|
Thuốc thử
|
Nồng độ cuối
(trong 25 µl)
|
Thể tích trên phản ứng
(µl)
|
|
5 × hỗn hợp phản ứng Ultrasense
|
1×
|
5 ± 0,1
|
|
Mồi FW
|
0,5 pmol/µl
|
Theo yêu cầu
|
|
Mồi REV
|
0,9 pmol/µl
|
Theo yêu cầu
|
|
Mẫu dò
|
0,25 pmol/µl
|
Theo yêu cầu
|
|
Chất nhuộm màu chuẩn ROX (50 ×)
|
Theo yêu cầua
|
Theo yêu cầu
|
|
Hỗn hợp enzym Ultrasense ARN
|
—
|
1,25 ± 0,05
|
|
Nước (5.2.1)
|
—
|
Theo yêu cầu
|
|
Tổng thể tích
|
—
|
20 ± 0,2
|
|
a Máy real-time PCR Biosystems Applied, ROX sử
dụng ở nồng độ 1× ; đối với Stratagen MX3000, ROX có thể cũng được sử dụng ở
nồng độ 0,1× hoặc bỏ qua hỗn hợp mastermix. Đối với máy khác, tham khảo hướng
dẫn của nhà sản xuất.
Máy real-time PCR Biosystems Applied và Stratagen MX3000 là các sản
phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử
dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng.
|
Bảng B.2 – Thông số chu trình
Mô tả các bước
Nhiệt độ và thời gian
Số chu trình
RT
55 °C trong 1 h
1
Gia nhiệt trước
95 °C trong 5 min
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khuếch đại
Biến tính
95 °C trong 15 s
45
Bắt cặp-kéo dài
60 °C trong 1 min
65 °C trong 1 min
PHỤ LỤC C
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
MỒI REAL-TIME RT-PCR VÀ MẪU DÒ THỦY PHÂN ĐỂ PHÁT HIỆN HAV, NOROVIRUS GI,
NOROVIRUS GII VÀ VIRUS MENGO (KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH)
C.1 HAV
HAV68 (FW)
HAV240 (REV)
HAV150 (-) (PROBE):
TCA CCG CCG TTT GCC TAG
GGA GAG CCC TGG AAG AAA G
CCT GAA CCT GCA GGA ATT AA
Tài liệu tham khảo [2]
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tài liệu tham khảo [2]
Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại
đầu 3’ với MGBNFQ (chất kết dính phụ/chất hấp thụ không huỳnh quang).
Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm có kích thước 173 bp tương ứng với
68-240 nucleotid của HAV phân lập HM174 43c (số đăng ký Ngân hàng Gen M59809).
Dãy trình tự sử dụng tất cả trình tự có sẵn trong Ngân hàng gen của
phép phân tích vùng đích chứng minh rằng cặp mồi và mẫu dò này đủ để định lượng
tất cả các kiểu gen của HAV. Ngoài ra, phép phân tích phổ đột biến của một gen
các chủng biến đổi cho thấy vùng này không dễ thay đổi và phép phân tích này sẽ
ổn định lâu dài. Tính đặc hiệu của các mồi đã được kiểm chứng bằng 10
piconavirus khác nhau: poliovirus (chủng vacin huyết thanh typ 1); enterovirus
B ở người (echovirus typ1); enterovirus B ở người (echovirus typ 11);
enterovirus B ở người (echovirus typ 30); enterovirus B ở người (Coxsackie
virus-B5); enterovirus C ở người (Coxsackie virus-A24); enterovirus D ở người
(eterovirus 70); enterovirus ở bò; teschovirus ở lợn (enterovirus typ 1 ở bò)
và virus encephalomyocarditis. Virus enteric khác cũng được sử dụng như: virus
hespatitis E, rotavirus người và bò (nhóm A), norovirus, mamastrovirus
(astrovirus typ 1 ở người) và adenovirus F ở người (enteric adenovirus typ 40).
Không có phép thử virus nào cho kết quả dương cũng như ở nồng độ cao (106
đến 108 TCID50/ml hoặc cặn huyền phù không pha loãng 0,1 g/ml) hoặc
nồng độ thấp (104 TCID50/ml hoặc cặn huyền phù 0,1 g/ml của dịch pha
loãng ở độ pha loãng 10-1). LOD của phép phân tích là 10 phân tử ssARN, 1 phân
tử ARN và 0,05 virus lây nhiễm trên phản ứng (Tài liệu tham khảo [2]).
