Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10562:2015 về Sữa - Phát hiện chất kháng sinh bằng cách phân tích vi khuẩn cảm thụ

• Số hiệu: TCVN10562:2015
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2015

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10562:2015

SỮA - PHÁT HIỆN CHẤT KHÁNG SINH BẰNG CÁCH PHÂN TÍCH VI KHUẨN CẢM THỤ

Milks - Detection of antimicrobial drugs by microbial receptor assay

Lời nói đầu

TCVN 10562:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 988.08 Antimicrobial drugs in milk. Microbial receptor assay;

TCVN 10562:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỮA - PHÁT HIỆN CHẤT KHÁNG SINH BẰNG CÁCH PHÂN TÍCH VI KHUẨN CẢM THỤ

...

...

...

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng vi khuẩn cảm thụ để phát hiện các chất kháng sinh có trong sữa.

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận với các nồng độ kháng sinh như sau:

penicillin G:

4,8 ng/ml

chlindamycin:

400 ng/ml

cephapirin:

...

...

...

sulfamethazine:

75 ng/ml

cloxacillin:

100 ng/ml

sulfamethoxazole:

50 ng/ml

chlorotetracycline:

2 000 ng/ml

sulfasoxazole:

...

...

...

oxytetracycline:

2 000 ng/ml

streptomycin:

1 000 ng/ml

tetracycline:

2 000 ng/ml

novobiocin:

50 ng/ml

erythromycin:

...

...

...

chloramphenicol:

800 ng/ml

lincomycin:

400 ng/ml

2. Nguyên tắc

Phép thử được dựa trên phản ứng gắn kết giữa các nhóm chức của chất vào vị trí cảm thụ trên các tế bào vi khuẩn được thêm vào. Liên kết ^14C hoặc ^3H được đo bằng máy đếm phát sáng nhấp nháy (4.5) và được so sánh với sữa chuẩn zero để phát hiện các chất kháng sinh. Hàm lượng chất kháng sinh có trong mẫu càng lớn thì số đếm càng thấp. Phương pháp này không phát hiện các chất chuyển hóa mà chỉ phát hiện kháng sinh hoạt tính.

3. Thuốc thử

...

...

...

3.1. Chất lỏng phát sáng nhấp nháy, ví dụ: Optifluor (của hãng Packard Instrument Co., 2200 Warrenville Rd, Downers Grove, IL 60515, USA) hoặc loại tương đương.

3.2. Chất gắn kết vi khuẩn

3.2.1. Thuốc thử D, huyền phù vi khuẩn Bacillus stearothermophilus đông khô.

Thuốc thử này bền được 1 năm khi bảo quản ở -20 ^oC. Khi được hoàn nguyên với dung môi D (3.5) thì có thể bền được 1 tuần nếu bảo quản ở -20 ^oC hoặc bền được 24 h nếu bảo quản ở -5 ^oC. Mỗi phép thử cần khoảng 1 × 10^8 tế bào trong 200 ml để gắn kết nhóm beta-lactam, tetracycline, streptomycin, macrolide và novobiocin.

3.2.2. Thuốc thử R

Huyền phù của vi sinh vật bất hoạt đã được chiếu xạ và làm đông khô, với các vị trí cảm thụ đối với các sulfonamide và chloramphenicol (các vi sinh vật bị ức chế bằng các thuốc này chiếm các vị trí cảm thụ yêu cầu). Thuốc thử này bền được 1 năm khi bảo quản ở -20 ^oC ở dạng đông khô hoặc bền được 6 h nếu bảo quản ở -5 ^oC khi đã được hoàn nguyên. Mỗi phép thử cần khoảng 1 × 10^9 tế bào trong 200 ml để gắn kết sulfonamide và chloramphenicol.

3.3. Thuốc thử đánh dấu (phát hiện) kháng sinh

3.3.1. Penicillin ^14C, 125 µCi/µmol, 0,0024 µCi cho một phép thử.

3.3.2. Tetracycline ^3H, 0,5 µCi/µmol, 0,052 µCi cho một phép thử.

...

...

...

3.3.4. Streptomycin ^3H, 26 µCi/mmol, 0,0185 µCi cho một phép thử.

3.3.5. Novobiocin ^3H, 55 µCi/mmol, 0,0148 µCi cho một phép thử.

3.3.6. Sulfamethazine ^3H, 59 µCi/mmol, 0,0311 µCi cho một phép thử.

3.3.7. Chloramphenicol ^14C, 35 µCi/mmol, 0,0126 µCi cho một phép thử.

Thuốc thử đánh dấu kháng sinh được bổ sung chất làm ổn định để duy trì hoạt tính sinh học. Các thuốc thử này ở dạng đông khô có thể bền trên 12 tháng nếu được bảo quản ở -20 ^oC và khi đã được hoàn nguyên thì có thể bền được 2 tuần khi bảo quản ở -20 °C.

