Từ khoá: Số Hiệu, Tiêu đề hoặc Nội dung ngắn gọn của Văn Bản...

Đăng nhập

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10783-1:2015 về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - virus viêm gan A

Số hiệu: TCVN10783-1:2015 Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành: *** Người ký: ***
Ngày ban hành: Năm 2015 Ngày hiệu lực:
Tình trạng: Đã biết

Thuốc thử

Nồng độ cuối

(trong 25 µl)

Thể tích trên phản ứng

(µl)

5 × hỗn hợp phản ứng Ultrasense

5 ± 0,1

Mồi FW

0,5 pmol/µl

Theo yêu cầu

Mồi REV

0,9 pmol/µl

Theo yêu cầu

Mẫu dò

0,25 pmol/µl

Theo yêu cầu

Chất nhuộm màu chuẩn ROX (50 ×)

Theo yêu cầua

Theo yêu cầu

Hỗn hợp enzym Ultrasense ARN

1,25 ± 0,05

Nước (5.2.1)

Theo yêu cầu

Tổng thể tích

20 ± 0,2

a Máy real-time PCR Biosystems Applied, ROX sử dụng ở nồng độ 1× ; đối với Stratagen MX3000, ROX có thể cũng được sử dụng ở nồng độ 0,1× hoặc bỏ qua hỗn hợp mastermix. Đối với máy khác, tham khảo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Máy real-time PCR Biosystems Applied và Stratagen MX3000 là các sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng.

Bảng B.2 – Thông số chu trình

Mô tả các bước

Nhiệt độ và thời gian

Số chu trình

RT

55 °C trong 1 h

1

Gia nhiệt trước

95 °C trong 5 min

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Khuếch đại

Biến tính

95 °C trong 15 s

45

Bắt cặp-kéo dài

60 °C trong 1 min

65 °C trong 1 min

 

PHỤ LỤC C

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

MỒI REAL-TIME RT-PCR VÀ MẪU DÒ THỦY PHÂN ĐỂ PHÁT HIỆN HAV, NOROVIRUS GI, NOROVIRUS GII VÀ VIRUS MENGO (KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH)

C.1 HAV

HAV68 (FW)

HAV240 (REV)

HAV150 (-) (PROBE):

TCA CCG CCG TTT GCC TAG

GGA GAG CCC TGG AAG AAA G

CCT GAA CCT GCA GGA ATT AA

Tài liệu tham khảo [2]

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Tài liệu tham khảo [2]

Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại đầu 3’ với MGBNFQ (chất kết dính phụ/chất hấp thụ không huỳnh quang).

Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm có kích thước 173 bp tương ứng với 68-240 nucleotid của HAV phân lập HM174 43c (số đăng ký Ngân hàng Gen M59809).

Dãy trình tự sử dụng tất cả trình tự có sẵn trong Ngân hàng gen của phép phân tích vùng đích chứng minh rằng cặp mồi và mẫu dò này đủ để định lượng tất cả các kiểu gen của HAV. Ngoài ra, phép phân tích phổ đột biến của một gen các chủng biến đổi cho thấy vùng này không dễ thay đổi và phép phân tích này sẽ ổn định lâu dài. Tính đặc hiệu của các mồi đã được kiểm chứng bằng 10 piconavirus khác nhau: poliovirus (chủng vacin huyết thanh typ 1); enterovirus B ở người (echovirus typ1); enterovirus B ở người (echovirus typ 11); enterovirus B ở người (echovirus typ 30); enterovirus B ở người (Coxsackie virus-B5); enterovirus C ở người (Coxsackie virus-A24); enterovirus D ở người (eterovirus 70); enterovirus ở bò; teschovirus ở lợn (enterovirus typ 1 ở bò) và virus encephalomyocarditis. Virus enteric khác cũng được sử dụng như: virus hespatitis E, rotavirus người và bò (nhóm A), norovirus, mamastrovirus (astrovirus typ 1 ở người) và adenovirus F ở người (enteric adenovirus typ 40). Không có phép thử virus nào cho kết quả dương cũng như ở nồng độ cao (106 đến 108 TCID50/ml hoặc cặn huyền phù không pha loãng 0,1 g/ml) hoặc nồng độ thấp (104 TCID50/ml hoặc cặn huyền phù 0,1 g/ml của dịch pha loãng ở độ pha loãng 10-1). LOD của phép phân tích là 10 phân tử ssARN, 1 phân tử ARN và 0,05 virus lây nhiễm trên phản ứng (Tài liệu tham khảo [2]).