C.2. Norovirus GI
QNIF4 (FW)
NV1LCR (REV)
NVGG1p (PROBE):
CGC TGG ATG CGN TTC CAT
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT
Tài liệu tham khảo [3]
Tài liệu tham khảo [4]
Tài liệu tham khảo [4]
Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại
đầu 3’ với 6-carboxytetrametylrhodamin (TAMRA).
Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm có kích thước 86 bp tương ứng với
5291-5376 nucleotid của Norwalk virus (số đăng ký Ngân hàng Gen M87661).
C.3. Norovirus GII
QNIF2 (FW)
COG2R (REV)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA
TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA
AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG
Tài liệu tham khảo [5]
Tài liệu tham khảo [6]
Tài liệu tham khảo [5]
Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại
đầu 3’ với 6-carboxytetrametylrhodamin (TAMRA).
Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm kích thước 89 bp tương ứng với
5012-5100 nucleotid của Lordsdale virus (số đăng ký Ngân hàng Gen X86557).
Diện tích được chọn để phát hiện norovirus là vùng bảo tồn tốt tại
đầu 5’ của ORF2 (Tài liệu tham khảo [6]). Các dãy trình tự sử dụng tất cả các
trình tự có sẵn trong Ngân hàng gen của phép phân tích vùng đích chứng minh
rằng bộ mồi và mẫu dò này đủ để định lượng tất cả Nov GI và Nov GII tương ứng.
Ngoài ra, sử dụng 18 chủng NoV chuẩn: GI.1 (Norwalk virus); GI.2 (Whiterose);
GI.3 (Southampton); GI.4 (Malta); GI.5 (Musgrove); GI.6 (Mikkeli); GI.7
(Winchester); GI.10 (Boxer), GII.1 (Hawaii); GII.2 (Melksham); GII.3 (Toronto);
GII.4 (Grismby); GII.6 (Seacroft); GII.7 (Leeds); GII.10 (Erfurt); biến thể
GIIb; biến thể GIIc và GIV (Alphatron) để kiểm chứng hiệu quả và độ nhạy của
mồi và mẫu dò.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.4. Virus mengo
Mengo 110 (FW):
Mengo 209 (REV)
Mengo 147 (PROBE):
GCG GGT CCT GCC GAA AGT
GAA GTA ACA TAT AGA CAG ACG CAC AC
ATC ACA TTA CTG GCC GAA CG
Tài liệu tham khảo [8]
Tài liệu tham khảo [8]
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại
đầu 3’ với MGBNFQ (chất kết dính phụ/chất hấp thụ không huỳnh quang).
Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm có kích thước 100 bp tương ứng với
110-209 nucleotid của chủng virus mengo tái tổ hợp MC0 được dùng trong tiêu
chuẩn này. Chủng này tương ứng với 110-270 nicleotid của virus mengo không tái
tổ hợp phân lập M (số đăng ký Ngân hàng Gen L22089).
Lựa chọn vùng đích để định lượng virus mengo càng giống với HAV càng
tốt về cấu trúc, chiều dài và thành phần cơ bản (Tài liệu tham khảo [2]). Các
trình tự mồi này không giống bất kỳ trình tự nào khác có sẵn trong Ngân hàng
Gen.
PHỤ LỤC D
(Tham khảo)
SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VIRUS MENGO MC0 ĐƯỢC DÙNG ĐỂ KIỂM
SOÁT QUÁ TRÌNH
D.1. Yêu cầu chung
Virus mengo là một virus murine của họ Picoranviridae. Chủng
virus mengo MC0 (ATCC® VR-1597TM)[2]) là một
virus tái tổ hợp không có ống poly(C) khi so sánh với virus mengo tự nhiên, có
đặc tính phát triển giống với virus tự nhiên nhưng có kiểu hình của vi khuẩn
không độc (Tài liệu tham khảo [9]). Chủng này được sử dụng làm virus kiểm soát
quá trình trong phương pháp phát hiện HAV và norovirus (Tài liệu tham khảo [2]
[7]) và đã được sử dụng làm virus kiểm soát quá trình.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
D.2. Thuốc thử và thiết bị, dụng cụ
D.2.1. Môi trường nuôi cấy tế bào khuyến cáo đối với tế
bào HeLa là môi trường thiết yếu tối thiểu của Eagle có 2 mmol/l L-glutamin và
BSS của Earle, chỉnh đến 1,5 g/l natri hydrocarbonat, 0,1 mmol/l axit amin
không thiết yếu, 1,0 mmol/l natri pyruvat, dung dịch 1×
streptomycin/penicillin, 100 ml/l (phát triển) hoặc 20 ml/l (duy trì) huyết
thanh phôi thai bò.
