TIÊU
CHUẨN QUỐC GIA
TCVN
10562:2015
SỮA - PHÁT HIỆN CHẤT KHÁNG SINH BẰNG CÁCH
PHÂN TÍCH VI KHUẨN CẢM THỤ
Milks
- Detection of antimicrobial drugs by microbial receptor assay
Lời nói đầu
TCVN 10562:2015 được xây
dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 988.08 Antimicrobial drugs in milk. Microbial
receptor assay;
TCVN 10562:2015 do
Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn,
Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công
bố.
SỮA
- PHÁT HIỆN CHẤT KHÁNG SINH BẰNG CÁCH PHÂN TÍCH VI KHUẨN CẢM THỤ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn
này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm.
Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan
đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao
tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước
khi sử dụng tiêu chuẩn.
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy
định phương pháp sử dụng vi khuẩn cảm thụ để phát hiện các chất kháng sinh có
trong sữa.
Phương pháp này đã
được đánh giá xác nhận với các nồng độ kháng sinh như sau:
penicillin G:
4,8 ng/ml
chlindamycin:
400 ng/ml
cephapirin:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
sulfamethazine:
75 ng/ml
cloxacillin:
100 ng/ml
sulfamethoxazole:
50 ng/ml
chlorotetracycline:
2 000 ng/ml
sulfasoxazole:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
oxytetracycline:
2 000 ng/ml
streptomycin:
1 000 ng/ml
tetracycline:
2 000 ng/ml
novobiocin:
50 ng/ml
erythromycin:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
chloramphenicol:
800 ng/ml
lincomycin:
400 ng/ml
2. Nguyên tắc
Phép thử được dựa trên
phản ứng gắn kết giữa các nhóm chức của chất vào vị trí cảm thụ trên các tế bào
vi khuẩn được thêm vào. Liên kết 14C hoặc 3H được đo bằng máy đếm phát sáng nhấp nháy
(4.5) và được so sánh với sữa chuẩn zero để phát hiện các chất kháng sinh. Hàm
lượng chất kháng sinh có trong mẫu càng lớn thì số đếm càng thấp. Phương pháp này
không phát hiện các chất chuyển hóa mà chỉ phát hiện kháng sinh hoạt tính.
3. Thuốc thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.1. Chất lỏng phát
sáng nhấp nháy,
ví dụ: Optifluor (của hãng Packard Instrument Co., 2200 Warrenville Rd, Downers
Grove, IL 60515, USA) hoặc loại tương đương.
3.2. Chất gắn kết vi
khuẩn
3.2.1. Thuốc thử D, huyền phù vi khuẩn Bacillus
stearothermophilus đông khô.
Thuốc thử này bền
được 1 năm khi bảo quản ở -20 oC. Khi được hoàn nguyên với dung môi D (3.5)
thì có thể bền được 1 tuần nếu bảo quản ở -20 oC hoặc bền được 24 h
nếu bảo quản ở -5 oC. Mỗi phép thử cần khoảng
1 × 108 tế bào trong 200 ml để gắn kết nhóm beta-lactam,
tetracycline, streptomycin, macrolide và novobiocin.
3.2.2. Thuốc thử R
Huyền phù của vi sinh
vật bất hoạt đã được chiếu xạ và làm đông khô, với các vị trí cảm thụ đối với
các sulfonamide và chloramphenicol (các vi sinh vật bị ức chế bằng các thuốc
này chiếm các vị trí cảm thụ yêu cầu). Thuốc thử này bền được 1 năm khi bảo quản
ở -20 oC ở dạng đông khô
hoặc bền được 6 h nếu bảo quản ở -5 oC khi đã được hoàn nguyên. Mỗi phép thử cần khoảng
1 × 109 tế bào trong 200 ml để gắn kết sulfonamide và
chloramphenicol.
3.3. Thuốc thử đánh
dấu (phát hiện) kháng sinh
3.3.1. Penicillin 14C, 125 µCi/µmol,
0,0024 µCi cho một phép thử.
3.3.2. Tetracycline 3H, 0,5 µCi/µmol,
0,052 µCi cho một phép thử.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.3.4. Streptomycin 3H, 26 µCi/mmol,
0,0185 µCi cho một phép thử.
3.3.5. Novobiocin 3H, 55 µCi/mmol,
0,0148 µCi cho một phép thử.
3.3.6. Sulfamethazine 3H, 59 µCi/mmol,
0,0311 µCi cho một phép thử.
3.3.7. Chloramphenicol 14C, 35 µCi/mmol,
0,0126 µCi cho một phép thử.
Thuốc thử đánh dấu kháng
sinh được bổ sung chất làm ổn định để duy trì hoạt tính sinh học. Các thuốc thử
này ở dạng đông khô có thể bền trên 12 tháng nếu được bảo quản ở -20 oC và khi đã được hoàn
nguyên thì có thể bền được 2 tuần khi bảo quản ở -20 °C.