C.2. Norovirus GI

QNIF4 (FW)

NV1LCR (REV)

NVGG1p (PROBE):

CGC TGG ATG CGN TTC CAT

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT

Tài liệu tham khảo [3]

Tài liệu tham khảo [4]

Tài liệu tham khảo [4]

Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại đầu 3’ với 6-carboxytetrametylrhodamin (TAMRA).

Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm có kích thước 86 bp tương ứng với 5291-5376 nucleotid của Norwalk virus (số đăng ký Ngân hàng Gen M87661).

C.3. Norovirus GII

QNIF2 (FW)

COG2R (REV)

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA

TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA

AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG

Tài liệu tham khảo [5]

Tài liệu tham khảo [6]

Tài liệu tham khảo [5]

Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại đầu 3’ với 6-carboxytetrametylrhodamin (TAMRA).

Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm kích thước 89 bp tương ứng với 5012-5100 nucleotid của Lordsdale virus (số đăng ký Ngân hàng Gen X86557).

Diện tích được chọn để phát hiện norovirus là vùng bảo tồn tốt tại đầu 5’ của ORF2 (Tài liệu tham khảo [6]). Các dãy trình tự sử dụng tất cả các trình tự có sẵn trong Ngân hàng gen của phép phân tích vùng đích chứng minh rằng bộ mồi và mẫu dò này đủ để định lượng tất cả Nov GI và Nov GII tương ứng. Ngoài ra, sử dụng 18 chủng NoV chuẩn: GI.1 (Norwalk virus); GI.2 (Whiterose); GI.3 (Southampton); GI.4 (Malta); GI.5 (Musgrove); GI.6 (Mikkeli); GI.7 (Winchester); GI.10 (Boxer), GII.1 (Hawaii); GII.2 (Melksham); GII.3 (Toronto); GII.4 (Grismby); GII.6 (Seacroft); GII.7 (Leeds); GII.10 (Erfurt); biến thể GIIb; biến thể GIIc và GIV (Alphatron) để kiểm chứng hiệu quả và độ nhạy của mồi và mẫu dò.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

C.4. Virus mengo

Mengo 110 (FW):

Mengo 209 (REV)

Mengo 147 (PROBE):

GCG GGT CCT GCC GAA AGT

GAA GTA ACA TAT AGA CAG ACG CAC AC

ATC ACA TTA CTG GCC GAA CG

Tài liệu tham khảo [8]

Tài liệu tham khảo [8]

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại đầu 3’ với MGBNFQ (chất kết dính phụ/chất hấp thụ không huỳnh quang).

Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm có kích thước 100 bp tương ứng với 110-209 nucleotid của chủng virus mengo tái tổ hợp MC0 được dùng trong tiêu chuẩn này. Chủng này tương ứng với 110-270 nicleotid của virus mengo không tái tổ hợp phân lập M (số đăng ký Ngân hàng Gen L22089).

Lựa chọn vùng đích để định lượng virus mengo càng giống với HAV càng tốt về cấu trúc, chiều dài và thành phần cơ bản (Tài liệu tham khảo [2]). Các trình tự mồi này không giống bất kỳ trình tự nào khác có sẵn trong Ngân hàng Gen.

 

PHỤ LỤC D

(Tham khảo)

SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VIRUS MENGO MC0 ĐƯỢC DÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH

D.1. Yêu cầu chung

Virus mengo là một virus murine của họ Picoranviridae. Chủng virus mengo MC0 (ATCC® VR-1597TM)[2]) là một virus tái tổ hợp không có ống poly(C) khi so sánh với virus mengo tự nhiên, có đặc tính phát triển giống với virus tự nhiên nhưng có kiểu hình của vi khuẩn không độc (Tài liệu tham khảo [9]). Chủng này được sử dụng làm virus kiểm soát quá trình trong phương pháp phát hiện HAV và norovirus (Tài liệu tham khảo [2] [7]) và đã được sử dụng làm virus kiểm soát quá trình.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

D.2. Thuốc thử và thiết bị, dụng cụ

D.2.1. Môi trường nuôi cấy tế bào khuyến cáo đối với tế bào HeLa là môi trường thiết yếu tối thiểu của Eagle có 2 mmol/l L-glutamin và BSS của Earle, chỉnh đến 1,5 g/l natri hydrocarbonat, 0,1 mmol/l axit amin không thiết yếu, 1,0 mmol/l natri pyruvat, dung dịch 1× streptomycin/penicillin, 100 ml/l (phát triển) hoặc 20 ml/l (duy trì) huyết thanh phôi thai bò.