D.2.2. Để chuẩn bị nuôi cấy tế bào và phát triển virus,
cần có các thiết bị nuôi cấy tế bào cần có: máy ủ có mức CO2 có thể kiểm soát
được và vật liệu nuôi cấy tế bào (bình .v.v.).
D.3. Cách tiến hành
Virus mengo sẽ phát triển trong môi trường (50 ± 10) ml/l CO2
(bình mở) hoặc môi trường không kiểm soát (bình đóng) trên 80 % đến 90 % lớp
đơn suy biến của tế bào HeLa (ATCC® CCL-2TM)2)
cho đến khi đạt được hiệu ứng tế bào ít nhất là 75 %.
Đưa bình nuôi cấy tế bào vào một chu trình rã đông, sau đó ly tâm
lượng chứa trong bình ở 3 000 x g trong (10 ± 1) min.
Giữ lại phần nổi phía trên (nuôi cấy tế bào) để chuẩn bị vật liệu của
virus kiểm soát quá trình (5.3.6).
PHỤ LỤC E
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
TÁCH CHIẾT ARN SỬ DỤNG HỆ THỐNG BIOMERIEUX NUCLISENS® [3])
E.1. Thuốc thử
E.1.1. Dung dịch đệm lysin BioMerieux Nuclisens®.
E.1.2. Thuốc thử chiết từ tính BioMerieux Nuclisens® (gồm dung dịch silica từ tính, dung dịch đệm rửa
1, 2, 3 và dung dịch đệm rửa giải).
E.2. Thiết bị, dụng cụ
E.2.1. Thiết bị miniMAG hoặc easyMAG BioMerieux
Nuclisens®.
E.2.2. Giá từ tính BioMerieux Nuclisens®.
E.2.3. Máy ủ lắc nhiệt hoặc thiết bị
tương đương để lắc ống 1,5 ml ở (60 ± 2) °C và lắc khoảng 1 400 dao động/min.
E.2.4. Ống có nắp vặn, dung tích 1,5
ml, thích hợp để sử dụng với thiết bị NucliSens®.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Cho (2 ± 0,1) ml dung dịch đệm phân giải NucliSens® vào
ống. Thêm (500 ± 10) µl mẫu (BMS) hoặc toàn bộ mẫu (các nền mẫu khác) và trộn
bằng cách lắc nhẹ.
Ủ trong (10 ± 1) min ở nhiệt độ phòng.
Thêm (50 ± 2) µl dung dịch silica từ tính đã trộn kỹ vào ống và trộn
bằng cách lắc nhẹ.
Ủ trong (10 ± 1) min ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm (120 ± 10) s ở 1 500 x g sau đó loại bỏ cẩn thận lớp
huyền phù phía trên bằng cách, ví dụ: bằng cách hút.
Thêm (400 ± 10) µl dung dịch đệm rửa 1 và hòa lại các hạt nhỏ bằng
cách nhỏ giọt hoặc lắc.
Chuyển dung dịch huyền phù vào ống có nắp vặn 1,5 ml. Rửa trong (30 ±
2) s, sử dụng hệ thống chiết miniMAG hoặc easyMAG có các bước rửa tự động. Sau
khi rửa, để silica lắng xuống sử dụng khối từ của hệ thống chiết miniMAG hoặc
easyMAG. Lấy phần nổi phía trên ra, ví dụ: bằng cách hút.
Tách ống khỏi khối từ, sau đó thêm (400 ± 10) µl dung dịch đệm rửa 1.
Hòa lại các hạt nhỏ, rửa trong (30 ± 2) s, để silica lắng xuống, sử dụng khối
từ, sau đó loại bỏ phần nổi phía trên.
Tách ống khỏi khối từ, sau đó thêm (500 ± 10) µl dung dịch đệm rửa 2.
Hòa lại các hạt nhỏ, rửa trong (30 ± 2) s, để silica lắng xuống, sử dụng khối
từ, sau đó loại bỏ phần nổi phía trên. Tiến hành lặp lại.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thêm (100 ± 2) µl dung dịch đệm rửa giải. Đậy nắp ống và chuyển vào
máy ủ lắc nhiệt hoặc thiết bị tương đương và ủ trong (5,0 ± 0,5) min ở (60 ± 1)
°C và lắc khoảng 1 400 dao động/min.
