Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-5:2015 về Phát hiện Salmonella - Phụ gia thực phẩm

• Số hiệu: TCVN11039-5:2015
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2015

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 11039-5:2015

PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 5: PHÁT HIỆN SALMONELLA

Food aditive - Microbiological analyses - Part 5: Detection of salmonella

Lời nói đầu

TCVN 11039-5:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo JECFA 2006, Combined compendium of food additive specifications, Volume 4: Analytical methods, test procedures and laboratory solutions used by and referenced in the food additive specitications;

TCVN 11039-5:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F4 Gia vị và phụ gia thực phẩm biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố;

Bộ tiêu chuẩn TCVN 11039 Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật gồm các phần sau:

- TCVN 11039-1:2015, Phần 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đếm đĩa;

...

...

...

- TCVN 11039-3:2015, Phần 3: Phát hiện và định lượng coliform và E. coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (Phương pháp chuẩn);

- TCVN 11039-4:2015, Phần 4: Phát hiện và định lượng coliform và E. coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suốt lớn nhất (Phương pháp thông dụng);

- TCVN 11039-5:2015, Phần 5: Phát hiện Salmonella;

- TCVN 11039-6:2015, Phần 6: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc;

- TCVN 11039-7:2015, Phần 7: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN);

- TCVN 11039-8:2015, Phần 8: Định lượng nấm men và nấm mốc.

PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 5: PHÁT HIỆN SALMONELLA

Food additive - Microbiological analyses - Part 5: Detection of Salmonella

...

...

...

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện Salmonella trong phụ gia thực phẩm.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

AOAC 967.28 Salmonella in foods. Serological tests (Salmonella trong thực phẩm. Phép thử huyết thanh)

AOAC 978.24 Salmonella spp. in foods. Biochemical identification kit method (Salmonella spp. trong thực phẩm. Phương pháp nhận diện bằng kit sinh hóa)

AOAC 989.12 Salmonella spp., Escherichia coli, and other Enterobacteriaceae in foods. Biochemical identification kit method (Salmonella spp., Escherichia coli và các vi khuẩn Enterobacteriaceae khác trong thực phẩm. Phương pháp nhận diện bằng kit sinh hóa)

AOAC 991.13 Salmonella, Escherichia coli, and other Enterobacteriaceae in foods. Biochemical system identification (Vitek GNI+) screening method [Salmonella, Escherichia coli và các vi khuẩn Enterobacteriaceae khác trong thực phẩm. Phương pháp sàng lọc nhận diện bằng hệ sinh hóa (Vitek GNI+)]

AOAC 994.04 Salmonella in dry foods. Refrigerated pre-enrichment and selective enrichment broth culture methods (Salmonella trong thực phẩm dạng khô. Phương pháp sử dụng tiền tăng sinh lạnh đông và canh thang tăng sinh chọn lọc)

3. Thuật ngữ và định nghĩa

...

...

...

3.1

Salmonella (Salmonella)

Các vi sinh vật hình thành khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc không điển hình trên môi trường đặc chọn lọc và có những đặc điểm về sinh hóa và huyết thanh như được mô tả khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

3  Nguyên tắc

Quy trình phát hiện Salmonella cần qua bốn giai đoạn kế tiếp nhau:

a) Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc (canh thang lactose hoặc môi trường thích hợp khác), ủ 24 h ± 2 h ở 35 °C.

b) Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc (môi trường Tetrathionat, môi trường Rappaport- Vassiliadis hoặc môi trường thích hợp khác), với nhiệt độ và thời gian thích hợp.

c) Đổ đĩa và nhận dạng: cấy dịch tăng sinh thu được lên các môi trường đặc chọn lọc (thạch BS, thạch XLD và thạch HE) với nhiệt độ và thời gian thích hợp.

d) Khẳng định Salmonella bằng các phép thử sinh hóa và huyết thanh thích hợp (xem 8.5).

...

...

...

4.1  Canh thang lactose (xem A.1).

4.2  Canh thang selenit cystin (SC) (xem A.2).

4.3  Canh thang tetrathionat (TT) (xem A.3).

4.4  Môi trường Rappaport-Vassiliadis (RV) (xem A.4).

4.5  Thạch xylose lysin desoxycholat (XLD) (xem A.5).

4.6  Thạch Hektoen enteric (HE) (xem A.6).

4.7  Thạch bismuth sulfit (BS) (xem A.7).

4.8  Thạch sắt ba đường (TSI) (xem A.8).

4.9  Thạch lysin sắt (LIA) (Edwards và Fife) (xem A.9).

...

...

...

4.11  Canh thang trypticase đậu tương-tryptose (xem A.11).

4.12  Canh thang MR-VP (xem A.12).

4.13  Thạch xitrat Simmons (xem A.13).

4.14  Canh thang ure (xem A.14).

4.15  Canh thang ure (chuẩn bị nhanh) (xem A.15).

4.16  Canh thang malonat (xem A.16).

4.17  Canh thang lysin decarboxylase (xem A.17).

4.18  Môi trường thử nghiệm tính di động (bán đặc) (xem A.18).

4.19  Canh thang kali xyanua (KCN) (xem A.19).

...

...

...

4.21  Canh thang cacbohydrat đỏ tía (xem A.21).

4.22  Thạch MacConkey (xem A.22).

4.23  Canh thang dịch tim não (BHI) (xem A.23).

4.24  Thạch máu tryptose cơ bản (xem A.24).

4.25  Dung dịch papain, 5 % (khối lượng) (xem A.25).

4.26  Thuốc thử Kovacs (xem A.26).

4.27  Các thuốc thử Voges-Proskauer (VP) (xem A.27).

4.28  Creatin phosphat tinh thể

4.29  Dung dịch kali hydroxit, 40 % (khối lượng) (xem A.28).

...

...

...

4.31  Chỉ thị metyl đỏ (xem A.31).

4.32  Dung dịch natri clorua (NaCI), 5 % (khối lượng/thể tích).

4.33  Nước muối sinh lý, 0,85 % (khối lượng/thể tích) (vô trùng) (xem A.29).

4.34  Nước muối sinh lý formalin (xem A.30).

4.35  Dung dịch mannan endo-1,4- betamannosidase (EC 3.2.178), 1,0 % (khối lượng/thể tích)

Thêm 1 g mannosidase vào 99 ml nước cất vô trùng.

4.36  Kháng huyết thanh Salmonella đa giá (O)

4.37  Kháng huyết thanh Salmonella đa giá (H)

4.38  Các kháng huyết thanh Salmonella đơn giá nhóm (O): A, B, C₁, C₂, C₃, D₁, D₂, E₁, E₂, E₃, E₄, F, G, H, I, Vi, và các nhóm thích hợp khác

...

...

...

4.40  Nước cất vô trùng

5  Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp.

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh và cụ thể là:

5.1  Máy đồng hóa.

5.2  Bình trộn vô trùng.

5.3  Bình nón nắp xoáy, miệng rộng, dung tích 500 ml.

5.4  Bình nón, dung tích 500 ml, vô trùng.

5.5  Cốc có mỏ, dung tích 250 ml, vô trùng.

...

...

...

5.7  Bộ dàn mẫu, bằng chất dẻo hoặc thủy tinh được uốn một đầu, vô trùng.

5.8  Cân và quả cân, có thể cân đến 2000 g, có độ nhạy 0,1 g.

5.9  Cân và quả cân, có thể cân đến 120 g, có độ nhạy 5 mg.

5.10  Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 35 °C ± 2 °C.

5.11  Tủ ấm, có chế độ làm lạnh hoặc tủ lạnh phòng thử nghiệm, có thể duy trì nhiệt độ 4 °C ± 2 °C.

5.12  Nồi cách thủy, kiểm soát được nhiệt độ ở 49 °C ± 1 °C.

5.13  Nồi cách thủy, tuần hoàn, kiểm soát được nhiệt độ ở 43 °C ± 0,2 °C.

5.14  Nồi cách thủy, tuần hoàn, kiểm soát được nhiệt độ ở 42 °C ± 0,2 °C.

5.15  Thìa hoặc dụng cụ thích hợp khác để chuyển các mẫu phụ gia thực phẩm, vô trùng.

...

...

...