D.2.2. Để chuẩn bị nuôi cấy tế bào và phát triển virus, cần có các thiết bị nuôi cấy tế bào cần có: máy ủ có mức CO2 có thể kiểm soát được và vật liệu nuôi cấy tế bào (bình .v.v.).

D.3. Cách tiến hành

Virus mengo sẽ phát triển trong môi trường (50 ± 10) ml/l CO2 (bình mở) hoặc môi trường không kiểm soát (bình đóng) trên 80 % đến 90 % lớp đơn suy biến của tế bào HeLa (ATCC® CCL-2TM)2) cho đến khi đạt được hiệu ứng tế bào ít nhất là 75 %.

Đưa bình nuôi cấy tế bào vào một chu trình rã đông, sau đó ly tâm lượng chứa trong bình ở 3 000 x g trong (10 ± 1) min.

Giữ lại phần nổi phía trên (nuôi cấy tế bào) để chuẩn bị vật liệu của virus kiểm soát quá trình (5.3.6).

 

PHỤ LỤC E

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

TÁCH CHIẾT ARN SỬ DỤNG HỆ THỐNG BIOMERIEUX NUCLISENS® [3])

E.1. Thuốc thử

E.1.1. Dung dịch đệm lysin BioMerieux Nuclisens®.

E.1.2. Thuốc thử chiết từ tính BioMerieux Nuclisens® (gồm dung dịch silica từ tính, dung dịch đệm rửa 1, 2, 3 và dung dịch đệm rửa giải).

E.2. Thiết bị, dụng cụ

E.2.1. Thiết bị miniMAG hoặc easyMAG BioMerieux Nuclisens®.

E.2.2. Giá từ tính BioMerieux Nuclisens®.

E.2.3. Máy ủ lắc nhiệt hoặc thiết bị tương đương để lắc ống 1,5 ml ở (60 ± 2) °C và lắc khoảng 1 400 dao động/min.

E.2.4. Ống có nắp vặn, dung tích 1,5 ml, thích hợp để sử dụng với thiết bị NucliSens®.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Cho (2 ± 0,1) ml dung dịch đệm phân giải NucliSens® vào ống. Thêm (500 ± 10) µl mẫu (BMS) hoặc toàn bộ mẫu (các nền mẫu khác) và trộn bằng cách lắc nhẹ.

Ủ trong (10 ± 1) min ở nhiệt độ phòng.

Thêm (50 ± 2) µl dung dịch silica từ tính đã trộn kỹ vào ống và trộn bằng cách lắc nhẹ.

Ủ trong (10 ± 1) min ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm (120 ± 10) s ở 1 500 x g sau đó loại bỏ cẩn thận lớp huyền phù phía trên bằng cách, ví dụ: bằng cách hút.

Thêm (400 ± 10) µl dung dịch đệm rửa 1 và hòa lại các hạt nhỏ bằng cách nhỏ giọt hoặc lắc.

Chuyển dung dịch huyền phù vào ống có nắp vặn 1,5 ml. Rửa trong (30 ± 2) s, sử dụng hệ thống chiết miniMAG hoặc easyMAG có các bước rửa tự động. Sau khi rửa, để silica lắng xuống sử dụng khối từ của hệ thống chiết miniMAG hoặc easyMAG. Lấy phần nổi phía trên ra, ví dụ: bằng cách hút.

Tách ống khỏi khối từ, sau đó thêm (400 ± 10) µl dung dịch đệm rửa 1. Hòa lại các hạt nhỏ, rửa trong (30 ± 2) s, để silica lắng xuống, sử dụng khối từ, sau đó loại bỏ phần nổi phía trên.

Tách ống khỏi khối từ, sau đó thêm (500 ± 10) µl dung dịch đệm rửa 2. Hòa lại các hạt nhỏ, rửa trong (30 ± 2) s, để silica lắng xuống, sử dụng khối từ, sau đó loại bỏ phần nổi phía trên. Tiến hành lặp lại.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Thêm (100 ± 2) µl dung dịch đệm rửa giải. Đậy nắp ống và chuyển vào máy ủ lắc nhiệt hoặc thiết bị tương đương và ủ trong (5,0 ± 0,5) min ở (60 ± 1) °C và lắc khoảng 1 400 dao động/min.