Đặt ống vào giá từ tính và để silica lắng xuống, sau đó chuyển chất
rửa giải vào ống sạch.
PHỤ LỤC F
(Quy định)
THÀNH PHẦN VÀ CÁCH CHUẨN BỊ THUỐC THỬ VÀ DUNG DỊCH ĐỆM
F.1. Dung dịch 5 × PEG/NaCl (PEG 8 000 nồng độ 500 g/l, NaCl 1,5 nồng
độ mol/l)
F.1.1 .Thành phần
Polyetylen (PEG) 8 000
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
NaCl
(87 ± 1) g
Nước (5.2.1)
theo yêu cầu
F.1.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên trong (450 ± 5) ml nước (5.2.1), gia
nhiệt nhẹ nếu cần. Chỉnh thể tích đến (1 000 ± 10) ml bằng nước và trộn kỹ. Khử
trùng bằng hấp áp lực.
F.2. Hỗn hợp cloroform/butanol
F.2.1. Thành phần
Cloroform
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Butanol
(10 ± 0,1) ml
F.2.2. Chuẩn bị
Trộn các thành phần trên với nhau.
F.3. Dung dịch proteinase K
F.3.1. Thành phần
Proteinase K (30 U/mg)
(20 ± 0,1) mg
Nước (5.2.1)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
F.3.2. Chuẩn bị
Hòa tan proteinase K trong nước. Trộn kỹ.
Bảo quản với các lượng để sử dụng ở (–20 ± 5) °C trong tối đa 6
tháng. Khi được rã đông, bảo quản ở (4 ± 2) °C và dùng trong 1 tuần.
F.4. Muối đệm phosphat (PBS)
F.4.1. Thành phần
NaCl
(8,0 ± 0,1) g
Kali clorua
(0,2 ± 0,01) g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(1,15 ± 0,01) g
Kali dihydrophosphat
(0,2 ± 0,01) g
Nước (5.2.1)
(1 000 ± 2) ml
F.4.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên trong nước, chỉnh đến pH 7,3 ± 0,2 ở 25 °C,
nếu cần. Khử trùng bằng hấp áp lực, nếu cần.
F.5. Đệm Tris/glyxin/chất chiết thịt bò (TGBE)
F.5.1. Thành phần
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(12,1 ± 0,2) g
Glyxin
(3,8 ± 0,1) g
Chất chiết thịt bò
(10 ± 0,1) g
Nước (5.2.1)
(1 000 ± 1) ml
F.5.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên trong nước, chỉnh đến pH 9,5 ± 0,2 ở 25 °C,
nếu cần. Khử trùng bằng hấp áp lực, nếu cần.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
PHỤ LỤC G
(Tham khảo)
QUÁ TRÌNH TẠO CÁC GỐC KIỂM SOÁT ADN MẠCH KÉP (DSADN)
G.1. Yêu cầu chung
Các plasmid đối chứng được tạo thành bằng cách gắn trình tự ADN đích
vào một vector plasmid thích hợp sao cho trình tự đích là xuôi của trình tự xúc
tác đối với ARN polymerase.
G.2. Thuốc thử và thiết bị, dụng cụ
G.2.1. Các tế bào khả biến chủng JM109.
G.2.2. Canh thang LB, Bacto trypton[4]) 10 g/l,
cao nấm men 5 g/l, NaCl 10 g/l, chỉnh đến pH 7,0.
G.2.3. Thạch LB, canh thang LB bổ sung thạch
15 g/l.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
G.2.5. Thuốc thử plasmid miniprep
G.2.6. Đá.
G.2.7. Máy ủ, có thể vận hành ở (37 ± 1) °C.
G.2.8. Máy ủ lắc hoặc tương đương, vận hành ở
(37 ± 1) °C và khoảng 160 dao động/min.
G.3. Phiên mã
Thêm 1 ng đến 100 ng vật liệu kiểm soát dsADN đã tinh sạch trước vào
các tế bào khả biến chủng JM109 (50 ± 0,5) µl và trộn kỹ. Làm lạnh trên đá
trong (20 ± 1) min.
Ủ ở (42 ± 1) °C trong (45 ± 2) s sau đó làm lạnh ngay trên đá trong
(120 ± 10) s.
Thêm (950 ± 10) µl canh thang LB vào các giếng sau đó lắc ở (37 ± 1) °C
khoảng 160 dao động/min trong (90 ± 10) min.