5.17  Pipet vô trùng, có thể phân phối 1 ml, chia vạch đến 0,01 ml; có thể phân phối 5 ml và 10 ml, chia vạch 0,1 ml.

5.18  Kim cấy và vòng cấy (đường kính trong khoảng 3 mm), nicrom, platin-iridi, dây cromel hoặc chất dẻo vô trùng.

5.19  Ống nghiệm hoặc ống cấy vô trùng, kích thước 16 mm x 150 mm và 20 mm x 150 mm; ống huyết thanh, kích thước 10 mm x 75 mm hoặc 13 mm x 100 mm.

5.20  Máy trộn Vortex.

5.21  Kéo, dao, kẹp, vô trùng.

5.22  Đèn (để quan sát phản ứng huyết thanh học).

5.23  Đèn Fisher hoặc Bunsen (đèn có đầu đốt sử dụng ga) hoặc đèn cồn.

5.24  Giấy thử pH, có dải pH từ 6 đến 8, chia vạch 0,4 đơn vị pH trên mỗi dải màu.

5.25  Máy đo pH

...

...

...

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

7  Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu được trộn đều để thu được các phần mẫu thử đồng nhất.

8  Cách tiến hành

8.1  Tăng sinh sơ bộ

Cân vô trùng 25 g mẫu, cho vào bình nắp vặn miệng rộng vô trùng dung tích 500 ml (5.3) hoặc vật chứa thích hợp khác. Thêm 225 ml canh thang lactose vô trùng (4.1) và trộn đều, chuẩn bị về cơ bản theo tỉ lệ mẫu : canh thang = 1 : 9 (thể tích). Vặn chặt nút bình và để yên 60 min ± 5 min ở nhiệt độ phòng. Trộn kỹ bằng cách xoay và xác định pH bằng giấy thử (5.24). Chỉnh pH nếu cần, đến 6,8 ± 0,2. Nới lỏng nắp bình khoảng 1/4 vòng và ủ 24 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10).

Trong một số trường hợp đặc biệt, việc phân tích mẫu có thể bị cản trở bởi độ nhớt của các chất làm dày. Có thể bổ sung các bước xử lý như sau:

- Đối với gum ghatti, bổ sung natri clorua 5 % (4.32) (nồng độ cuối cùng là 0,1 %) vào môi trường tăng sinh sơ bộ canh thang lactose, chỉnh pH đến 6,5.

...

...

...

- Đối với carob bean gum và guar gum, cân vô trùng 25 g mẫu cho vào cốc có mỏ vô trùng dung tích 250 ml (5.5) hoặc vật chứa thích hợp khác. Chuẩn bị dung dịch mannan endo-1,4-betamannosidase 1,0 % (4.35). Phân phối vào các chai 150 ml. Dung dịch có thể bảo quản được ở 2 °C đến 5 °C trong 2 tuần. Thêm 225 ml canh thang lactose vô trùng và 2,25 ml dung dịch mannosidase 1 % vô trùng vào bình nắp xoáy miệng rộng 500 ml (5.3) hoặc vật chứa thích hợp. Khuấy mạnh canh thang mannosidase/lactose bằng que khuấy từ, đồng thời đổ nhanh 25 g mẫu thử qua phễu thủy tinh vô trùng (5.6) vào canh thang mannosidase/lactose. Vặn chặt nút bình và để yên 60 min ± 5 min ở nhiệt độ phòng. Nới lỏng bình và ủ 24 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10) mà không điều chỉnh pH.

8.2  Tăng sinh chọn lọc

8.2.1  Đối với gum carob bean và gum guar

Chuyển 1 ml dịch cấy đã tăng sinh sơ bộ (xem 8.1) vào 10 ml canh thang SC (4.2) và 1 ml dịch cấy đã tăng sinh sơ bộ khác vào 10 ml canh thang TT (4.3). Trộn bằng máy Vortex (5.20). Ủ canh thang SC và canh thang TT trong 24 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10). Tiến hành theo 8.2.2 b.

8.2.2  Đối với các mẫu khác

Chuyển 0,1 ml dịch cấy đã tăng sinh sơ bộ (xem 8.1) vào 10 ml môi trường RV (4.4) và 1 ml dịch cấy đã tăng sinh sơ bộ khác vào 10 ml canh thang TT (4.3). Trộn bằng máy Vortex (5.20).

b) Ủ các môi trường tăng sinh chọn lọc như sau:

- Mật độ vi sinh vật cao: Ủ môi trường RV trong 24 h ± 2 h ở 42 °C ± 0,2 °C trong nồi cách thủy tuần hoàn có kiểm soát nhiệt (5.14); ủ canh thang TT trong 24 h ± 2 h ở 43 °C ± 0,2 °C trong nồi cách thủy tuần hoàn có kiểm soát nhiệt (5.13).

- Mật độ vi sinh vật thấp (ngoại trừ gum carob bean và gum guar): Ủ môi trường RV trong 24 h ± 2 h ở 42 °C ± 0,2 °C (nồi cách thủy tuần hoàn có kiểm soát nhiệt) (5.14); ủ canh thang TT trong 24 h ± 2 h ở 35 °C ± 2,0 °C trong tủ ấm (5.10).

...

...

...

d) Cấy lặp lại với vòng cấy 3 mm (10 µl) canh thang SC (đối với guar gum) hoặc môi trường RV (đối với các nền mẫu khác).

e) Đối với các tùy chọn về tăng sinh sơ bộ mẫu đã ủ được làm lạnh và tăng sinh chọn lọc mẫu đã ủ (riêng đối với các canh thang SC và TT) của thực phẩm có độ ẩm thấp, xem AOAC 994.04.

f) Ủ các đĩa trong 24 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10).

g) Kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc có thể là Salmonella.

8.3  Sàng lọc khuẩn lạc

Kiểm tra các đĩa (xem 8.2) như sau:

a) Hình thái khuẩn lạc Salmonella điển hình

- Thạch HE: khuẩn lạc có màu xanh (từ lục lam đến lam), có hoặc không có tâm đen. Nhiều chủng cấy Salmonella có thể cho khuẩn lạc có tâm lớn, màu đen bỏng hoặc có thể xuất hiện dưới dạng khuẩn lạc đen gần như hoàn toàn. Số ít loài Salmonella sinh khuẩn lạc màu vàng, có hoặc không có tâm màu đen, nhưng không đặc trưng.

- Thạch BS: khuẩn lạc Salmonella điển hình có thể có màu nâu, xám hoặc đen, đôi khi có ánh kim loại. Xung quanh môi trường thường ban đầu có màu nâu, sau một thời gian ủ chuyển màu đen, tạo thành quầng. Một số chủng có thể cho các khuẩn lạc màu xanh lá, môi trường xung quanh hơi sẫm màu hoặc không.

...

...

...

b) Hình thái khuẩn lạc Salmonella không điển hình

Khi không thấy có khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ là Salmonella, tìm các khuẩn lạc Salmonella không điển hình như sau:

- Thạch HE và thạch XLD: Số ít chủng cấy Salmonella không điển hình sinh khuẩn lạc màu vàng, có hoặc không có tâm màu đen trên thạch HE và thạch XLD. Khi không có khuẩn lạc Salmonella điển hình trên thạch HE và thạch XLD sau khi ủ 24 h ± 2 h thì chọn hai hoặc nhiều khuẩn lạc Salmonella không điển hình.

- Thạch BS: Một vài chủng không điển hình sinh các khuẩn lạc màu xanh lá, môi trường xung quanh sẫm màu hoặc không. Nếu không xuất hiện các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ trên thạch BS sau 24 h ± 2 h thì không chọn khuẩn lạc mà ủ lại thêm 24 h ± 2 h. Nếu không xuất hiện các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ sau khi ủ 48 h ± 2 h thì chọn hai hoặc nhiều khuẩn lạc không điển hình.

c) Chủng cấy kiểm chứng được khuyến cáo sử dụng

Cùng với các chủng cấy kiểm chứng dương tính (Salmonella điển hình), ba chủng cấy Salmonella được khuyến cáo sử dụng khi lựa chọn hình hình thái khuẩn lạc Salmonella không điển hình trên các môi trường thạch chọn lọc. Các chủng cấy này là S. diarizonae (ATCC 12325) dương tính với lactose, dương tính với hydro sulfua (H₂S) và S. abortus equi (ATCC 9842) âm tính với lactose, âm tính với hydro sulfua; hoặc S. diarizonae (ATCC 29934) dương tính với lactose, âm tính với hydro sulfua.

