2009/09/20). Kết quả nghiên cứu đã khẳng định việc nhận biết hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

C.2.2.3  Tính chọn lọc

C.2.2.3.1  Phép thử chọn lọc dương

Phép thử chọn lọc dương của phương pháp đã được thử nghiệm với 60 chủng C. botulinum typ A 68 chủng C. botulinum typ B, 4 chủng C. botulimum typ AB/Ab, 21 chủng C. botulinum/butyricum typ E và 7 chủng C. botulinum/baratii typ F^[^2^], xem Bảng C.7.

...

...

...

Các chủng, typ và phân typ

Số lượng chủng

Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được

Typ A

Typ B

Typ E

Typ F

C. botulinum typ A

60

...

...

...

0

0

0

C. botulinum typ B

68

0

68

0

0

...

...

...

3

3

3

0

0

C. botulinum typ Ab

1

1

1

...

...

...

0

C. botulinum/butyricum typ E

21

0

0

21

0

C. botulinum/baratii typ F

7

...

...

...

0

0

7

C.2.2.3.2  Phép thử chọn lọc âm

Phép thử chọn lọc âm của phương pháp đã được thử nghiệm với 27 sinh vật không phải đích. Không quan sát được phản ứng chéo với các vi khuẩn không phải đích (Tài liệu tham khảo [2]), xem Bảng C.8.

Bảng C.8 - Phép thử chọn lọc âm của PCR đa mồi sử dụng các chủng không phải đích

Các chủng

Số lượng chủng

Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được

...

...

...

Typ B

Typ E

Typ F

Clostridia spp. Không phải là C. botulinum

24

0

0

0

0

...

...

...

3

0

0

0

0

C.2.2.4  Độ nhạy

C.2.2.4.1  Phép thử độ nhạy sử dụng độ pha loãng 10 lần của ADN chiết được (Tài liệu tham khảo [2])

Các giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo các dung dịch ADN tinh sạch pha loãng 10 lần. Giới hạn phát hiện đối với BoNT typ A là 25 bản sao gen, đối với BoNT typ B và F là từ 25 bản sao gen đến 250 bản sao gen, đối với BoNT typ E là 250 bản sao gen.

C.2.2.4.2  Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu bị nhiễm tự nhiên

...

...

...

CHÚ THÍCH: Các thực nghiệm được thực hiện với các phần mẫu thử 10 g.

C.2.2.4.3  Thử nghiệm cộng tác

Các mồi và đầu dò đã được đánh giá trong nghiên cứu hợp tác quốc tế thực hiện trong bốn phòng thử nghiệm của Châu Âu, sử dụng Real-time PCR khác nhau. Kết quả của nghiên cứu này đã được báo cáo trong Tài liệu tham khảo [2].

C.2.2.5  Kiểm soát phân tích

Tất cả các phép thử đã thực hiện sử dụng các phép kiểm chứng âm tính và dương tính và bổ sung cho PCR EAC.

C.2.2.6  Thiết bị, dụng cụ và thuốc thử

Việc đánh giá xác nhận đã được thực hiện đối với ABI 770011) và Stratagene MX 3005P^9) đối với các phép thử (Tài liệu tham khảo [2]) sử dụng kỹ thuật TaqMan^® Universal PCR MasterMix12) hoặc dung dịch đệm qPCR MasterMix13).

C.2.3  Nguyên tắc

Các đoạn ADN cụ thể của các gen BoNT/A, B, E, F được khuếch đại bằng Real-time PCR . Các sản phẩm PCR được phát hiện bằng cách đo sự phát huỳnh quang tại các đầu dò.

...

...

...

C.2.4.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

C.2.4.2  Nước không chứa nuclease.