Trong một số trường hợp nhất định, các chất đánh dấu ^14C và ^3H được kết hợp để giúp cho việc sàng lọc nhiều hơn một nhóm trong mỗi ống. Điều này áp dụng với penicillin ^14C và tetracycline ^3H cũng như đối với erythromycin ^14C và streptomycin ^3H.

3.4. Dung môi C, dung dịch propylen glycol 70 % để hoàn nguyên các chất kháng sinh đánh dấu phóng xạ.

3.5. Dung môi D, dung dịch chứa sucrose 5 %, dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 %, natri clorua (NaCl)

1,2 % để hoàn nguyên các vi sinh vật gắn kết đối với thuốc thử D và thuốc thử R.

...

...

...

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

4.1. Bộ gia nhiệt, có hai tấm nhôm anot hóa, mỗi tấm có sáu lỗ sâu 5,23 cm, đường kính 1,35 cm, kiểm soát được nhiệt độ ở 45 °C ± 1 °C và 85 °C ± 1 °C, để giữ các ống nghiệm kích thước 13 mm × 10 mm.

4.2. Bộ trộn, ví dụ kiểu Maxi II của Thermolyne Corp., 2555 Kerper Blvd, Dubuque, IA 52001, USA hoặc tương đương.

4.3. Máy ly tâm, tạo được gia tốc hướng tâm 1 300g.

4.4. Tấm làm lạnh, để giữ các lọ đựng chất phát sáng ở -3 °C đến -5 °C.

4.5. Máy đếm phát sáng nhấp nháy, phù hợp với ống thủy tinh 13 mm × 100 mm. Ở mức cài đặt nhỏ hơn 10 %, kênh ^3H bắt chéo với kênh ^14C và nhỏ hơn 30^o thì kênh ^14C bắt chéo với kênh ^3H. Thời gian đếm là 1 min. Năng suất phải lớn hơn 80 %. Độ lặp lại ở 1 000 r/min là khoảng 10 %.

4.6. Ống phân phối chất lỏng phát sáng nhấp nháy, ví dụ của hãng Oxford (Monoject Scientific, 1831 Olive St, St. Louis, MO 63103, USA) hoặc tương đương.

4.7. Chai rửa.

...

...

...

4.9. Lọ đựng chất phát sáng bằng chất dẻo, dung tích 7 ml.

4.10. Pipet, có thể phân phối các lượng 200 µl, 300 µl và 5 ml.

4.11. Khăn bông.

4.12. Máy trộn vortex.

5. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) ^[1].

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

6. Cách tiến hành

6.1. Hoàn nguyên thuốc thử

...

...

...

Cho dung môi C (3.4) ở nhiệt độ phòng vào chất đánh dấu (3.3) đông khô. Hòa tan ngay. Lấy lượng thuốc thử cần dùng cho một ngày vào lọ nhựa có nắp vặn (4.9). Đặt lọ này lên tấm làm lạnh (4.4) ở -3 °C đến -5 °C đến 24 h. Bảo quản chất đánh dấu dạng lỏng còn lại ở -20 ^oC đến 2 tuần. Các lọ nhựa nhỏ có thể được làm đầy lại khi bảo quản ở -20 ^oC, khi cần.

6.1.2. Thuốc thử gắn kết vi khuẩn

Hoàn nguyên thuốc thử D (3.2.1) bằng cách bổ sung một lượng dung môi D (3.5) ở 4 ^oC theo hướng dẫn ghi trên nhãn, thường là 12 ml. Sử dụng ống nghiệm thủy tinh (4.8) và máy trộn vortex (4.12) để làm vỡ các mảng tế bào. Trộn kỹ. Làm ấm thuốc thử D đã hoàn nguyên đến nhiệt độ phòng (khoảng 25 ^oC) và giữ ở nhiệt độ này khoảng 5 min. Phân phối vào các lọ nhỏ (4.9) và đặt trên tấm làm lạnh (4.4) ở - 5 ^oC để sử dụng hoặc bảo quản ở -20 ^oC. Thuốc thử D có thể bảo quản được 1 tuần ở -20 ^oC hoặc trong 12 h ở -5 ^oC. Rã đông thuốc thử D bằng cách để dưới vòi nước (khoảng 20 ^oC) trong 5 min và đặt trên tấm làm lạnh nhiều hơn 5 min trước khi sử dụng.

Hoàn nguyên thuốc thử R (3.2.2) bằng cách bổ sung một lượng dung môi D (3.5) theo hướng dẫn trên nhãn. Trộn kỹ. Thuốc thử R được bảo quản trên tấm làm lạnh ở nhiệt độ -5 ^oC trong 6 h.

6.2. Hướng dẫn chung

6.2.1. Lượng ^14C và ^3H quy định

Lượng chất phóng xạ được sử dụng trong phương pháp này đủ thấp để được miễn trừ theo quy định.

