Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10137:2013 Phomat – Xác định hàm lượng nisin A bằng sắc ký lỏng

• Số hiệu: TCVN10137:2013
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2013

Điều kiện	LC-MS			LC-MS-MS
Thể tích bơm, ml	5			10
Cột	PLRP-S ^4^) 150 mm x 2 mm, 300 Å, 3 mm
Nhiệt độ cột, °C	40			30
Detector khối lượng	Chế độ ion ESI+ Nhiệt độ mẫu 500 °C Điện áp 3,5 kV			Chế độ ion ESI+ Nitơ 8 l/min 350 °C
Phát hiện	m/z 839,6 ^a) span 0,5 thời gian dừng 1,0 min Cone 60 V			m/z Q1/m/z Q3, 672/672 ^b 672/811 ^c) (chuyển dịch chọn lọc nhất) 672/649 840/840^b
Tốc độ dòng, ml/min	0.25			0,20
Thời gian lưu nisin A, min	~ 13			~ 5,7
Gradient^d	Min.	%A	%B	Min.	%C	%D
	0	70	30	0	85	15
	13	50	50	1	85	15
	13,1	0	100	4	65	35
	17	0	100	6	65	35
	17,1	70	30	9	10	90
	23	70	30	12	10	90
				12,1	85	15
				16	85	15
Về tổng thể, các thông số MS hoặc MS-MS là tới hạn và phải được kiểm soát chặt để đạt được độ nhạy và độ lặp lại vì có nhiều yếu tố phân tích khác nhau. Tối ưu hóa thiết bị để tạo ra tín hiệu cao nhất đối với nisin.
^a Độ nhạy cao hơn đối với các ion m/z 1 118,9+3 ([M+3H]^3+) hoặc m/z 1 677,7+2 ([M+2H]^2+) đã quan sát được trong nhiều phòng thử nghiệm và có thể sử dụng thay thế nhau. ^b Tương tự tín hiệu m/z, thiết bị MS-MS cần được tối ưu hóa. ^c Do sự trao đổi ion thấp hơn nên tín hiệu m/z cao hơn có thể xuất hiện trong Q3. ^d Gradient rửa giải có thể cần được điều chỉnh để đạt được độ phân giải như trong Hình 1.

7.4.4. Hiệu chuẩn LC-MS

Một ví dụ về sắc ký đồ của dung dịch chuẩn nisin A được nêu trong Hình 1. Sắc ký đồ này thu được bằng cách đo dung dịch chuẩn làm việc nisin A (7.1.2) ba lần. Ví dụ cho thấy hiệu chuẩn tuyến tính đối với toàn bộ dải đo (xem Hình 2). Tuy nhiên, độ tuyến tính của thiết bị cần được kiểm tra định kỳ.

CHÚ DẪN:

n số đếm

t thời gian

1 nisin A

SIM_01 60,0 dương; 839,34 đến 839,84 m/z.

Hình 1 - Dung dịch chuẩn làm việc nisin A được phân tích bằng LC-MS

...

...

...

CHÚ DẪN:

A diện tích (thời gian giữa các lần đếm, tính bằng phút)

r_nA nồng độ khối lượng nisin A

(nisin + 4H]^4^+ ngoài SIM_01

Hình 2 - Hiệu chuẩn nisin A ở m/z 839,6 bằng LC-MS

7.4.5. Hiệu chuẩn LC-MS-MS

Sự chuyển dịch m/z 672 đến 811 là nhạy nhất đối với nisin A, do đó, cần được hiệu chuẩn. Hình 3 cho thấy kết quả hồi quy tuyến tính thu được sử dụng bốn nồng độ.

CHÚ DẪN:

...

...

...

r_nA nồng độ khối lượng nisin A

A = 180 342r_nA - 1 621,2

 = 0,996 7

Hình 3 - Hiệu chuẩn nisin A bằng LC-MS-MS

7.4.6. Xác định hàm lượng nisin A trong mẫu

Luôn luôn thực hiện quy trình hiệu chuẩn một điểm trong mỗi dãy phân tích. Nếu cần, hiệu chuẩn lại hệ thống và kiểm tra mẫu trắng thuốc thử.

8. Tính và biểu thị kết quả

8.1. Tính kết quả

Tính hàm lượng nisin A có trong mẫu thử, W_nA, bằng miligam nisin A trên kilogam mẫu thử, sử dụng công thức sau:

...

...

...

Trong đó:

r_nA nồng độ của dung dịch chuẩn làm việc, tính bằng miligam trên lít (mg/l);

H­_t là chiều cao pic hoặc diện tích pic của dung dịch thử;

H_s là chiều cao pic hoặc diện tích pic của dung chuẩn làm việc;

m_t là khối lượng phomat được dùng để chuẩn bị dung dịch thử, tính bằng gam (g);

V_t là thể tích dung dịch thử, tính bằng mililit (ml);

8.2. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả đến một chữ số thập phân. Biểu thị các kết quả thấp hơn 1 mg/kg là "nhỏ hơn 1 mg/kg".

9. Độ chụm

...

...

...

Theo kinh nghiệm, giới hạn tháp nhất về định lượng nisin A là 1 mg/kg.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các thao tác chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tuỳ chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc kết quả cuối cùng nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại.

...

...

...

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu

[2] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức

[3] Kuze, N. Takashi, M. Analysis of nisin in processed cheese using mass spectrometry coupled with liquid chromatography. Foods Food Ingredients J. Jpn. 2003, 208,12, pp. 1032-1036

[4] Berger, T., BOtikofer, U., Muralt, L, Rieder, K., Rhyn, P., ZOst, C. Bestimmung von Nisin A in Kase mit LC/MS und LC/MS-MS [Determination of nisin A in cheese with LC-MS and LC-MS-MS]. Mitt. Lebensm.Hyg. 2005, 96, pp. 336-350. Available (2009-10-16) at: http://www.agroscope.admin.ch/data/publikationen/pub_BerqerT_2005_15903.pdf

1) Ambicin N là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra để thuận tiện cho người sử đụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm nêu trên.

2) Millipore Centricon YM-30 là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm nêu trên.

3) Millipore Millex-GV PVDF 0,22 mm là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm nêu trên.

4) PLRP-S, 300 Å là sản phẩm của Polymer Lab Ltd. Thông tin này đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm nêu trên. Có thể sử dụng các sản phảm tương tự nếu cho kết quả tương đương.