C.2.4.3  MasterMix sẵn để sử dụng cho real-time PCR

MasterMix sẵn để sử dụng có chứa dung dịch đệm PCR, dung dịch MgCl₂, dung dịch dNTP hệ thống khử nhiễm tùy chọn (dUTP bao gồm uracil N-glycosylase) và Taq polymerase và phần lớn thích nghi với chu trình nhiệt được sử dụng. Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.2.4.4  Oligonucleotid

Trình tự của các oligonucleotid được nêu trong Bảng C.9.

Bảng C.9 - Trình tự của các oligonucleotid

Typ

...

...

...

Trình tự (5' - 3')

A

A.1

ggA gTC ACT TGA AGT TGA TAC AAA TC

A.2

gCT AAT gTT ACT gCT ggA TCT gTA g

A.3

FAM^b-TCT TTT Agg TgC Agg CAA ATT T-BHQ1^c

B

...

...

...

gAT gAA CAg CCA ACA TAT AgT TgT CA

B.2

gTT TCC TTT TTA CCT CTT TTA AgT ACC ATT

B.3

FAMb-TgA TgA K^aAT Agg ATT gAT Tgg TAT TCA-BHQ1^c

E

E.1

CTA TCC AAA ATg ATg CTT ATA TAC CAA A

E.2

...

...

...

E.3

FAM^b-ATg ATT CTA ATg gAA CAA gTg ATA TAg AAC AAC ATg ATg T -BHQ1^c

F

F.1

gCA ATA TAg gAT TAC TAg gTT TTC ATT C

F.2

gAA ATA AAA CTC CAA AAg CAT CCA TT

F.3

FAM^b-TTg gTT gCT AgT AgT Tgg TAT TAT AAC AA-BHQ1^c

...

...

...

EAC1

TAC CAT Agg Agg AAg CCA C

EAC2

CTT CTT CCT AAT CTC TAC gCA T

EAC3

HEX^d-gTg CCA gCA gCC gCg gTA ATA Cg-BHQ1^c

^a Trong trình tự oligonucleotid K là (G,T).

^b FAM: 6-carboxyfluorescein.

^c BlackHole^TM Dark Quencher 1. BlackHole là tên thương mại của sản phẩm do Biosearch Technilogies cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và trong tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng sản phẩm này, có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Việc sử dụng các nhãn huỳnh quang khác cho các đầu dò chưa được thử nghiệm hoặc đánh giá xác nhận.

C.2.4.5  Kiểm soát khuếch đại bên ngoài

C.2.4.5.1  Nguyên tắc chung

ADN được chiết từ chủng C. butyricum ATCC^® 19398^TM14) được khuếch đại bằng PCR sử dụng các mồi đặc hiệu nêu trong Bảng C.9 trong ống phản ứng riêng biệt cùng với khuôn mẫu ADN (Tài liệu tham khảo [8]).

C.2.4.5.2  Chủng C. butyricum ATCC^® 19398^TM

Cấy chủng C. butyricum ATCC^® 19398^TM trong canh thang TPGY ở 30 °C ± 1 °C trong 24 h ± 2 h trong các điều kiện kỵ khí. Chiết ADN từ môi trường tăng sinh (9.3). Sử dụng khoảng 2 500 bản sao ADN làm EAC.

C.2.4.5.3  Sử dụng EAC

Kích thước của sản phẩm khuếch đại của chủng C. butyricum ATCC^® 19398^TM là 232 bp. Tổng số 2 500 bản sao ADN cho giá trị C_t xấp xỉ 30.

C.2.5  Thiết bị, dụng cụ

...

...

...

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thích hợp phù hợp với phương pháp và cụ thể như sau:

C.2.5.2  Thiết bị dùng cho PCR

C.2.5.2.1  Pipet và pipet có đầu lọc, có dung tích từ 1 ml đến 1 000 ml

C.2.5.2.2  Ống ly tâm nhỏ, có dung tích 1,5 ml và 2,0 ml.

C.2.5.2.3  Ống PCR, ống phản ứng 0,2 ml hoặc 0,5 ml, đĩa PCR vi giếng hoặc thiết bị phù hợp khác.