6.2.2. Xử lý chất lỏng phát sáng nhấp nháy

Các chất lỏng phát sáng nhấp nháy dễ hòa tan hoặc phân tán trong nước (3.1) có chứa nồng độ ^3H hoặc ^14C nhỏ hơn 0,05 μCi/g dung dịch có thể được phân tán trong một lượng lớn nước qua hệ thống thoát nước thải (trong phép thử này sử dụng 2,8 g Optifluor). Tỷ lệ nước chảy vào chất lỏng phát sáng nhấp nháy nên lớn hơn 10:1. Hệ phân tán có thể bị đục do sự có mặt của hydrocarbon có điểm sôi cao. Cần tuân thủ các quy định hiện hành về phòng chống cháy nổ.

...

...

...

Kiểm tra các thuốc thử và dụng cụ thử nghiệm bằng cách phân tích sữa chuẩn zero. So sánh với các kết quả sữa zero trước đó hoặc số đếm điển hình do nhà sản xuất cung cấp kèm theo thuốc thử. Nếu kết quả tương thích thì tiến hành phép xác định.

Gộp các thuốc thử đánh dấu (3.3) như sau: penicillin với tetracycline (P và T), erythromycin với streptomycin (E và St), novobiocin (N), sulfonamide với các chất tương tự PABA (axit para- aminobenzoic) khác (Sm), chloramphenicol (C).

Đánh dấu 5 ống nghiệm: (P và T), (E và St), (N), (Sm), (C).

Dùng pipet lấy trực tiếp 200 µl thuốc thử đánh dấu, cho xuống đáy ống nghiệm tương ứng. Làm sạch pipet trước mỗi lần thêm.

Riêng đối với chloramphenicol, thêm 300 µl thuốc thử NH (3.6). Thêm 5 ml phần mẫu thử vào mỗi ống nghiệm.

Nhẹ nhàng thêm 200 µl thuốc thử D vào các ống nghiệm chứa (P và T), (E và St) và (N). Thêm thuốc thử R (3.2.2) vào các ống có (Sm) và (C).

Trộn bằng cách xoay và để yên ống nghiệm khoảng 10 lần để cho thuốc thử được phân bố đều, thời gian này kéo dài khoảng 10 s.

Ủ các ống nghiệm chứa (P và T), (E và St) trong 3 min ở 85 °C; ủ các ống chứa (N), (Sm) và (C) trong 3 min ở 45 °C trong bộ gia nhiệt (4.1).

Ly tâm các ống nghiệm 3 min và sau đó gạn bỏ hoàn toàn sữa.

...

...

...

Thêm 300 µl nước và dùng máy trộn (4.12) hòa tan phần còn lại.

Cho vào mỗi ống nghiệm 3 ml chất lỏng phát sáng nhấp nháy, đậy nắp và lắc nhẹ ống.

Đo hoạt độ trên kênh ^3H và ^14C của máy phân tích. Đọc giá trị đối với (T), (St), (N) và (Sm) trên kênh ^3H và đối với (P), (E) và (C) trên kênh ^14C.

Ghi lại số liệu cao hơn điểm kiểm soát đối với mẫu thử âm tính hoặc thấp hơn đối với mẫu thử dương tính. Điểm kiểm soát là con số ở khoảng 3 lần độ lệch chuẩn từ trung bình của sáu mẫu zero. Lặp lại phép phân tích đối với các mẫu dương tính.

6.4. Dương tính kép

Để xác định hai kết quả dương tính trên một ống có đúng là dương tính kép hay là kết quả của một dương tính đơn và một lần “xen giữa” các kênh ^3H và ^14C, lặp lại hai lần phép xác định trên phần mẫu thử với các chất đánh dấu riêng lẻ và so sánh với hai phép xác định mẫu zero được tiến hành với các chất đánh dấu riêng lẻ. Nếu kết quả của chất đánh dấu riêng lẻ trùng với kết quả của chất đánh dấu riêng lẻ zero, thì có thể nói “dương tính” là do xen giữa.

6.5. Xác định điểm kiểm soát

Cài đặt điểm kiểm soát bằng hoặc lớn hơn 3 lần độ lệch chuẩn từ giá trị trung bình mẫu zero. Để thuận tiện, dùng phần trăm để ước tính 3 lần độ lệch chuẩn.

Đối với penicillin, sử dụng khoảng 2,5 lần độ lệch chuẩn vì phải xác định được nồng độ nhỏ hơn 0,008 IU/ml để phù hợp với đĩa chuẩn phân tích B. stearothermophilus.

...

...

...

Bảng 1 - Số trừ sử dụng để xác định điểm kiểm soát tương ứng với các chất kháng sinh

Tên kháng sinh

Tỷ lệ phần trăm được trừ từ trung bình mẫu zero

Beta-lactam

15

Tetracycline

20

Macrolide

20

...

...

...

25

Novobiocin

20

Sulfonamide

20

Chloramphenicol

20

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

...

...

...

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.