CHÚ THÍCH: Các chủng cấy này có thể lấy từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kì, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.

8.4  Cấy chuyển sang thạch nghiêng

a) Chọn hai hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ là Salmonella từ mỗi loại thạch chọn lọc (xem 8.3). Cấy vào thạch TSI (4.8) và thạch LIA (4.9). Nếu các đĩa thạch BS không có khuẩn lạc Salmonella điển hình hoặc nghi ngờ hoặc không thấy có khuẩn lạc mọc thì ủ thêm 24 h. Dùng que cấy vô trùng chạm nhẹ vào chính giữa khuẩn lạc được chọn và ria cấy lên mặt nghiêng thạch TSI, sau đó đâm sâu xuống đáy. Không cần khử trùng que cấy, cấy luôn vào thạch LIA bằng cách đâm sâu xuống đáy thạch hai lần và sau đó ria lên mặt nghiêng. Do phản ứng decarboxyl hóa lysin là yếm khí bắt buộc nên thạch nghiêng LIA phải có phần chân cao 4 cm. Bảo quản các đĩa thạch chọn lọc đã chọn ở nhiệt độ từ 5 °C đến 8 °C.

...

...

...

c) Nếu có mặt các khuẩn lạc điển hình trên thạch BS sau khi ủ 24 h ± 2 h thì chọn hai hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc. Tất cả các đĩa thạch BS đã chọn sau 24 h ± 2 h đều được ủ lại thêm 24 h ± 2 h. Sau khi ủ 48 h ± 2 h, chọn hai hoặc nhiều khuẩn lạc điển hình, nếu có, từ các đĩa thạch BS. Chỉ khi các khuẩn lạc đã chọn từ các đĩa thạch BS sau khi ủ 24 h ± 2 h cho các phản ứng không điển hình trong thạch TSI và LIA thì mới loại bỏ vì đó không phải là Salmonella.

d) Tất cả chủng cấy cho phản ứng kiềm ở chân thạch LIA, chưa kể đến phản ứng ở TSI, đều có khả năng là Salmonella, cần thử tiếp các phản ứng sinh hóa và huyết thanh. Các chủng cấy cho phản ứng axit ở chân thạch LIA, cho phản ứng kiềm trên mặt nghiêng và phản ứng axit ở chân thạch TSI cũng cần được xem xét khả năng là Salmonella và nên thử tiếp các phản ứng sinh hóa và huyết thanh. Các chủng cấy cho phản ứng axit ở chân thạch LIA, cho phản ứng axit trên cả mặt nghiêng và chân thạch TSI không được coi là Salmonella. Các chủng giả định dương tính ở TSI đã giữ lại được thử nghiệm như hướng dẫn dưới đây để khẳng định là Salmonella, bao gồm cả S. arizonae. Nếu trên thạch TSI không thấy phản ứng đặc trưng của Salmonella (phản ứng kiềm trên mặt nghiêng và phản ứng axit ở chân thạch) thì chọn thêm các khuẩn lạc nghi ngờ từ đĩa môi trường chọn lọc cấy vào thạch nghiêng TSI và LIA như mô tả ở trên.

e) Áp dụng các phép thử sinh hóa đối với:

- Ba chủng giả định trên thạch TSI chuyển từ dãy đĩa ria cấy môi trường RV, nếu có, và ba chủng giả định trên thạch TSI chuyển từ dãy đĩa ria cấy môi trường tetrathionat, nếu có.

- Nếu từ một dãy các đĩa thạch không phân lập được ba chủng giả định dương tính trên TSI thì phân lập ba chủng giả định dương tính trên TSI từ dãy các đĩa thạch khác, nếu được, để thử các phản ứng sinh hóa và huyết thanh. Kiểm tra tối thiểu sáu chủng cấy TSI từ mỗi 25 g phần mẫu thử.

8.5  Thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh

8.5.1  Thử nghiệm với chủng chưa cấy thuần

Cấy ria lên thạch TSI (xem 8.4) các khuẩn lạc chưa thuần chủng chọn trên thạch MacConkey (4.22), thạch HE (4.6) hoặc thạch XLD (4.5). Ủ các đĩa 24 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10). Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella trên các loại thạch đĩa chọn lọc như sau:

a) Thạch MacConkey: Khuẩn lạc điển hình trong suốt và không màu, đôi khi có tâm màu sẫm. Các khuẩn lạc Salmonella sẽ làm trong các vùng kết tủa mật đôi khi xuất hiện do sự có mặt các vi sinh vật khác.

...

...

...

c) Thạch XLD: Xem quy trình nêu trong điểm a của 8.3.

Chuyển ít nhất hai khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella vào mặt nghiêng thạch TSI và LIA như mô tả ở trên và tiếp tục như trong 8.4.

8.5.2  Thử nghiệm với chủng cấy thuần

a) Phép thử urease (phép thử thông thường)

Dùng que cấy vô trùng, lấy vi khuẩn trên mặt nghiêng của thạch TSI dương tính giả định (xem 8.4) cấy vào các ống canh thang ure (4.14). Hiếm khi các ống canh thang ure chưa cấy có màu đỏ tía bền (như kết quả dương tính), do đó các ống chưa cấy canh thang này được dùng làm kiểm chứng. Ủ 24 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10).

b) Phép thử urease tùy chọn (phép thử nhanh)

Chuyển hai vòng cấy 3 mm từ mỗi chủng cấy trên mặt nghiêng thạch TSI dương tính giả định (xem 8.4) vào các ống canh thang ure thử nhanh (4.15). Ủ 2 h ở 37 °C ± 0,5 °C trong nồi cách thủy. Loại bỏ tất cả chủng cấy cho phản ứng dương tính. Giữ lại để xem xét thêm tất cả chủng cấy cho phản ứng âm tính (không đổi màu môi trường).

8.5.3  Phép thử ngưng kết kháng huyết thanh lông (H) đa giá

a) Thực hiện phép thử ngưng kết kháng huyết thanh đa giá tại điểm này hoặc muộn hơn như mô tả dưới đây. Cấy vi sinh vật phát triển từ mặt nghiêng thạch TSI âm tính urease (xem 8.5.2) vào một trong hai môi trường sau:

...

...

...

- Canh thang trypticase đậu tương-tryptose (4.11) và ủ 24 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10) (để thử nghiệm trong ngày hôm sau).

Thêm 2,5 ml nước muối sinh lý formalin (4.34) vào 5 ml của mỗi dịch cấy.

b) Từ canh thang formalin, chọn hai chủng cấy và thử với kháng huyết thanh ngưng kết đa giá Salmonella (H) (4.37). Cho 0,5 ml kháng huyết thanh ngưng kết đa giá Salmonella đã pha loãng thích hợp vào các ống huyết thanh 10 mm x 75 mm hoặc 13 mm x 100 mm (5.19). Thêm 0,5 ml kháng nguyên cần thử. Chuẩn bị nước muối kiểm chứng bằng cách trộn 0,5 ml nước muối sinh lý formalin (4.34) với 0,5 ml kháng nguyên formalin. Ủ các hỗn hợp ở nhiệt độ từ 48 °C đến 50 °C trong nồi cách thủy (5.12). Quan sát sau từng khoảng 15 min và đọc kết quả cuối cùng trong 1 h.

Dương tính: ngưng kết trong ống kháng huyết thanh thử nghiệm nhưng không ngưng kết trong ống kiểm chứng.

Âm tính: không ngưng kết cả trong ống kháng huyết thanh thử nghiệm và ống kiểm chứng.

Không đặc hiệu: ngưng kết cả trong ống kháng huyết thanh thử nghiệm và ống kiểm chứng. Tiếp tục thử nghiệm các chủng cấy cho các kết quả nêu trên với kháng huyết thanh Spicer-Edwards theo 8.5.4.