C.2.5.2.4  Thiết bị real-time PCR

C.2.6  Cách tiến hành

C.2.6.1  Cài đặt PCR

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 25 mI cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng C.10 và C.11. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng C.10 và Bảng C.11 được chứng minh là phù hợp.

...

...

...

Bảng C.10 - Bổ sung thuốc thử (các hệ thống real-time PCR BoNT/A, B, E hoặc F)

Thuốc thử

Giá trị cuối cùng

Thể tích trên mẫu
ml

Khuôn mẫu ADN

Tối đa 250 ng

5

ADN polymerase TaqMan®^7^)

2x TaqMan^® Uni- versal PCR MasterMix^12)

...

...

...

12,5

Dung dịch đệm PCR

Dung dịch MgCl₂

Dung dịch dNTP

Mồi PCR dùng cho BoNT/A, B, E hoặc F (theo Bảng C.9) 10 mmol/l

0,3 mmol/1 cho mỗi mẫu

0,75 cho mỗi mẫu

Đầu dò PCR dùng cho BoNT/A, B, E hoặc F (theo Bảng C.9), 10 mmol/l

0,1 mmol/l cho mỗi mẫu

...

...

...

Nước không chứa nuclease

0,75

Bảng C.11 - Bổ sung thuốc thử (EAC)

Thuốc thử

Giá trị cuối cùng

Thể tích trên mẫu
ml

Khuôn mẫu ADN

Tối đa 250 ng

...

...

...

ADN polymerase TaqMan®^7^)

2x TaqMan^® Uni-versal PCR MasterMix^12)

1x

12.5

Dung dịch đệm PCR

Dung dịch MgCl₂

Dung dịch dNTP

Mồi PCR dùng cho EAC (theo Bảng C.9) 10 mmol/l

0,9 mmol/l cho mỗi mẫu

...

...

...

Đầu dò PCR dùng cho BoNT/E và F (theo Bảng C.9), 10 mmol/l

0,3 mmol/l cho mỗi mẫu

0,75 cho mỗi mẫu

C. butyricum ADN (2 500 bản sao/ml)

2 500 bản sao

1

Nước không chứa nuclease

1,25

...

...

...

C.2.6.2.1  Yêu cầu chung

Cần thực hiện các phép kiểm chứng trong C.2.6.2.2 đến C.2.6.2.4 của TCVN 11134 (ISO 22174).

C.2.6.2.2  Kiểm chứng PCR âm tính

Sử dụng nước không chứa ADN làm kiểm chứng âm tính.

C.2.6.2.3  Kiểm chứng PCR dương tính

Hỗn hợp ADN của clostridia sinh ra BoNT, dương tính đối với tất cả bốn trình tự đích (các gen độc tố thần kinh typ A, B, E và F), khoảng 1 000 bản sao.

C.2.6.2.4  Kiểm soát khuếch đại

Sử dụng IAC hoặc EAC phù hợp. Ví dụ của EAC được nêu trong C.2.4.5.

C.2.6.3  Chu trình nhiệt

...

...

...

Bảng C.12 - Chu trình nhiệt

Kích hoạt và làm biến tính ban đầu

10 min/95 °C

Số lượng chu trình (khuếch đại)

35

Khuếch đại

15 s/95 °C

60 s/60 °C

C.2.6.4  Giải thích kết quả

...

...

...

C.2.6.5.  Hạn chế của phương pháp

Phương pháp này đã được thử nghiệm để phát hiện các typ và phân typ hiện có của các độc tố thần kinh của clostridia typ A, B, E và F. Tại thời điểm công bố, chưa có xác nhận liệu các mồi nêu trong Bảng C.9 có thể phát hiện các phân typ mới của BoNT/A, B, E và F hay không.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Chuẩn bị các bào tử của C. botulinum

D.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả việc chuẩn bị các bào tử C. botulinum (cả chủng phân giải protein và không phân giải protein) để kiểm soát quá trình (9.2.3). Xem Hình D.1. Chi tiết có trong Tài liệu tham khảo [4].