Trong một số trường
hợp nhất định, các chất đánh dấu 14C và 3H được kết hợp để giúp cho việc sàng lọc
nhiều hơn một nhóm trong mỗi ống. Điều này áp dụng với penicillin 14C và tetracycline 3H cũng như đối với
erythromycin 14C và streptomycin 3H.
3.4. Dung môi C, dung dịch propylen glycol
70 % để hoàn nguyên các chất kháng sinh đánh dấu phóng xạ.
3.5. Dung môi D, dung dịch chứa
sucrose 5 %, dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 %, natri clorua (NaCl)
1,2 % để hoàn nguyên
các vi sinh vật gắn kết đối với thuốc thử D và thuốc thử R.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị,
dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:
4.1. Bộ gia nhiệt, có hai tấm nhôm anot
hóa, mỗi tấm có sáu lỗ sâu 5,23 cm, đường kính 1,35 cm, kiểm soát được nhiệt độ
ở 45 °C ± 1 °C và 85 °C ± 1 °C, để giữ các ống nghiệm kích thước 13 mm × 10 mm.
4.2. Bộ trộn, ví dụ kiểu Maxi II
của Thermolyne Corp., 2555 Kerper Blvd, Dubuque, IA 52001, USA hoặc tương
đương.
4.3. Máy ly tâm, tạo được gia tốc
hướng tâm 1 300g.
4.4. Tấm làm lạnh, để giữ các lọ đựng chất
phát sáng ở -3 °C đến -5 °C.
4.5. Máy đếm phát
sáng nhấp nháy,
phù hợp với ống thủy tinh 13 mm × 100 mm. Ở mức cài đặt nhỏ hơn 10 %, kênh 3H bắt chéo với kênh 14C và nhỏ hơn 30o thì kênh 14C bắt chéo với kênh 3H. Thời gian đếm là 1
min. Năng suất phải lớn hơn 80 %. Độ lặp lại ở 1 000 r/min là khoảng 10 %.
4.6. Ống phân phối
chất lỏng phát sáng nhấp nháy, ví dụ của hãng Oxford (Monoject Scientific,
1831 Olive St, St. Louis, MO 63103, USA) hoặc tương đương.
4.7. Chai rửa.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.9. Lọ đựng chất
phát sáng bằng chất dẻo, dung tích 7 ml.
4.10. Pipet, có thể phân phối
các lượng 200 µl, 300 µl và 5 ml.
4.11. Khăn bông.
4.12. Máy trộn
vortex.
5. Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không
quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) [1].
Mẫu gửi đến phòng thử
nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt
quá trình bảo quản và vận chuyển.
6. Cách tiến hành
6.1. Hoàn nguyên
thuốc thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Cho dung môi C (3.4) ở
nhiệt độ phòng vào chất đánh dấu (3.3) đông khô. Hòa tan ngay. Lấy lượng thuốc
thử cần dùng cho một ngày vào lọ nhựa có nắp vặn (4.9). Đặt lọ này lên tấm làm
lạnh (4.4) ở -3 °C đến -5 °C đến 24 h. Bảo quản chất đánh dấu dạng lỏng còn lại
ở -20 oC đến 2 tuần. Các lọ
nhựa nhỏ có thể được làm đầy lại khi bảo quản ở -20 oC, khi cần.
6.1.2. Thuốc thử gắn
kết vi khuẩn
Hoàn nguyên thuốc thử
D (3.2.1) bằng cách bổ sung một lượng dung môi D (3.5) ở 4 oC theo hướng dẫn ghi
trên nhãn, thường là 12 ml. Sử dụng ống nghiệm thủy tinh (4.8) và máy trộn
vortex (4.12) để làm vỡ các mảng tế bào. Trộn kỹ. Làm ấm thuốc thử D đã hoàn nguyên
đến nhiệt độ phòng (khoảng 25 oC) và giữ ở nhiệt độ này khoảng 5 min. Phân
phối vào các lọ nhỏ (4.9) và đặt trên tấm làm lạnh (4.4) ở - 5 oC để sử dụng hoặc bảo
quản ở -20 oC. Thuốc thử D có thể
bảo quản được 1 tuần ở -20 oC hoặc trong 12 h ở -5 oC. Rã đông thuốc thử
D bằng cách để dưới vòi nước (khoảng 20 oC) trong 5 min và đặt trên tấm làm
lạnh nhiều hơn 5 min trước khi sử dụng.
Hoàn nguyên thuốc thử
R (3.2.2) bằng cách bổ sung một lượng dung môi D (3.5) theo hướng dẫn trên
nhãn. Trộn kỹ. Thuốc thử R được bảo quản trên tấm làm lạnh ở nhiệt độ -5 oC trong 6 h.
6.2. Hướng dẫn chung
6.2.1. Lượng 14C và 3H quy định
Lượng chất phóng xạ
được sử dụng trong phương pháp này đủ thấp để được miễn trừ theo quy định.