8.5.4  Phép thử huyết thanh Spicer-Edwards

Sử dụng phép thử này thay thế cho phép thử ngưng kết (H) đa giá (8.5.3). Phép thử này cũng được sử dụng cho các chủng cấy ngưng kết không đặc hiệu trong phép thử ngưng kết kháng huyết thanh (H) đa giá. Thực hiện phép thử kháng huyết thanh ngưng kết Spicer-Edwards (H) (4.39) như mô tả ở trên. Thực hiện các phép thử sinh hóa bổ sung (8.5.6.2) với các chủng cấy cho kết quả thử ngưng kết (H) dương tính như mô tả ở dưới. Nếu cả hai dịch cấy đã formalin hóa đều âm tính thì thực hiện phép thử huyết thanh với bốn chủng bổ sung cấy trong canh thang (như trên). Nếu có thể, thu lấy hai chủng cấy dương tính để thử nghiệm sinh hóa. Nếu các chủng cấy trên TSI âm tính urease mà cho kết quả âm tính trong phép thử ngưng kết huyết thanh (H) thì cũng cần thực hiện các phép thử sinh hóa bổ sung.

8.5.5  Thử nghiệm chất cấy âm tính urease

...

...

...

Nếu phép thử LIA đáp ứng thì không cần lặp lại phép thử này.

Sử dụng canh thang lysin decarboxylase (4.17) trong phép xác định cuối cùng của lysin decarboxylase nếu chủng cấy cho phản ứng còn nghi ngờ trên LIA. Cấy vào canh thang một lượng nhỏ vi sinh vật phát triển trên mặt nghiêng của thạch TSI nghi ngờ là Salmonella (xem 8.5.2). Vặn chặt nắp và ủ 48 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10), kiểm tra sau mỗi 24 h. Các loài Salmonella gây phản ứng kiềm làm cho môi trường chuyển màu đỏ tía (phản ứng dương tính). Nếu phép thử âm tính, môi trường chuyển màu vàng. Nếu môi trường bị mất màu (không vàng cũng không đỏ tía) thì thêm vài giọt thuốc nhuộm bromcresol đỏ tía 0,2 % (4.30) và đọc lại phản ứng trong ống.

b) Canh thang phenol đỏ dulcitol hoặc canh thang đỏ tía cơ bản có 0,5 % dulcitol

Ủ canh thang phenol đỏ dulcitol (4.20) hoặc canh thang đỏ tía (4.21) một lượng nhỏ vi sinh vật phát triển trên thạch TSI (xem 8.4). Nới lỏng nắp và ủ 48 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10), có kiểm tra sau 24 h. Hầu hết các loài Salmonella cho phản ứng dương tính, được chỉ thị bởi việc sinh khí trong ống Durham và pH axit (môi trường chuyển màu vàng). Phép thử âm tính được chỉ thị bởi việc không sinh khí trong ống Durham và màu đỏ (với chất chỉ thị phenol đỏ) hoặc đỏ tía (với chất chỉ thị bromcresol đỏ tía) trên toàn bộ môi trường.

c) Canh thang trypton (hoặc tryptophan)

Cấy vào canh thang trypton (hoặc tryptophan) (4.10) một lượng nhỏ vi sinh vật phát triển trên thạch TSI (xem 8.4). Ủ 24 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10) và tiến hành các thử nghiệm sau:

1) Khả năng phát triển trong canh thang kali xyanua (4.19): Chuyển một vòng cấy 3 mm (5.18) canh thang tryptophan đã cấy vi khuẩn sau 24 h vào canh thang KCN. Hơ nóng miệng ống sao cho ống được bịt kín khi đậy bằng nút bần phủ sáp. Ủ 48 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10) kiểm tra sau mỗi 24 h. Vi sinh vật phát triển (làm đục môi trường) được coi là dương tính. Hầu hết các loài Salmonella không sinh trưởng trong môi trường này, biểu hiện qua việc không làm đục môi trường.

2) Sử dụng canh thang malonat (4.16): Chuyển một vòng cấy 3 mm (5.18) canh thang tryptophan đã cấy vi khuẩn sau 24 h vào canh thang malonat. Hiếm khi các ống canh thang malonat chưa cấy cho màu xanh lam bền (như phép thử dương tính), do đó các ống canh thang chưa cấy này được dùng làm kiểm chứng. Ủ 48 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10), kiểm tra sau 24 h. Hầu hết các loài Salmonella cho phản ứng âm tính trên canh thang này (màu xanh lá hoặc không đổi màu).

3) Phép thử indol: Chuyển 5 ml canh thang tryptophan đã cấy vi khuẩn 24 h vào ống nghiệm. Thêm từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs (4.26). Hầu hết các chủng cấy Salmonella cho phản ứng âm tính (không có màu đỏ đậm trên bề mặt canh thang). Màu sắc trung gian, sự chuyển màu da cam và hồng không ổn định được báo cáo kết quả là ±.

...

...

...

5) Loại bỏ tất cả các chủng cấy không phải Salmonella vừa dương tính với phép thử indol vừa âm tính với phép thử ngưng kết kháng huyết thanh (H), hoặc vừa dương tính với phép thử KCN vừa âm tính với phép thử lysin decarboxylase.

8.5.6  Phép thử ngưng kết huyết thanh thân (O) đối với Salmonella

Chú ý: Kiểm tra trước tất cả kháng huyết thanh Salmonella với các chủng cấy đã biết.

8.5.6.1  Phép thử kháng huyết thanh thân (O) đa giá

Dùng chì sáp để đánh dấu hai phần khoảng 1 cm x 2 cm ở hai phía đĩa Petri (15 mm x 100 mm) bằng thủy tinh hoặc chất dẻo (5.16). Có thể sử dụng các lam kính bán sẵn. Nhũ hóa một vòng cấy 3 mm vi khuẩn cấy trên mặt nghiêng thạch TSI đã ủ từ 24 h đến 48 h hoặc tốt nhất là cấy trên thạch máu tryptose cơ bản (chưa bổ sung máu) (4.24) với 2 ml nước muối 0,85 % (4.33). Nhỏ một giọt huyền phù vi khuẩn lên phần trên của mỗi ô hình chữ nhật đã đánh dấu bằng chì sáp. Nhỏ tiếp một giọt nước muối vào phía dưới của một ô và một giọt kháng huyết thanh thân (O) Salmonella đa giá (4.36) vào phần còn lại. Dùng que cấy vô trùng để trộn huyền phù vi khuẩn với nước muối ở ô thứ nhất và lặp lại với ô nhỏ kháng huyết thanh. Chao nghiêng hỗn dịch trong 1 min và quan sát trên nền tối được chiếu sáng tốt. Phân loại kết quả thử ngưng kết kháng huyết thanh thân (O) đa giá như sau:

Dương tính: ngưng kết trong các hỗn dịch thử nghiệm và không ngưng kết trong nước muối kiểm chứng.

Âm tính: không ngưng kết cả trong các hỗn dịch thử nghiệm và nước muối kiểm chứng.

Không đặc hiệu: ngưng kết cả trong hỗn dịch thử nghiệm và mẫu kiểm chứng, cần thực hiện các phép thử huyết thanh và sinh hóa tiếp theo.

8.5.6.2  Thử nghiệm kháng huyết thanh đơn giá nhóm (O)

...

...

...

Xác định các chủng cấy là Salmonella với các phản ứng Salmonella điển hình từ phép thử số 1 đến 11, trong Bảng 2. Nếu một chủng cấy trên TSI từ 25 g mẫu thử được xác định là Salmonella thì không cần thử các chủng cấy trên TSI khác từ cùng một mẫu thử. Nếu chủng cấy được chứng minh là mang kháng nguyên Salmonella qua phép thử ngưng kết (H) Salmonella dương tính nhưng không có các đặc tính sinh hóa của Salmonella thì cần được thuần nhất và thử nghiệm lại.

Bảng 2 - Tổng hợp các phản ứng sinh hóa và huyết thanh của Salmonella

Phép thử hoặc cơ chất

Dương tính

Âm tính

Các phản ứng^a)

1. Glucose (TSl)

Chân thạch màu vàng

Chân thạch màu đỏ

...

...

...

2. Lysin decarboxylase (LIA)

Chân thạch màu đỏ tía

Chân thạch màu vàng

+

3. Hydro sulfua (TSI và LIA)

Có màu đen

Không có màu đen

+

4. Urease

...