D.2  Môi trường nuôi cấy

...

...

...

Thực hiện theo TCVN 8128 (ISO 11133) để chuẩn bị, sản xuất và thử nghiệm hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

D.2.2  Canh thang Anellis cải biến

Có thể sử dụng môi trường nuôi cấy tăng sinh khác đã được phê duyệt nếu đã biết có hiệu năng tương đương.

D.2.2.1  Môi trường thạch

D.2.2.1.1  Thành phần và độ pH

Trypton                                                 25 g

Pepton                                                 2,5 g

Chất chiết nấm men                               0,5 g

Thạch                                                   0,5 g

...

...

...

Nước                                                    đến 500 ml

pH 7,5 ± 0,1

D.2.2.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,5 ± 0,1 ở 25 °C. Phân phối vào bình hoặc chai có dung tích thích hợp. Tiệt trùng trong 15 min ở 121 °C.

Môi trường được làm đông đặc (phần đặc của canh thang Anellis cải biến). Môi trường này cần được sử dụng trong ngày chuẩn bị.

D.2.2.2  Môi trường lỏng

D.2.2.2.1  Thành phần và độ pH

Chất chiết nấm men                                                                   0,25 g

Amoni sulfat [(NH4)₂SO₄] (w ±2 %)                                              5 g

...

...

...

Nước                                                                                        đến 250 ml

pH 7,5 ±0,1

D.2.2.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,5 ± 0,1 ở 25 ^oC. Phân phối vào bình hoặc chai có dung tích thích hợp. Tiệt trùng 15 min ở 121 °C. Bảo quản trong tủ lạnh ở 5 °C ± 3 °C cho đến khi sử dụng. Môi trường này cần được sử dụng trong ngày chuẩn bị.

D.2.2.3  Chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh

Đối với môi trường cuối cùng sử dụng lượng chất rắn với lượng chất lỏng là 4 + 1. Sau khi làm mát thạch đã đông đặc từ 20 °C đến 30 °C, chuyển một lượng thích hợp dịch cấy của chủng C. botulinum phân giải protein (xem D.5) vào môi trường đặc và phủ bằng một lớp môi trường lỏng.

D.2.3  Môi trường hai pha

Có thể sử dụng môi trường nuôi cấy tăng sinh khác đã được phê duyệt nếu cho hiệu năng tương đương.

D.2.3.1  Pha thạch (thạch gan)

...

...

...

Huyễn dịch từ gan tươi                          30 g

Pepton                                                 0,6 g

Natri clorua, NaCl                                  0,3 g

Thạch                                                   1,2 g

Nước                                                    đến 500 ml

pH 6,9 ± 0,1

D.2.3.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,9 ± 0,1 ở 25 °C. Phân phối vào bình hoặc chai có dung tích thích hợp. Tiệt trùng 15 min ở 121 °C. Bảo quản trong tủ lạnh ở 5 °C ± 3 °C cho đến khi sử dụng. Môi trường này cần được sử dụng trong ngày chuẩn bị.

D.2.3.2  Môi trường lỏng

...

...

...

D.2.3.3  Chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh

Đối với môi trường cuối cùng sử dụng lượng chất rắn với lượng chất lỏng là 2 + 1. Sau khi làm mát thạch đã đông đặc từ 20 ^oC đến 30 °C, chuyển một lượng thích hợp dịch cấy của chủng C. botulinum không phân giải protein (xem D.5) vào môi trường đặc và phủ bằng một lớp môi trường lỏng.

D.3  Thuốc thử

D.3.1  Hóa chất làm sạch các bào tử

D.3.1.1  Natri clorua, NaCl.

D.3.1.2  Dung dịch natri clorua, r(NaCl) = 0,85 g/l, được hòa tan trong nước vô trùng.