6.2.2. Xử lý chất
lỏng phát sáng nhấp nháy
Các chất lỏng phát sáng
nhấp nháy dễ hòa tan hoặc phân tán trong nước (3.1) có chứa nồng độ 3H hoặc 14C nhỏ hơn 0,05 μCi/g
dung dịch có thể được phân tán trong một lượng lớn nước qua hệ thống thoát nước thải (trong phép thử này sử dụng 2,8
g Optifluor). Tỷ lệ nước chảy vào chất lỏng phát sáng nhấp nháy nên lớn hơn 10:1.
Hệ phân tán có thể bị đục do sự có mặt của hydrocarbon có điểm sôi cao. Cần tuân
thủ các quy định hiện hành về phòng chống cháy nổ.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kiểm tra các thuốc thử
và dụng cụ thử nghiệm bằng cách phân tích sữa chuẩn zero. So sánh với các kết
quả sữa zero trước đó hoặc số đếm điển hình do nhà sản xuất cung cấp kèm theo thuốc
thử. Nếu kết quả tương thích thì tiến hành phép xác định.
Gộp các thuốc thử đánh
dấu (3.3) như sau: penicillin với tetracycline (P và T), erythromycin với
streptomycin (E và St), novobiocin (N), sulfonamide với các chất tương tự PABA (axit
para- aminobenzoic) khác (Sm), chloramphenicol (C).
Đánh dấu 5 ống
nghiệm: (P và T), (E và St), (N), (Sm), (C).
Dùng pipet lấy trực tiếp
200 µl thuốc thử đánh dấu, cho xuống đáy ống nghiệm tương ứng. Làm sạch pipet
trước mỗi lần thêm.
Riêng đối với
chloramphenicol, thêm 300 µl thuốc thử NH (3.6). Thêm 5 ml phần mẫu thử vào mỗi
ống nghiệm.
Nhẹ nhàng thêm 200 µl
thuốc thử D vào các ống nghiệm chứa (P và T), (E và St) và (N). Thêm thuốc thử
R (3.2.2) vào các ống có (Sm) và (C).
Trộn bằng cách xoay và
để yên ống nghiệm khoảng 10 lần để cho thuốc thử được phân bố đều, thời gian
này kéo dài khoảng 10 s.
Ủ các ống nghiệm chứa
(P và T), (E và St) trong 3 min ở 85 °C; ủ các ống chứa (N), (Sm) và (C) trong 3
min ở 45 °C trong bộ gia nhiệt (4.1).
Ly tâm các ống nghiệm
3 min và sau đó gạn bỏ hoàn toàn sữa.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thêm 300 µl nước và
dùng máy trộn (4.12) hòa tan phần còn lại.
Cho vào mỗi ống
nghiệm 3 ml chất lỏng phát sáng nhấp nháy, đậy nắp và lắc nhẹ ống.
Đo hoạt độ trên kênh 3H và 14C của máy phân tích.
Đọc giá trị đối với (T), (St), (N) và (Sm) trên kênh 3H và đối với (P), (E)
và (C) trên kênh 14C.
Ghi lại số liệu cao hơn
điểm kiểm soát đối với mẫu thử âm tính hoặc thấp hơn đối với mẫu thử dương
tính. Điểm kiểm soát là con số ở khoảng 3 lần độ lệch chuẩn từ trung bình của sáu
mẫu zero. Lặp lại phép phân tích đối với các mẫu dương tính.
6.4. Dương tính kép
Để xác định hai kết quả
dương tính trên một ống có đúng là dương tính kép hay là kết quả của một dương
tính đơn và một lần “xen giữa” các kênh 3H và 14C, lặp lại hai lần
phép xác định trên phần mẫu thử với các chất đánh dấu riêng lẻ và so sánh với
hai phép xác định mẫu zero được tiến hành với các chất đánh dấu riêng lẻ. Nếu kết
quả của chất đánh dấu riêng lẻ trùng với kết quả của chất đánh dấu riêng lẻ
zero, thì có thể nói “dương tính” là do xen giữa.
6.5. Xác định điểm
kiểm soát
Cài đặt điểm kiểm
soát bằng hoặc lớn hơn 3 lần độ lệch chuẩn từ giá trị trung bình mẫu zero. Để
thuận tiện, dùng phần trăm để ước tính 3 lần độ lệch chuẩn.
Đối với penicillin, sử
dụng khoảng 2,5 lần độ lệch chuẩn vì phải xác định được nồng độ nhỏ hơn 0,008 IU/ml
để phù hợp với đĩa chuẩn phân tích B. stearothermophilus.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng
1 - Số trừ sử dụng để xác định điểm kiểm soát tương ứng với các chất kháng sinh
Tên
kháng sinh
Tỷ
lệ phần trăm được trừ từ trung bình mẫu zero
Beta-lactam
15
Tetracycline
20
Macrolide
20
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
25
Novobiocin
20
Sulfonamide
20
Chloramphenicol
20
7. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải
ghi rõ:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
b) phương pháp lấy
mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã
sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác chi
tiết không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có
thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm
thu được.
THƯ
MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 6400 (ISO
707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.