...

...

Không đổi màu

-

5. Canh thang lysin decarboxylase

Màu đỏ tía

Màu vàng

+

6. Canh thang phenol đỏ dulcitol

Màu vàng và/hoặc sinh khí

Không sinh khí; không đổi màu

...

...

...

7. Canh thang KCN

Vi sinh vật phát triển

Vi sinh vật không phát triển

-

8. Canh thang malonat

Màu xanh lam trên bề mặt

Không đổi màu

- ^c

9. Phép thử indol

...

...

...

Màu vàng trên bề mặt

-

10. Phép thử ngưng kết đa giá

Ngưng kết

Không ngưng kết

+

11. Phép thử tế bào đa giá

Ngưng kết

Không ngưng kết

...

...

...

12. Canh thang phenol đỏ lactose

Màu vàng và/hoặc sinh khí

Không sinh khí; không đổi màu

- ^c

13. Canh thang phenol đỏ sacarose

Màu vàng và/hoặc sinh khí

Không sinh khí; không đổi màu

-

14. Phép thử Voges- Proskauer

...

...

...

không đổi màu

-

15. Phép thử metyl đỏ

Màu đỏ phai

Màu vàng phai

+

16. Thạch xitrat Simmons

Vi sinh vật phát triển; màu xanh lam

Vi sinh vật không phát triển; không đổi màu

...

...

...

^a) (+) là ≥ 90 % dương tính trong 1 ngày hoặc 2 ngày; (-) là ≥ 90 % âm tính trong 1 ngày hoặc 2 ngày; (v) là thay đổi.

^b) Phần lớn chủng cấy S. arizonae âm tính.

^c) Phần lớn chủng cấy S. arizonae dương tính.

8.6  Thử nghiệm khuẩn lạc Salmonella không điển hình

Thực hiện các phép thử sinh hóa bổ sung sau đây trên các chủng cấy không cho các phản ứng Salmonella điển hình đối với phép thử số 1 đến 11 trong Bảng 2, và cũng không được phân loại là Salmonella (xem Bảng 3).

a) Canh thang phenol đỏ lactose hoặc canh thang đỏ tía lactose

1) Cấy vào canh thang phenol đỏ lactose (4.20) hoặc canh thang đỏ tía lactose (4.21) một lượng nhỏ vi khuẩn phát triển trên mặt nghiêng của thạch TSI từ 14 h đến 48 h. Ủ 48 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10), kiểm tra sau mỗi 24 h. Dương tính: sinh axit (màu vàng) và sinh khí trong ống Durham. Nếu chỉ sinh axit cũng được coi là phản ứng dương tính. Hầu hết các chủng cấy Salmonella cho kết quả âm tính, được chỉ thị bởi việc không sinh khí trong ống Durham và đổi màu môi trường thành màu đỏ (chất chỉ thị phenol đỏ) hoặc màu đỏ tía (chất chỉ thị bromcresol đỏ tía).

2) Loại bỏ các chủng cấy không phải Salmonella (dương tính với các phép thử lactose), ngoại trừ các chủng cấy sinh axit trên mặt nghiêng của TSI và có phản ứng dương tính trong LIA hoặc các chủng cấy cho các phản ứng dương tính với canh thang malonat. Thực hiện các phép thử tiếp theo trên các chủng cấy để xác định có phải là S. arizonae.

b) Canh thang phenol đỏ sacarose (4.20) hoặc canh thang đỏ tía sacarose (4.21)

...

...

...

c) Canh thang MR-VP

Cấy vào môi trường MR-VP (4.12) một lượng nhỏ vi sinh vật phát triển trên mặt nghiêng của TSI chưa được xác định, nghi ngờ có Salmonella. Ủ 48 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10).

1) Thực hiện phép thử Voges-Proskauer (VP) ở nhiệt độ phòng như sau: Chuyển 1 ml chủng cấy 48 h vào ống nghiệm và ủ phần còn lại của canh thang MR-VP thêm 48 h ở 35 °C. Thêm 0,6 ml naphthol (4.27) và lắc đều. Tiếp tục thêm 0,2 ml dung dịch kali hydroxit 40 % (4.29) và lắc đều. Để tăng nồng độ và tăng tốc độ phản ứng, thêm vài tinh thể creatin (4.28). Đọc kết quả sau 4 h; Nếu môi trường chuyển màu đỏ hồng ruby là phản ứng dương tính. Hầu hết chủng cấy Salmonella âm tính VP (môi trường không chuyển màu).

2) Thực hiện phép thử metyl đỏ như sau: cho 5 ml canh thang 96 h MR-VP, thêm 5 đến 6 giọt chất chỉ thị metyl đỏ (4.31). Đọc kết quả ngay. Hầu hết chủng cấy Salmonella cho kết quả dương tính, cho thấy bởi màu đỏ phai trong môi trường. Phản ứng âm tính có màu vàng đặc trưng. Loại bỏ các chủng cấy không phải Salmonella (có các phản ứng KCN và VP dương tính và phản ứng metyl đỏ âm tính).

Bảng 3 - Các tiêu chí để loại bỏ các chủng cấy không phải Salmonella

Phép thử hoặc cơ chất

Kết quả

1. Urease

dương tính (màu đỏ tía)

...

...

...

dương tính (màu tím trên bề mặt)
âm tính (không ngưng kết)

3. Canh thang lysin decarboxylase KCN

âm tính (màu vàng)
dương tính (vi sinh vật phát triển)

4. Canh thang phenol đỏ lactose

dương tính (màu vàng và/hoặc sinh khí) ^a,^b

5. Canh thang phenol đỏ sacarose

dương tính (màu vàng và/hoặc sinh khí)^b

6. Canh thang KCN, phép thử Voges-Proskauer, phép thử metyl đỏ

dương tính (Vi sinh vật phát triển)
dương tính (màu hồng đến đỏ)
âm tính (màu vàng phai)

...

...

...

^b Không bỏ các chủng cấy canh thang dương tính nếu các chủng cấy LIA tương ứng cho các phản ứng Salmonella điển hình; thử tiếp để xác định có phải là các loài Salmonella

d) Thạch xitrat Simmons

Ria cấy trên mặt nghiêng và cấy đâm sâu vào thạch xitrat Simmons (4.13) vi khuẩn phát triển trên mặt nghiêng của thạch TSI chưa xác định. Ủ 96 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10). Đọc kết quả như sau:

Dương tính: có vi sinh vật phát triển, thường kèm theo sự thay đổi từ màu xanh lá sang màu xanh lam. Hầu hết chủng cấy Salmonella dương tính xitrat.

Âm tính: không có vi sinh vật phát triển hoặc có rất ít vi sinh vật phát triển nhưng không đổi màu.

8.7  Phương pháp thay thế xác định Salmonella

Phương pháp thay thế cho cách thử các phản ứng sinh hóa thông thường, dùng một trong năm kit sinh hóa thương mại (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II, MICRO-ID hoặc Vitek GNI) để nhận diện Salmonella giả định. Lựa chọn kit thương mại phù hợp với các tính chất sinh hóa trong phần nhận diện.

Các kit sinh hóa thương mại không được sử dụng để thay thế các phép thử huyết thanh.

Lắp ráp các bộ phận của thiết bị và chuẩn bị thuốc thử cần cho bộ kít. Cấy từng đơn vị theo AOAC 978.24 (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II), AOAC 989.12 (MICRO-ID), AOAC 991.13 (Vitek GNI), ủ trong thời gian và nhiệt độ quy định. Bổ sung thuốc thử, quan sát và ghi kết quả. Đối với việc nhận diện vi sinh vật giả định, phân loại chủng cấy, thực hiện theo AOAC là Salmonella hoặc không phải Salmonella.

...

...

...

a) Báo cáo các chủng cấy là Salmonella được khẳng định từ Salmonella giả định bằng các kit sinh hóa thương mại nếu chủng cấy dương tính với phép thử ngưng kết kháng huyết thanh (O) Salmonella và phép thử (H) Salmonella.

b) Loại bỏ các chủng cấy giả định không phải là Salmonella bằng các kit sinh hóa thương mại nếu chủng cấy phù hợp với các tiêu chí AOAC về chủng cấy không phải Salmonella.

c) Đối với chủng cấy không phù hợp với a hoặc b, phân loại theo các phép thử bổ sung (8.6) hoặc gửi đến phòng thử nghiệm để xác định typ huyết thanh và nhận diện.