D.3.2  Thuốc thử để nhuộm Gram

D.3.2.1  Tím tinh thể, [(CH₃)₂NC₆H₄]₂C:C₆H₄:N^+(CH₃)₂Cl^-.

D.3.2.2  Etanol, r(C₂H₅OH) = 96 %.

...

...

...

D.3.2.4  Nước.

D.3.2.5  Tinh thể iốt.

D.3.2.6  Kali iodua.

D.3.2.7  Safranin, C₂₀H₁₉CIN₄.

D.3.2.8  Dung dịch Safranin, r(C₂₀H₁₉CIN₄) = 0,1 g/l.

D.3.2.9  Dung dịch nhuộm màu tím tinh thể

Hòa tan 2,0 g tím tinh thể (D.3.2.1) trong 20 ml etanol (D.3.2.2) và 0,8 g amoni oxalat trong 80 ml nước. Trộn nhẹ hai dung dịch với nhau. Hỗn hợp này có thể bền đến khoảng 2 năm đến 3 năm.

D.3.2.10  Iot để nhuộm Gram

Hòa tan 2 g kali iodua (D.3.2.6) trong 2 ml nước cất. Các tinh thể được hòa tan và dung dịch trở nên rất lạnh. Hòa tan các tinh thể iot (D.3.2.5) trong dung dịch kali iodua. Pha loãng hỗn hợp với 298 ml nước. Hỗn hợp này có thể bền đến khoảng 2 năm đến 3 năm.

...

...

...

D.4  Thiết bị, dụng cụ

D.4.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau.

D.4.2  Thiết bị để tăng sinh vi khuẩn

D.4.2.1  Nồi cách thủy, có khả năng duy trì ở 30 °C ± 1 °C.

D.4.2.2  Bình kỵ khí hoặc tủ kỵ khí, có khả năng duy trì ở 30 °C ± 1 °C, theo TCVN 6404 (ISO 7218).

D.4.2.3  Tủ ấm, có khả năng duy trì ở 30 °C ± 1 °C.

D.4.2.4  Bình cầu hoặc chai, dung tích thích hợp.

D.4.3  Thiết bị làm sạch các bào tử

...

...

...

D.4.3.2  Máy ly tâm, dùng cho các ống 50 ml và 100 ml, với gia tốc có thể điều chỉnh đến 6 000 x g.

D.4.3.3  Kính hiển vi quang học có độ phóng đại của vật kính lên đến 100x.

D.4.3.4  Lam kính, kích thước 75 mm x 25 mm.

D.5  Cách tiến hành

D.5.1  Nuôi cấy

D.5.1.1  Chủng C. botulinum phân giải protein (canh thang Anellis cải biến)

Đối với môi trường cuối cùng sử dụng lượng chất rắn với lượng chất lỏng là 2 + 1. Sau khi làm mát thạch đã đông đặc từ 20 °C đến 30 °C, cấy 1 ml của dịch cấy TPGY (9.2) của chủng C. botulinum phân giải vào pha đặc (D.2.2.1) của môi trường và phù bằng một lớp môi trường lỏng (D.2.2.2).

D.5.1.2  Chủng C. botulinum không phân giải protein (môi trường hai pha)

Đối với môi trường cuối cùng sử dụng lượng chất rắn với lượng chất lỏng là 4 + 1. Sau khi làm mát thạch đã đông đặc từ 20 °C đến 30 °C, cấy 1 ml của dịch cấy TPGY (9.2) của chủng C. botulinum không phân giải protein vào pha đặc (D.2.3.1) của môi trường và phủ bằng một lớp môi trường lỏng (D.2.3.2).

...

...

...

Ủ các chủng C. botulinum phân giải protein trong canh thang Anellis cải biến, các chủng không phân giải protein trong môi trường hai pha 7 ngày ở 30 °C ± 1 °C ở điều kiện kỵ khí (D.4.2.3).