Đặt ống vào giá từ tính và để silica lắng xuống, sau đó chuyển chất rửa giải vào ống sạch.

 

PHỤ LỤC F

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CÁCH CHUẨN BỊ THUỐC THỬ VÀ DUNG DỊCH ĐỆM

F.1. Dung dịch 5 × PEG/NaCl (PEG 8 000 nồng độ 500 g/l, NaCl 1,5 nồng độ mol/l)

F.1.1 .Thành phần

Polyetylen (PEG) 8 000

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

NaCl

(87 ± 1) g

Nước (5.2.1)

theo yêu cầu

F.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong (450 ± 5) ml nước (5.2.1), gia nhiệt nhẹ nếu cần. Chỉnh thể tích đến (1 000 ± 10) ml bằng nước và trộn kỹ. Khử trùng bằng hấp áp lực.

F.2. Hỗn hợp cloroform/butanol

F.2.1. Thành phần

Cloroform

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Butanol

(10 ± 0,1) ml

F.2.2. Chuẩn bị

Trộn các thành phần trên với nhau.

F.3. Dung dịch proteinase K

F.3.1. Thành phần

Proteinase K (30 U/mg)

(20 ± 0,1) mg

Nước (5.2.1)

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

F.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan proteinase K trong nước. Trộn kỹ.

Bảo quản với các lượng để sử dụng ở (–20 ± 5) °C trong tối đa 6 tháng. Khi được rã đông, bảo quản ở (4 ± 2) °C và dùng trong 1 tuần.

F.4. Muối đệm phosphat (PBS)

F.4.1. Thành phần

NaCl

(8,0 ± 0,1) g

Kali clorua

(0,2 ± 0,01) g

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

(1,15 ± 0,01) g

Kali dihydrophosphat

(0,2 ± 0,01) g

Nước (5.2.1)

(1 000 ± 2) ml

F.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, chỉnh đến pH 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Khử trùng bằng hấp áp lực, nếu cần.

F.5. Đệm Tris/glyxin/chất chiết thịt bò (TGBE)

F.5.1. Thành phần

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

(12,1 ± 0,2) g

Glyxin

(3,8 ± 0,1) g

Chất chiết thịt bò

(10 ± 0,1) g

Nước (5.2.1)

(1 000 ± 1) ml

F.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, chỉnh đến pH 9,5 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Khử trùng bằng hấp áp lực, nếu cần.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

PHỤ LỤC G

(Tham khảo)

QUÁ TRÌNH TẠO CÁC GỐC KIỂM SOÁT ADN MẠCH KÉP (DSADN)

G.1. Yêu cầu chung

Các plasmid đối chứng được tạo thành bằng cách gắn trình tự ADN đích vào một vector plasmid thích hợp sao cho trình tự đích là xuôi của trình tự xúc tác đối với ARN polymerase.

G.2. Thuốc thử và thiết bị, dụng cụ

G.2.1. Các tế bào khả biến chủng JM109.

G.2.2. Canh thang LB, Bacto trypton[4]) 10 g/l, cao nấm men 5 g/l, NaCl 10 g/l, chỉnh đến pH 7,0.

G.2.3. Thạch LB, canh thang LB bổ sung thạch 15 g/l.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

G.2.5. Thuốc thử plasmid miniprep

G.2.6. Đá.

G.2.7. Máy ủ, có thể vận hành ở (37 ± 1) °C.

G.2.8. Máy ủ lắc hoặc tương đương, vận hành ở (37 ± 1) °C và khoảng 160 dao động/min.

G.3. Phiên mã

Thêm 1 ng đến 100 ng vật liệu kiểm soát dsADN đã tinh sạch trước vào các tế bào khả biến chủng JM109 (50 ± 0,5) µl và trộn kỹ. Làm lạnh trên đá trong (20 ± 1) min.

Ủ ở (42 ± 1) °C trong (45 ± 2) s sau đó làm lạnh ngay trên đá trong (120 ± 10) s.

Thêm (950 ± 10) µl canh thang LB vào các giếng sau đó lắc ở (37 ± 1) °C khoảng 160 dao động/min trong (90 ± 10) min.