8.8  Xử lý các chủng cấy âm tính với phép thử ngưng kết kháng huyết thanh lông (H)

Nếu chủng cấy có các tính chất sinh hóa phù hợp với Salmonella nhưng cho kết quả ngưng kết với kháng huyết thanh (H) âm tính (xem 8.5.3) có thể là do các chủng này không di động hoặc các kháng nguyên lông phát triển không trọn vẹn. Tiến hành kiểm tra như sau: Đổ môi trường thử tính di động (4.18) vào đĩa Petri (5.16). Dùng que cấy lấy một lượng nhỏ vi khuẩn phát triển trên mặt nghiêng thạch TSI cấy đâm sâu lên đĩa môi trường, cách cạnh đĩa khoảng 10 mm, sâu từ 2 mm đến 3 mm. Không cấy chạm đến đáy đĩa hoặc ở vị trí khác. Ủ 24 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10).

Nếu thấy vi khuẩn di chuyển 40 mm hoặc lớn hơn thì thử nghiệm lại như sau: Chuyển một vòng cấy vi khuẩn đã di chuyển xa nhất vào canh thang trypticase đậu tương-tryptose (4.11). Lặp lại phép thử ngưng kết (H) đa giá hoặc phép thử huyết thanh Spicer-Edwards. Nếu các chủng cấy không di động sau 24 h đầu thì ủ thêm 24 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10); Nếu vẫn không di động thì ủ tiếp 5 ngày ở 25 °C. Kết luận chủng cấy không di động nếu các phép thử trên vẫn cho kết quả âm tính.

9  Biểu thị kết quả

Theo các kết quả diễn giải (xem 8.6, 8.7 hoặc 8.8), chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt của Salmonella trong 25 g phần mẫu thử.

10  Báo cáo thử nghiệm

...

...

...

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị môi trường cấy và thuốc thử

...

...

...

A.1.1  Thành phần

Chất chiết thịt bò

3 g

Pepton

5 g

Lactose

5 g

Nước cất

1 lít

...

...

...

Phân phối các phần 225 ml vào các bình nón 500 ml. Sau khi hấp áp lực ở 121 °C trong 15 min và ngay trước khi sử dụng, chỉnh vô trùng đến thể tích 225 ml. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

A.2  Canh thang selenit cystin

A.2.1  Môi trường 1

A.2.1.1  Thành phần

Tryptone hoặc polypepton

5 g

Lactose

4 g

Natri hydro selenit (NaHSeO₃)

...

...

...

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

10 g

L-Cystin

0,01 g

Nước cất

1 lít

A.2.1.2  Chuẩn bị

Đun đến sôi để hòa tan. Phân phối các phần 10 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm vô trùng. Đun 10 min trong hơi nước (flowing steam). Không hấp áp lực. pH cuối cùng đạt 7,0 ± 0,2. Không khử trùng môi trường này. Sử dụng trong ngày chuẩn bị.

A.2.2  Môi trường 2 (North-Bartram điều chỉnh)

...

...

...

Polypepton

5 g

Lactose

4 g

Natri hydro selenit (NaHSeO₃)

4 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

5,5 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

...

...

...

L-Cystin

0,01 g

Nước cất

1 lít

A.2.2.2  Chuẩn bị

Gia nhiệt có khuấy để hòa tan. Phân phối các phần 10 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm vô trùng. Gia nhiệt 10 min trong hơi nước. Không khử trùng môi trường này. Sử dụng trong ngày chuẩn bị.

A.3  Canh thang tetrathionat

A.3.1  Thành phần

Polypepton

...

...

...

Các muối mật

1 g

Canxi cacbonat

10 g

Natri thiosulfat ngậm năm phân tử nước

30 g

Nước cất

1 lít

A.3.2  Chuẩn bị

...

...

...

A.4  Môi trường Rappaport-Vassiliadis

A.4.1  Thành phần

a) Canh thang cơ bản

Tryptone

5 g

Natri clorua (NaCI)

8 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

1,6 g

...

...

...

1 lít

b) Dung dịch magie clorua:

Magie clorua ngậm sáu phân tử nước (MgCI₂·6H₂O)

400 g

Nước cất

1 lít

c) Dung dịch malachite green oxalat:

Malachite green oxalat

0,4 g

...

...

...

100 ml

A.4.2  Chuẩn bị

Để chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh, gộp 1000 ml canh thang, 100 ml Dung dịch magie clorua và 10 ml Dung dịch malachite green oxalat (tổng thể tích môi trường hoàn chỉnh là 1110 ml). Canh thang cơ bản phải được chuẩn bị cùng ngày với các thành phần cấu tạo nên môi trường hoàn chỉnh. Dung dịch magie clorua có thể bảo quản trong tối ở nhiệt độ phòng được 1 năm. Để chuẩn bị dung dịch này, hòa tan hoàn toàn lượng MgCI₂.6H20 từ vật chứa mới mở nắp dựa theo công thức, bởi vì loại muối này rất hút ẩm. Dung dịch malachite green oxalat có thể bảo quản trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng đến 6 tháng. Phân phối các thể tích 10 ml môi trường hoàn chỉnh vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 115 °C. pH cuối cùng đạt 5,5 ± 0,2. Bảo quản trong tủ lạnh và dùng trong 1 tháng.

Môi trường này phải chuẩn bị từ các thành phần riêng lẻ. Không nên sử dụng môi trường khô bán sẵn. Người sử dụng môi trường này cần nhận thức rõ công thức và nhiệt độ ủ môi trường này khác với hướng dẫn của tiêu chuẩn này.

A.5  Thạch xylose lysin desoxycholat (XLD)

A.5.1  Thành phần

Chất chiết nấm men

3 g

Sắt (III) amoni xitrat

...

...

...

L-lysin

5 g

Natri thiosulfat

6,8 g

Xylose

3,75 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Lactose

...

...

...

Thạch

15 g

Sacarose

7,5 g

Phenol đỏ

0,08 g

Natri desoxycholat

2,5 g

Nước cất

...

...

...

A.5.2  Chuẩn bị

Gia nhiệt có khuấy ngay đến khi sôi ở mức độ trung bình. Không để quá nhiệt. Rót vào các đĩa khi môi trường nguội đến 50 °C. Để khô trong khoảng 2 h, mở hé nắp. Sau đó đậy nắp. pH cuối cùng 7,4 ± 0,2. Không bảo quản quá 1 ngày.

A.6  Thạch Hektoen Enteric (HE)

A.6.1  Thành phần

Pepton

12 g

Natri thiosulfat

5 g

Chất chiết nấm men

...

...

...

Sắt (III) amoni xitrat

1,5 g

Muối mật

9 g

Bromthymol xanh

0,064 g

Lactose

12 g

Fuchsin axit

...

...

...

Sacarose

12 g

Thạch

13,5 g

Salicin

2 g

Nước cất

1 lít

Natri clorua (NaCI)

...

...

...

A.6.2  Chuẩn bị

Đun đến sôi, khuấy liên tục để hòa tan. Để sôi không quá 1 min. Không để quá nhiệt. Để nguội trong nồi cách thủy. Rót các phần 20 ml vào các đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Để khô trong khoảng 2h, mở hé nắp. pH cuối cùng 7,6 ± 0,2. Không bảo quản quá 1 ngày.

A.7  Thạch bismuth sulfit (Wilson and Blair)

A.7.1  Thành phần

Polypepton (hoặc pepton)

10 g

Chất chiết thịt bò

5 g

Dextrose

...

...

...

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄) (dạng khan)

4 g

FeSO4 (dạng khan)

0,3 g

Bismuth sulfit (chất chỉ thị)

8 g

Brilliant green

0,025 g

Thạch

...

...

...