D.5.3  Phân lập và làm sạch các bào tử từ dịch cấy tăng sinh

Cho ly tâm 20 ml phần chất lỏng của môi trường tăng sinh 15 min ở 6 000 x g (D.4.3.2) và loại bỏ phần nổi phía trên.

Hòa lại các hạt cặn trong 20 ml dung dịch natri clorua (D.3.1.2.), ly tâm mẫu 15 min ở 6 000 x g và siêu âm mẫu 5 min trong máy siêu âm (D.4.3.1). Lặp lại các bước ly tâm, hòa tan lại và siêu âm năm lần.

Hòa lại các hạt cặn trong 1 ml dung dịch natri clorua (D.3.1.2), ly tâm mẫu 1 h ở 6 000 x g và loại bỏ phần nổi phía trên.

Hòa lại các hạt cặn trong 20 ml dung dịch natri clorua (D.3.1.2), ly tâm mẫu 15 min ở 6 000 x g (D.4.3.2), loại bỏ phần nổi phía trên và siêu âm mẫu 5 min trong máy siêu âm (D.4.3.1). Lặp lại các bước ly tâm, hòa tan lại và siêu âm bốn lần.

Hòa lại các hạt cặn trong 1 ml dung dịch natri clorua (D.3.1.2) và bảo quản các bào tử ở 1 °C cho đến khi sử dụng.

D.5.4  Khẳng định kết quả

D.5.4.1  Yêu cầu chung

...

...

...

D.5.4.2  Nhuộm Gram

D.5.4.2.1  Chuẩn bị vết bôi

Chuyển 1 giọt hoặc 2 giọt huyền phù bào tử vào lam kính (D.4.3.4) và dàn đều thành màng mỏng. Để khô trên bề mặt phẳng. Sau khi đã khô trong không khí, hơ phiến kính qua ngọn lửa hai hoặc ba lần. Làm nguội phiến kính trước khi nhuộm.

D.5.4.2.2  Nhuộm

Nhỏ dung dịch tím tinh thể (D.3.2.9) ngập vết bôi, để nhuộm trong 30 s. Rửa nhanh bằng nước để loại bỏ tím tinh thể dư thừa. Nhỏ iot nhuộm màu Gram (D.3.2.10) để trong 3 s. Rửa nhanh bằng nước mà không để bị khô. Rửa nhẹ dưới dòng nước chảy. Khử màu bằng cách cho dung dịch etanol (D.3.2.2) chảy qua vết nhuộm và dừng lại khi nước chảy trong. Rửa bằng nước vòi và nhuộm màu bổ sung với dung dịch safranin (D.3.2.8) trong 15 s. Loại bỏ chất nhuộm dư dưới dòng nước chảy nhẹ. Dựng thẳng lam kính cho chảy hết nước và để khô trong không khí.

D.5.4.2.3  Kiểm tra bằng kính hiển vi

Soi tế bào với vật kính dầu có độ phóng đại 100x (D.4.3.3) có ngâm dầu (D.3.2.11). Các tế bào sinh dưỡng C. botulinum là vi khuẩn Gram dương hình que và sinh các nội bào tử gần cuối. Các tế bào sinh dưỡng có màu xanh. Các bào tử có thể nằm trong tế bào hoặc tồn tại dưới dạng bào tử tự do. Chỉ có một vài tế bào sinh dưỡng nằm trong trường quan sát của kính hiển vi.

Hình D.1 - Sơ đồ chuẩn bị các bào tử

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] De Medici D., Anniballi F., Wyatt G.M., Lindstrom M., Messelhausser U., Aldus C.F., Delibato E., Korkeala H., Peck M.W., Fenicia L Multiplex PCR to detect botulinum neurotoxin-producing clostridia in clinical, food and environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75 pp.6457- 6461

[2] Fach P., Fenicia L., Knutsson R., Wielinga P.R., Anniballi F., Delibato E., Auricchio B., Woudstra C., Agren J., Segerman B., De Medici D., Van Rotterdam BJ An innovative molecular detection tool for tracking and tracing Clostridium botulinum types A, B, E, F and other botulinum neurotoxin producing clostridia based on the GeneDisc cycler. Int. ]. Food Microbiol. 2011, 145 (Suppl 1) pp. S145-S151