Gạt (100 ± 2) µl canh thang đã ủ lên đĩa thạch LB có bổ sung 50 µg/ml amplicilin.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

G.4. Tinh sạch ADN plasmid

Ủ (5 ± 0,1) ml canh thang LB bổ sung 100 µg/ml ampicilin có khuẩn lạc đơn lẻ chứa plasmid quan tâm.

Ủ ở (37 ± 1) °C qua đêm.

Tinh sạch ADN plasmid từ dịch nuôi cấy sử dụng thuốc thử minprep theo quy trình thích hợp; rửa giải trong (100 ± 2) µl đệm rửa giải.

Bảo quản gốc ADN plasmid ở (–20 ± 5) °C cho đến khi cần để chuẩn bị vật liệu kiểm soát dsADN (5.3.8).

G.5. Định lượng ADN plasmid

Sử dụng máy đo quang phổ xác định độ hấp thụ của gốc plasmid ở 260 nm.

Nhân độ hấp thụ đọc được với 5 x 10-8 để cho nồng độ của ADN, tính bằng gam trên microlit.

Chia số này cho khối lượng phân tử plasmid đơn lẻ, tính bằng gam, để tính nồng độ của ADN, tính bằng số bản sao trong một microlit.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

 

PHỤ LỤC H

(Tham khảo)

QUÁ TRÌNH TẠO CÁC GỐC ARN KIỂM SOÁT BÊN NGOÀI (EC ARN)

H.1. Yêu cầu chung

Các plasmid kiểm soát được tạo thành bằng cách thắt trình tự ADN đích thành một vector plasmid thích hợp sao cho trình tự đích là xuôi của trình tự xúc tác đối với ARN polymerase.

H.2. Thuốc thử và thiết bị, dụng cụ

H.2.1. Enzym giới hạn dùng để tạo tuyến tính và các dung dịch đệm kết hợp.

H.2.2. Thuốc thử tinh sạch PCR.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

H.2.4. DNase không chứa RNase.

H.2.5. Thuốc thử tinh sạch ARN

H.2.6. Thuốc thử và thiết bị điện di trên gel ADN.

H.2.7. Thuốc thử và thiết bị real-time RT-PCR một bước (sử dụng mẫu dò thủy phân).

H.2.8. Tủ ấm, có thể duy trì ở (37 ± 1) °C

H.3. Tạo tuyến tính ADN plasmid

Cho 100 ng đến 500 ng ADN plasmid kiểm soát đã tinh sạch vào hỗn hợp phản ứng chứa enzym giới hạn thích hợp (để có tuyến tính plasmid ở điểm bắt đầu xuôi của trình tự đích) và các dung dịch đệm theo khuyến cáo của nhà sản xuất enzym.

Ủ ở (37 ± 1) °C trong (120 ± 5) min.

Tinh sạch ADN từ hỗn hợp mastermix sử dụng thuốc thử tinh sạch PCR, rửa giải trong (50 ± 0,5) µl dung dịch đệm rửa giải.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

H.4. Phiên mã ARN in vitro

Cho 100 ng đến 500 ng plasmid ADN tuyến tính đã tinh sạch vào hỗn hợp phản ứng phiên mã ARN in vitro đã chuẩn bị theo khuyến cáo của nhà sản xuất enzym ARN polymerase .

Ủ ở (37 ± 1) °C trong (120 ± 5) min.

Tinh sạch ARN sử dụng thuốc thử tinh sạch ARN, rửa giải trong (100 ± 1) µl nước (5.2.1).

H.5. Kiểm tra việc nhiễm ADN

Chuẩn bị hỗn hợp mastermix real-time RT-PCR đích đặc hiệu (5.3.7), tách thành hai phần và bất hoạt enzym RT trong một phần bằng cách gia nhiệt ở (95 ± 2) °C trong (5,0 ± 0,5) min.

Dùng cả hai phần hỗn hợp mastemix phụ thuộc EC ARN gốc vào real-time RT-PCR dọc theo dãy dịch pha loãng dsADN làm đường chuẩn (8.4).