Nước cất

1 lít

A.7.2  Chuẩn bị

Trộn kỹ và đun có khuấy. Để sôi khoảng 1 min đến khi thu được huyền phù đồng nhất (nếu kết lắng sẽ không hòa tan). Để nguội đến nhiệt độ từ 45 °C đến 50 °C. Tạo huyền phù phần kết lắng bằng cách khuấy nhẹ và rót các phần 20 ml vào các đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Để các đĩa khô trong khoảng 2 min, có mở hé nắp, sau đó đậy các đĩa. pH cuối cùng đạt 7,7 ± 0,2. Không hấp áp lực. Chuẩn bị các đĩa một ngày trước khi cấy ria và bảo quản trong tối. Độ chọn lọc giảm trong 48 h. Bảo quản các đĩa nơi tối.

A.8  Thạch sắt ba đường (TSI)

A.8.1  Môi trường

Môi trường 1

Polypepton

...

...

...

Natri clorua (NaCI)

5 g

Lactose

10 g

Sacarose

10 g

Glucose

1 g

Fe(NH₄)₂(SO₄)·6H₂O

...

...

...

Na₂S₂O₃

0,2 g

Phenol đỏ

0,025 g

Thạch

13 g

Nước cất

1 lít

Môi trường 2

...

...

...

Chất chiết thịt bò

3 g

Chất chiết nấm men

3 g

Pepton

15 g

Proteose pepton

5 g

Glucose

...

...

...

Lactose

10 g

Sacarose

10 g

Sắt (II) sulfat (FeSO₄)

0,2 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Na₂S₂O₃

...

...

...

Phenol đỏ

0,024 g

Thạch

12 g

Nước cất

1 lít

Hai môi trường này nói chung có thể thay thế nhau.

A.8.2  Chuẩn bị

Tạo huyền phù các thành phần của Môi trường 1 trong nước cất, trộn kỹ và gia nhiệt, thỉnh thoảng có khuấy. Để sôi khoảng 1 min cho hòa tan các thành phần. Cho vào 1/3 các ống 16 mm x 150 mm và đậy nắp hoặc nút lại để duy trì các điều kiện hiếu khí. Hấp áp lực Môi trường 1 trong 15 min ở 118 °C. Chuẩn bị Môi trường 2 như đối với Môi trường 1, nhưng không hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Trước khi môi trường đông đặc, nghiêng các ống để có các bề mặt nghiêng từ 4 cm đến 5 cm và độ sâu từ 2 cm đến 3 cm. pH cuối cùng đạt 7,3 ± 0,2 đối với Môi trường 1 và 7,4 ± 0.2 đối với Môi trường 2.

...

...

...

A.9.1  Thành phần

Gelysate hoặc pepton

5 g

Chất chiết nấm men

3 g

Dextrose

1 g

L-Lysin hydroclorua

10 g

...

...

...

0,5 g

Natri thiosulfat (dạng khan)

0,04 g

Bromcresol tía

0,02 g

Thạch

15 g

Nước cất

1 lít

...

...

...

Gia nhiệt để hòa tan các thành phần. Phân phối các phần 4 ml vào các ống nắp xoáy 13 mm x 100 mm. Hấp áp lực 12 min ở 121 °C. Để cho đông đặc ở vị trí nghiêng để tạo thành các đáy 4 cm và bề mặt nghiêng 2,5 cm. pH cuối cùng đạt 6,7 ± 0,2.

A.10  Canh thang trypton (tryptophan), 1 %

A.10.1  Thành phần

Tryptone hoặc trypticase

10 g

Nước cất

1 lít

A.10.2  Chuẩn bị

Phân phối các phần 5 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 125 mm hoặc 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

...

...

...

A.11.1  Thành phần

Canh thang trypticase đậu tương (loại khô, bán sẵn)

15 g

Canh thang tryptose (loại khô, bán sẵn)

13,5 g

Chất chiết nấm men

3 g

Nước cất

1 lít

...

...

...

Hòa tan các thành phần trong 1 lít nước. Đun nhẹ để hòa tan. Phân phối các phần 5 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,2 ± 0,2.

A.12  Canh thang MR-VP

A.12.1  Môi trường 1

A.12.1.1  Thành phần

Bột nước đệm pepton

7 g

Glucose

5 g

Kali hydro phosphat (K₂HPO₄)

...

...

...

Nước cất

1 lít

A.12.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong 800 ml nước có đun nhẹ. Lọc và để nguội đến 20 °C và pha loãng đến 1 lít. Hấp áp lực từ 12 min đến 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

A.12.2  Môi trường 2

A.12.2.1  Thành phần

Pepton casein

3,5 g

Pepton thịt

...

...

...

Dextrose

5 g

Kali phosphat

5 g

Nước cất

1 lít

A.12.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước có đun nhẹ nếu cần. Phân phối 10 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm và hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ từ 118 °C đến 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

A.12.3  Môi trường 3

...

...

...

Pepton

5 g

Glucose

5 g

Đệm phosphat

5 g

Nước cất

1 lít

A.12.3.2  Chuẩn bị

...

...

...

A.13  Thạch xitrat Simmons

A.13.1  Thành phần

Natri xitrat ngậm hai phân tử nước

2g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Kali hydro phosphat (K₂HPO₄)

1 g

Amoni dihydro phosphat (NH₄H₂PO₄)

...

...

...

Magie sulfat (MgSO₄)

0,2 g

Bromthymol xanh

0,08 g

Thạch

15 g

Nước cất

1 lít

A.13.2  Chuẩn bị

...

...

...

A.14  Canh thang ure

A.14.1  Thành phần

Ure

20 g

Chất chiết nấm men

0,1 g

Kali hydro phosphat (K₂HPO₄)

9,1 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

...

...

...

Phenol đỏ

0,01 g

Nước cất

1 lít

A.14.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước cất. Không gia nhiệt. Khử trùng bằng cách lọc qua màng 0,45 µm. Phân phối vô trùng các phần từ 1,5 ml đến 3,0 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm vô trùng. pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2.

A.15  Canh thang ure (chuẩn bị nhanh)

A.15.1  Thành phần

Ure

...

...

...

Chất chiết nấm men

0,1 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

0,091 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

0,095 g

Phenol đỏ

0,01 g

Nước cất

...

...

...

A.15.2  Chuẩn bị

Chuẩn bị như Canh thang ure (A.14).

A.16  Canh thang malonat

A.16.1  Thành phần

Chất chiết nấm men

1 g

Amoni sulfat [(NH₄)₂SO₄]

2 g

Kali hydro phosphat (K₂HPO₄)

...

...

...

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

0,4 g

Natri clorua (NaCI)

2 g

Natri malonat

3 g

Dextrose

0,25 g

Bromthymol xanh

...

...

...

Nước cất

1 lít

A.16.2  Chuẩn bị

Đun để hòa tan, nếu cần. Phân phối các phần 3 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,7 ± 0,2.

A.17  Canh thang lysin decarboxylase (Falkow)

A.17.1  Thành phần

Gelysate hoặc pepton

5 g

Chất chiết nấm men

...

...

...

Glucose

1 g

L-Lysin

5 g

Bromcresol tía

0,02 g

Nước cất

1 lít

A.17.2  Chuẩn bị

...

...

...

A.18  Môi trường thử nghiệm tính di động (bán đặc)

A.18.1  Thành phần

Chất chiết thịt bò

3 g

Pepton hoặc gelysate

10 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Thạch

...

...

...

Nước cất

1 lít

A.18.2  Chuẩn bị

Gia nhiệt đồng thời khuấy và đun sôi 1-2 min để hòa tan thạch. Phân phối các phần 20 ml vào các ống nắp xoáy 20 mm x 150 mm, thay bằng nắp lỏng. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Để nguội đến 45 °C sau khi hấp áp lực. Vặn chặt nắp và bảo quản lạnh ở nhiệt độ từ 5 °C đến 8°C. Để sử dụng, làm tan chảy trong nước sôi hoặc dòng hơi nước rồi để nguội đến 45 °C. Phân phối vô trùng các phần 20 ml vào các đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Đậy các đĩa và để cho đông đặc. Sử dụng trong ngày chuẩn bị. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2.

A.19  Canh thang kali xyanua (KCN)

A.19.1  Thành phần

Kali xyanua

0,075 g

Proteose pepton No. 3 hoặc polypepton

...

...

...

Natri clorua (NaCI)

5 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

0,225 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

5,64 g

Nước cất

1 lít

A.19.2  Chuẩn bị

...

...

...

Trộn và phân phối vô trùng các phần từ 1,0 ml đến 1,5 ml vào các ống 13 mm x 100 mm vô trùng. Dùng kỹ thuật vô trùng, nút các ống bằng nút bần No. 2 có tẩm parafin. Chuẩn bị nút bần bằng cách đun sôi trong parafin khoảng 5 min. Nút các ống bằng nút bần sao cho parafin không chảy vào canh thang mà tạo thành lớp xi giữa miệng ống và nút bần. Bảo quản ống ở nhiệt độ từ 5 °C đến 8 °C không quá 2 tuần trước khi sử dụng.

A.20  Canh thang cacbohydrat phenol đỏ

A.20.1  Thành phần

Trypticase hoặc proteose pepton No. 3

10 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Chất chiết thịt bò (tùy chọn)

1 g

...

...

...

0,018 g

Nước cất

1 lít

Cacbohydrat, sử dụng một trong ba loại đường sau:

Dulcitol

5 g

Lactose

10 g

Sacarose

...

...

...

A.20.2  Chuẩn bị

Hòa tan cacbohydrat vào canh thang cơ bản này. Phân phối các phần 2,5 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa các ống Durham. Hấp áp lực 10 min ở 118 °C. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. Cách khác, hòa tan các thành phần, ngoại trừ cacbohydrat, trong 800 ml nước cất có đun và thỉnh thoảng khuấy. Phân phối các phần 2,0 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa các ống lên men đã úp ngược. Hấp áp lực 15 min ở 118 °C và để nguội. Hòa tan cacbohydrat trong 200 ml nước cất và khử trùng bằng cách cho dung dịch qua bộ lọc vi khuẩn. Thêm vô trùng 0,5 ml dịch lọc vào mỗi ống canh thang đã khử trùng sau khi làm nguội đến 45 °C. Lắc nhẹ để trộn. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2.

A.21  Canh thang cacbohydrat đỏ tía

A.21.1  Thành phần

Proteose pepton No. 3

10 g

Chất chiết thịt bò (tùy chọn)

1 g

Natri clorua (NaCI)

...

...

...

Bromcresol tía

0,02 g

Nước cất

1 lít

A.21.2  Chuẩn bị

Chuẩn bị như đối với canh thang phenol đỏ cacbohydrat (A.20). pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2.

A.22  Thạch MacConkey

A.22.1  Thành phần

Proteose pepton hoặc polypepton

...

...

...

Pepton hoặc gelysate

17 g

Lactose

10 g

Các muối mật No. 3 (hoặc hỗn hợp các muối mật):

1,5 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Đỏ trung tính

...

...

...

Tím tinh thể

0,001 g

Thạch

13,5 g

Nước cất

1 lít

A.22.2  Chuẩn bị

Tạo huyền phù các thành phần và đun có khuấy để hòa tan. Để sôi trong từ 1 min đến 2 min. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C, để nguội đến nhiệt độ từ 45°C đến 50 °C, và rót các phần 20 ml vào các đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Để khô ở nhiệt độ phòng, có đậy nắp. Không dùng các đĩa ẩm. pH cuối cùng đạt 7,1 ± 0,2.

A.23  Canh thang và thạch dịch tim não (BHI)

...

...

...

A.23.1.1  Thành phần

Dịch não bê

200 g

Dịch tim bò

250 g

Proteose pepton hoặc gelysate

10 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

...

...

...

2,5 g

Dextrose

2 g

Nước cất

1 lít

A.23.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước cất, có đun nhẹ. Phân phối canh thang vào các chai hoặc các ống nghiệm để bảo. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2.

A.23.2  Môi trường 2

A.23.2.1  Thành phần

...

...

...

6 g

Pepton thịt

6 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Dextrose

3 g

Pepton gelatin

14,5 g

...

...

...

2,5 g

Nước cất

1 lít

A.23.2.2  Chuẩn bị

Tạo huyền phù các thành phần Môi trường 2 trong nước cất và đun trong 1 min để hòa tan hoàn toàn.

Đối với cả Môi trường 1 và Môi trường 2, phân phối canh thang vào cả hai và ống nghiệm để bảo quản. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. Có thể dùng BHI có bán sẵn.

Để chuẩn bị thạch tim não, thêm 15 g thạch vào 1 lít canh thang BHI. Đun để hòa tan thạch trước khi phân phối vào các chai hoặc các bình nón. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C.

A.24  Thạch máu tryptose cơ bản

A.24.1  Thành phần

...

...

...

10 g

Chất chiết thịt bò

3 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Thạch

15 g

Nước cất

1 lít

...

...

...

Tạo huyền phù các thành phần trong nước cất, trộn kỹ và gia nhiệt, thỉnh thoảng khuấy. Để sôi khoảng 1 min. Cho vào các ống 16 mm x 150 mm đến 1/3 ống và đậy nắp hoặc vặn nút để duy trì các điều kiện hiếu khí. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Trước khi môi trường đông đặc, nghiêng các ống để có các bề mặt nghiêng từ 4 cm đến 5 cm và độ sâu từ 2 cm đến 3 cm.

A.25  Dung dịch papain, 5 % (khối lượng/thể tích)

A.25.1  Thành phần

Papain

50 g

Nước cất

1 lít

A.25.2  Chuẩn bị

Thêm papain vào nước cất vô trùng và xoay bình để hòa tan hoàn toàn. Phân phối các phần 100 ml vào các chai.

...

...

...

A.26.1  Thành phần

p-Dimethylaminobenzaldehyde

5 g

2-Metylbutan-2-ol (amyl alcohol)

75 ml

Axit clohydric (HCI) đặc

25 ml

A.26.2  Chuẩn bị

Hòa tan p-dimethylaminobenzaldehyde trong amyl alcohol. Thêm từ từ axit clohydric (HCI) đặc. Bảo quản ở 4 °C. Để thử indol, thêm từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử đã chuẩn bị vào 5 ml chủng cấy vi khuẩn trong canh thang trypton 24 h. Phản ứng dương tính indol nếu có màu đỏ sẫm trên lớp bề mặt.

...

...

...

A.27.1  Thành phần

Dung dịch 1:

alpha-Naphthol

5 g

Etanol (tuyệt đối)

100 ml

Dung dịch 2:

...

...

...

40 g

Nước cất đến

100 ml

A.27.2  Chuẩn bị

Phép thử Voges-Proskauer (VP). Ở nhiệt độ phòng, chuyển 1 ml chủng cấy 48 h vào ống nghiệm và thêm 0,6 ml dung dịch 1 và 0,2 ml dung dịch 2. Lắc sau khi thêm mỗi dung dịch. Để tăng cường độ và tốc độ phản ứng, thêm vài tinh thể creatin vào hỗn hợp. Đọc kết quả 4 h sau khi thêm các thuốc thử. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hồng eosin.

A.28  Dung dịch kali hydroxit, 40 % (khối lượng/thể tích)

Kali hydroxit (KOH)

40 g

Nước cất vừa đủ

...

...

...

A.29  Nước muối vô trùng, 0,85 %

A.29.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl)

8,5 g

Nước cất

1 lít

A.29.2  Chuẩn bị

Hòa tan 8,5 g natri clorua trong nước. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Để nguội đến nhiệt độ phòng.

A.30  Nước muối formalin

...

...

...

Dung dịch formaldehyde (từ 36 % đến 38 %)

6 ml

Natri clorua (NaCI)

8,5 g

Nước cất

1 lít

A.30.2  Chuẩn bị

Hòa tan 8,5 g natri clorua trong 1 lít nước cất. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm 6 ml dung dịch formaldehyde. Không hấp áp lực sau khi thêm formaldehyde.

A.31  Chất chỉ thị metyl đỏ

...

...

...

Metyl đỏ

0,1 g

Etanol (95 %)

300 ml

Nước cất

500 ml

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Cor 1:2004) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch

...

...

...

[3] TCVN 8128-1:2009 (ISO/TS 11133-1:2009) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy - Phần 1: Hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong phòng thử nghiệm.

[4] FDA, Bacteriological Analytical Manual, Chapter 5, Salmonella