[3] Fenicia L., De Medici D., Anniballi F., Delibato E., Aureli P. Multiplex PCR method to detect Botulinum neurotoxins producing clostridia in food and clinical samples. Abstract Book of MED-VET-NET 2nd Annual General meeting 2006-05-03/06, Malta

[4] Fenicia L, Fach P., Van Rotterdam B., Author S.V.A., Anniballi F., Wielinga P., Auricchio B., Woudstra C., Delibato E., De Medici D., Knutsson R. Towards an international standard for detection and typing botulinum neurotoxin-producing clostridia types A, B, E and F in food, feed and environmental samples: A European ring trial study to evaluate a real-time PCR assay. Int. J. Food Microbiol. 2011, 145 (Suppl 1) pp. S152-S157

[5] Grecz N., Anellis A., Schneider M.D. Procedure for cleaning of Clostridium botulinum spores. J. Bacteriol. 1962, 84 pp. 552-558

[6] Lindstrom M., Keto R., Markkula A., Nevas M., Hielm S., Korkeala H. Multiplex PCR assay for detection and identification of Clostridium botulinum types A, B, E, and F in food and fecal material. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67 pp. 5694-5699

[7] Messelhausser U., Zucker R., Ziegler H., Elmer-Englhard D., Kleih W., Holler C., Busch U. Nachweis von Clostridium botulinum TVp A, B, E und F mittels real-time-PCR [Detection of Clostridium botulinum type A, B, E and F with real-time-PCR]. J. Verbrauch. Lebensm. 2007, 2 pp. 198-201

[8] Center for Food Safety and Applied Nutrition. M151: Trypticase-peptone-glucose- yeast extract broth. In: Bacteriological analytical manual online. Silver Spring, MD: U.S. Food & Drug Administration, 2001. Available (viewed 2013-04-22) at: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063710.htm

...

...

...

[10] TCVN 6507-3 (ISO 6887-3) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản

[11] TCVN 6507-4 (ISO 6887-4) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 4: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các sản phẩm khác với sữa và sản phẩm sữa, thịt và sản phẩm thịt, thủy sản và sản phẩm thủy sản

[12] TCVN 6507-5 (ISO 6887-5) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 5: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu sữa và sản phẩm sữa

[13] TCVN 6507-6 (ISO 6887-6) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 6: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu được lấy từ giai đoạn sản xuất ban đầu

[14] TCVN 11132 (ISO 22118) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện và định lượng vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Đặc tính hiệu năng

[15] TCVN 11133 (ISO 22119) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase real-time (Real-time PCR ) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung

[16] National Center for Biotechnology Information (NCBI] Blast15)! search, European Molecular Biology Laboratory [EMBL] database. Available (viewed 2013-04-22] at: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

[17] Nakamura S School of Medicine, Kanazawa University, Kanazawa, Japan

1) MyCycler^® Gradient là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi BioRad. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

...

...

...

3) 2x Multiplex qPCR MasterMix^® là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Qiagen. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

4) 10x nghĩa là nồng độ của dung dịch đệm PCR cao gấp 10 lần.

5) Tap ADN polymerase là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Applied Biosystem. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

6) Tap AON polymerase là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Quiagen. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

7) TapMan® là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Roche Molecular System. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

8) Stratagene MX 3000P là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Agilent Technologies. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

9) Stratagene MX 3005P là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Agilent Technologies. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

10) 2x Brilllant Multiplex qPCR MasterMix là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Agilent Technologies. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

11) ABI 7700 là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Agilent Technologies. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

...

...

...

13) qPCR MasterMix là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Eurogentec. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

14) Butyricum ATCC® 19398 là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi ATCC. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

15) Blast® là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi National Library of Medidne. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.