Nếu mức có thể phát hiện được trong phần EC ARN gốc được thử nghiện với hỗn hợp mastemix đã xử lý nhiệt lớn hơn 0,1 % so với mức trong phần mẫu thử với hỗn hợp mastermix chưa xử lý nhiệt (nếu chênh lệch Cq giữa EC ARN gốc được thử với hỗn hợp mastermix xử lý nhiệt và hỗn hợp mastermix chưa xử lý nhiệt nhỏ hơn 10 đối với đường chuẩn dsADN có độ dốc lý tưởng –3,32) thì EC ARN gốc bị nhiễm ADN và phải được xử lý lại bằng DNase (I.3). Nếu mức phát hiện nhỏ hơn 0,1 % thì bảo quản ở (–20 ± 5) °C cho đến khi cần để chuẩn bị vật liệu kiểm soát EC ARN (5.3.8).

H.6. Định lượng EC ARN

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Nhân độ hấp thụ đọc được với 4 x 10-8 để được nồng độ của ARN, tính bằng gam trên microlit.

Chia số này cho khối lượng phân tử EC ARN đơn lẻ, tính bằng gam, để tính nồng độ ARN, tính bằng số bản sao trong một microlit.

Khối lượng của từng phân tử ARN có thể tính được bằng cách nhân chiều dài ARN trong ribonucleotid với 320,5 (khối lượng phân tử tương đối trung bình của ribonucleotid) và chia cho hệ số Avogadro (6,02 x 1023), ví dụ: phân tử ARN của 200 ribonucleotid có khối lượng là 1,06 x 10-19 g.

 

PHỤ LỤC I

(Tham khảo)

SƠ ĐỒ ĐĨA QUANG ĐIỂN HÌNH

Bảng I.1 – Sơ đồ đĩa quang điển hình

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] BOOM R., SOL C.J., SALIMANS M.M., JANSEN C.L., WERTHEIM-VAN DILLEN P.M., VAN DER NOORDAA J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 1990, 28pp. 495-503.

[2] COSTAFREDA M.I., BOSCH A., PINTÓ R.M. Development, evaluation, and standardization of a real- time TaqMan reverse transcription-PCR assay for quantification of hepatitis A virus in clinical and shellfish samples. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72pp. 3846-3855.

[3] dA SILVA A.K., LE SAUX J.C., PARNAUDEAU S., POMMEPUY M., ELIMELECH M., LE GUYADER F.S. Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: Different behaviors of genogroups I and II. Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73pp. 7891-7897.

[4] SVRAKA S., DUIZER E., VENNEMA H., dE BRUIN E., VAN DER VEER B., DORRESTEIJN B. et al. Etiological role of viruses in outbreaks of acute gastroenteritis in The Netherlands from 1994 through 2005. J. Clin. Microbiol. 2007, 45pp. 1389-1394.

[5] LOISY F., ATMAR R.L., GUILLON P., LE CANN P., POMMEPUY M., LE GUYADER F.S. Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish. J. Virol. Methods. 2005, 123pp. 1-7.

[6] KACEYAMA T., KOJIMA S., SHINOHARA M., UCHIDA K., FUKUSHI S., HOSHINO F.B. et al. Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR. J. Clin. Microbiol. 2003, 41pp. 1548-1557.

[7] LE GUYADER F.S., PARNAUDEAU S., SCHAEFFER J., BOSCH A., LOISY F., POMMEPUY M. et al. Detection and quantification of noroviruses in shellfish. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75pp. 618-624.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

[9] MARTIN L.R., DUKE G.M., OSORIO J.E., HALL D.J., PALMENBERG A.C. Mutational analysis of the mengovirus poly(C) tract and surrounding heteropolymeric sequences. J. Virol. 1996, 70pp.2027-2031.

[10] TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

[11] ISO 22118, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection and quantification of food-borne pathogens – Performance characteristics.

[12] ISO 22119, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General requirements and definitions.

[1]) Invitrogen RNA UltrasenseTM là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp từ Invitrogen. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

[2] ATCC® VR-1597TM và ATCC® CCL-2TM là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp từ Viện giữ giống mẫu của Mỹ (American type culture collection). Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu được chứng minh là đáp ứng được các yêu cầu của quy trình.

[3] BioMerieux NucliSens® là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp từ BioMerieux. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

[4] Bacto trypton là sản phẩm có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng.

Văn bản này chưa cập nhật nội dung Tiếng Anh

Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10783-1:2015 (ISO/TS 15216-1:2013) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Xác định virus viêm gan A và norovirus trong thực phẩm sử dụng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực - Phần 1: Phương pháp định lượng

Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


3.499

DMCA.com Protection Status
IP: 3.133.147.87
Hãy để chúng tôi hỗ trợ bạn!