Gạt (100 ± 2) µl canh thang đã ủ lên đĩa thạch LB có bổ sung 50 µg/ml
amplicilin.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
G.4. Tinh sạch ADN plasmid
Ủ (5 ± 0,1) ml canh thang LB bổ sung 100 µg/ml ampicilin có khuẩn lạc
đơn lẻ chứa plasmid quan tâm.
Ủ ở (37 ± 1) °C qua đêm.
Tinh sạch ADN plasmid từ dịch nuôi cấy sử dụng thuốc thử minprep theo
quy trình thích hợp; rửa giải trong (100 ± 2) µl đệm rửa giải.
Bảo quản gốc ADN plasmid ở (–20 ± 5) °C cho đến khi cần để chuẩn bị
vật liệu kiểm soát dsADN (5.3.8).
G.5. Định lượng ADN plasmid
Sử dụng máy đo quang phổ xác định độ hấp thụ của gốc plasmid ở 260
nm.
Nhân độ hấp thụ đọc được với 5 x 10-8 để cho nồng độ của
ADN, tính bằng gam trên microlit.
Chia số này cho khối lượng phân tử plasmid đơn lẻ, tính bằng gam, để
tính nồng độ của ADN, tính bằng số bản sao trong một microlit.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
PHỤ LỤC H
(Tham khảo)
QUÁ TRÌNH TẠO CÁC GỐC ARN KIỂM SOÁT BÊN NGOÀI (EC ARN)
H.1. Yêu cầu chung
Các plasmid kiểm soát được tạo thành bằng cách thắt trình tự ADN đích
thành một vector plasmid thích hợp sao cho trình tự đích là xuôi của trình tự
xúc tác đối với ARN polymerase.
H.2. Thuốc thử và thiết bị, dụng cụ
H.2.1. Enzym giới hạn dùng để tạo tuyến
tính và các dung dịch đệm kết hợp.
H.2.2. Thuốc thử tinh sạch PCR.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
H.2.4. DNase không chứa RNase.
H.2.5. Thuốc thử tinh sạch ARN
H.2.6. Thuốc thử và thiết bị điện di trên gel ADN.
H.2.7. Thuốc thử và thiết bị real-time RT-PCR một bước (sử dụng mẫu dò thủy phân).
H.2.8. Tủ ấm, có thể duy trì ở (37 ± 1) °C
H.3. Tạo tuyến tính ADN plasmid
Cho 100 ng đến 500 ng ADN plasmid kiểm soát đã tinh sạch vào hỗn hợp
phản ứng chứa enzym giới hạn thích hợp (để có tuyến tính plasmid ở điểm bắt đầu
xuôi của trình tự đích) và các dung dịch đệm theo khuyến cáo của nhà sản xuất
enzym.
Ủ ở (37 ± 1) °C trong (120 ± 5) min.
Tinh sạch ADN từ hỗn hợp mastermix sử dụng thuốc thử tinh sạch PCR,
rửa giải trong (50 ± 0,5) µl dung dịch đệm rửa giải.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
H.4. Phiên mã ARN in vitro
Cho 100 ng đến 500 ng plasmid ADN tuyến tính đã tinh sạch vào hỗn hợp
phản ứng phiên mã ARN in vitro đã chuẩn bị theo khuyến cáo của nhà sản
xuất enzym ARN polymerase .
Ủ ở (37 ± 1) °C trong (120 ± 5) min.
Tinh sạch ARN sử dụng thuốc thử tinh sạch ARN, rửa giải trong (100 ±
1) µl nước (5.2.1).
H.5. Kiểm tra việc nhiễm ADN
Chuẩn bị hỗn hợp mastermix real-time RT-PCR đích đặc hiệu (5.3.7),
tách thành hai phần và bất hoạt enzym RT trong một phần bằng cách gia nhiệt ở
(95 ± 2) °C trong (5,0 ± 0,5) min.
Dùng cả hai phần hỗn hợp mastemix phụ thuộc EC ARN gốc vào real-time
RT-PCR dọc theo dãy dịch pha loãng dsADN làm đường chuẩn (8.4).
Nếu mức có thể phát hiện được trong phần EC ARN gốc được thử nghiện
với hỗn hợp mastemix đã xử lý nhiệt lớn hơn 0,1 % so với mức trong phần mẫu thử
với hỗn hợp mastermix chưa xử lý nhiệt (nếu chênh lệch Cq
giữa EC ARN gốc được thử với hỗn hợp mastermix xử lý nhiệt và hỗn hợp mastermix
chưa xử lý nhiệt nhỏ hơn 10 đối với đường chuẩn dsADN có độ dốc lý tưởng –3,32)
thì EC ARN gốc bị nhiễm ADN và phải được xử lý lại bằng DNase (I.3). Nếu mức
phát hiện nhỏ hơn 0,1 % thì bảo quản ở (–20 ± 5) °C cho đến khi cần để chuẩn bị
vật liệu kiểm soát EC ARN (5.3.8).
H.6. Định lượng EC ARN
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nhân độ hấp thụ đọc được với 4 x 10-8 để được nồng độ của
ARN, tính bằng gam trên microlit.
Chia số này cho khối lượng phân tử EC ARN đơn lẻ, tính bằng gam, để
tính nồng độ ARN, tính bằng số bản sao trong một microlit.
Khối lượng của từng phân tử ARN có thể tính được bằng cách nhân chiều
dài ARN trong ribonucleotid với 320,5 (khối lượng phân tử tương đối trung bình
của ribonucleotid) và chia cho hệ số Avogadro (6,02 x 1023), ví dụ:
phân tử ARN của 200 ribonucleotid có khối lượng là 1,06 x 10-19 g.
PHỤ LỤC I
(Tham khảo)
SƠ ĐỒ ĐĨA QUANG ĐIỂN HÌNH
Bảng I.1 – Sơ đồ đĩa quang điển hình
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] BOOM R., SOL C.J., SALIMANS M.M., JANSEN C.L., WERTHEIM-VAN
DILLEN P.M., VAN DER NOORDAA J. Rapid and simple method for purification of
nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 1990, 28pp. 495-503.
[2] COSTAFREDA M.I., BOSCH A., PINTÓ R.M. Development, evaluation,
and standardization of a real- time TaqMan reverse transcription-PCR assay for
quantification of hepatitis A virus in clinical and shellfish samples. Appl.
Environ. Microbiol. 2006, 72pp. 3846-3855.
[3] dA SILVA A.K., LE SAUX J.C., PARNAUDEAU S., POMMEPUY M.,
ELIMELECH M., LE GUYADER F.S. Evaluation of removal of noroviruses during
wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: Different
behaviors of genogroups I and II. Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73pp. 7891-7897.
[4] SVRAKA S., DUIZER E., VENNEMA H., dE BRUIN E., VAN DER VEER B.,
DORRESTEIJN B. et al. Etiological role of viruses in outbreaks of acute
gastroenteritis in The Netherlands from 1994 through 2005. J. Clin.
Microbiol. 2007, 45pp. 1389-1394.
[5] LOISY F., ATMAR R.L., GUILLON P., LE CANN P., POMMEPUY M., LE
GUYADER F.S. Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish. J.
Virol. Methods. 2005, 123pp. 1-7.
[6] KACEYAMA T., KOJIMA S., SHINOHARA M., UCHIDA K., FUKUSHI S.,
HOSHINO F.B. et al. Broadly reactive and highly sensitive assay for
Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR.
J. Clin. Microbiol. 2003, 41pp. 1548-1557.
[7] LE GUYADER F.S., PARNAUDEAU S., SCHAEFFER J., BOSCH A., LOISY F.,
POMMEPUY M. et al. Detection and quantification of noroviruses in shellfish. Appl.
Environ. Microbiol. 2009, 75pp. 618-624.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[9] MARTIN L.R., DUKE G.M., OSORIO J.E., HALL D.J., PALMENBERG A.C.
Mutational analysis of the mengovirus poly(C) tract and surrounding
heteropolymeric sequences. J. Virol. 1996, 70pp.2027-2031.
[10] TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi – Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.
[11] ISO 22118, Microbiology of food and animal feeding stuffs –
Polymerase chain reaction (PCR) for the detection and quantification of
food-borne pathogens – Performance characteristics.
[12] ISO 22119, Microbiology of food and animal feeding stuffs –
Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne
pathogens – General requirements and definitions.
[1]) Invitrogen RNA
UltrasenseTM là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp từ
Invitrogen. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người tiêu chuẩn này và
không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết
quả tương đương.
[2] ATCC® VR-1597TM và ATCC® CCL-2TM
là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp từ Viện giữ giống mẫu của Mỹ
(American type culture collection). Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho
người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng
các sản phẩm tương tự nếu được chứng minh là đáp ứng được các yêu cầu của quy
trình.
[3] BioMerieux NucliSens® là tên thương mại của sản phẩm được
cung cấp từ BioMerieux. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng
tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm
tương tự nếu cho kết quả tương đương.
[4] Bacto trypton là sản phẩm có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận
tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng.