Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8275-2:2010 về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn

• Số hiệu: TCVN8275-2:2010
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2010

Sản phẩm thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzym Nước

1,0 g 1 000 ml

5.1.3. Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1 % (nồng độ khối lượng)

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

5.2. Môi trường nuôi cấy

5.2.1. Thạch dicloran glycerol 18 % (nồng độ khối lượng) (DG 18) [4], [5], [6]

5.2.1.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

5,0 g

D-Glucoza (C₆H₁₂O₆)

...

...

...

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

1,0 g

Magie sulfat (MgSO₄.H₂O)

0,5 g

Dichloran (2,6-dicloro-4-nitroanilin)

0,002 g

Glycerol khan

220 g

Thạch

...

...

...

Chloramphenicol

0,1 g

Nước cất hoặc nước đã loại ion

1 000 ml

^a Tùy vào sức đông của thạch

5.2.1.2. Chuẩn bị

5.2.1.2.1. Yêu cầu chung

Hòa các thành phần trên vào nước và đun sôi để hòa tan hoàn toàn, trừ chloramphenicol. Chỉnh pH (6.4) sao cho sau khi khử trùng pH là 5,6 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Cho 10 ml dung dịch chloramphenicol 1 % (nồng độ khối lượng) vào etanol và trộn. Phân phối môi trường này với các lượng vào các vật chứa có dung tích thích hợp (6.5). Khử trùng 15 min bằng hấp áp lực ở 121 °C.

...

...

...

Để yên cho môi trường đông đặc và làm khô bề mặt thạch theo TCVN 6404 (ISO 7218) và TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các phần), nếu cần.

Sử dụng ngay hoặc bảo quản nơi tối theo TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các phần) cho đến khi sử dụng.

CẢNH BÁO – Không để môi trường tiếp xúc với ánh sáng, vì khi tiếp xúc với ánh sáng có thể sinh ra các sản phẩm gây độc cho tế bào mà có thể làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng.

5.2.1.2.2. Phương án bổ sung chlortetracycline clohydric

Việc phát triển quá nhiều vi khuẩn có thể là một vấn đề, do đó khuyến cáo sử dụng chloramphenicol (50 mg/l) và chlortetracycline (50 mg/l). Trong trường hợp này, chuẩn bị môi trường cơ bản như trên nhưng chỉ sử dụng 50 mg chloramphenicol rồi phân phối các lượng 100 ml và khử trùng. Do tính không ổn định của dung dịch nên cần chuẩn bị dung dịch mới chlortetracycline clohydric 0,1 % (khối lượng) trong nước và lọc để khử trùng. Ngay trước khi sử dụng, thêm 5 ml dung dịch này một cách vô trùng vào 100 ml môi trường cơ bản và đổ ra đĩa. Không khuyến cáo sử dụng gentamicin vì việc sử dụng gentamicin cho thấy ức chế một số loài nấm men [3].

5.2.1.2.3. Phương án bổ sung các nguyên tố với lượng vết

Để cho nấm mốc thể hiện hoàn toàn hình thái, cụ thể là sắc tố của chúng, nên cần đến nguyên tố với lượng vết mà có thể không có trong DG18. Để nhận biết các nấm mốc trên môi trường này, thì thêm dung dịch nguyên tố với lượng vết sau đây với 1 ml trên 1 l môi trường cơ bản, trước đó đã được hấp áp lực: 1 g ZnSO₄.7H₂O; 0,5 g CuSO₄.5H₂O; 100 ml nước cất hoặc nước đã loại ion [2].

5.2.1.3. Thử nghiệm hiệu năng đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy

5.2.1.3.1. Yêu cầu chung

...

...

...

5.2.1.3.2. Năng suất

Ủ:

Chủng:

Môi trường chuẩn:

Phương pháp kiểm tra:

Chuẩn cứ:

Phản ứng đặc trưng:

5 ngày ở 25 °C ± 1 °C

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763
Wallemia sebi ATTC 42694
Aspergillus restrictus ATCC 42693
Eurotium rubrum ATCC 42690
hoặc các chủng tương đương trong các bộ sưu tập nấm khác

...

...

...

định lượng

tỷ lệ năng suất, P_R ≥ 0,5

khuẩn lạc đặc trưng/chồi/mầm theo từng loài

5.2.1.3.3. Tính chọn lọc

Ủ:

Chủng:

Phương pháp kiểm tra:

Chuẩn cứ:

5 ngày ở 25 °C ± 1 °C

...

...

...

định tính

ức chế hoàn toàn

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần để thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu nó có các đặc tính kỹ thuật phù hợp.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

6.1. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 25 °C ± 1 °C.

6.2. Pipet xả hết, vô trùng, dung tích danh nghĩa 1 ml, được chia vạch 0,1 ml.

6.3. Nồi cách thủy, hoặc dụng cụ tương tự, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 44 °C đến 47 °C.

6.4. Máy đo pH, có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.

...

...

...

6.6. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo vô trùng, đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

6.7. Kính hiển vi, để phân biệt nấm men với các tế bào vi khuẩn (có trường sáng, độ khuếch đại từ 250 lần đến 1 000 lần).

6.8. Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo (đường kính nhỏ hơn 2 mm và dài 80 mm). Đường kính không được vượt quá 2 mm để giảm thiểu lượng mẫu dính vào que khi kết thúc dàn mẫu.

6.9. Kính khuếch đại hai thị kính, để phân biệt các khuẩn lạc/tế bào nấm men và nấm mốc (khuyếch đại từ 6,5 lần đến 50 lần).

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Mẫu phòng thử nghiệm không được làm đông lạnh.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan sẽ thỏa thuận về vấn đề này.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), TCVN 6404 (ISO 7218), TCVN 6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan sẽ thỏa thuận về vấn đề này.

...

...

...

9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng

Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu) và các dung dịch pha loãng tiếp theo TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), TCVN 6404 (ISO 7218), TCVN 6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm.

Khuyến cáo sử dụng 0,1 % canh thang nước pepton (5.1.3) làm dịch pha loãng, trừ việc chuẩn bị mẫu thử cụ thể. Tốt nhất nên dùng bộ trộn kiểu nhu động để trộn mẫu hoặc dùng máy lắc.

Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet (6.2) ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp.

Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng để tránh các phần tử có chứa vi sinh vật lắng xuống.

9.2. Cấy và ủ

9.2.1. Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác (Điều 8) cho vào một đĩa thạch DG18 (5.2.1).

Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10^-1) (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10^-2 (sản phẩm ở dạng khác) cho vào một đĩa thạch DG18 (5.2.1) thứ hai.

Để thuận tiện cho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, có thể lấy các lượng đến 0,3 ml dung dịch pha loãng 10^-1 của mẫu hoặc của mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên ba đĩa.

...

...

...

Đối với các loại thực phẩm dạng hạt hoặc rắn, ví dụ: quả hạch, hoặc hạt ngũ cốc, thì khuyến cáo đổ đĩa trực tiếp. Các mẫu thuộc các loại sản phẩm này được khử trùng bề mặt trong dung dịch natri hypoclorit 0,35 % (1000 mg/g) với thời gian tiếp xúc 2 min, sau đó được tráng rửa bằng nước cất vô trùng, làm khô trên giấy vô trùng rồi cho lên môi trường đông đặc [1, 2].

9.2.2. Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng (6.8) cho đến khi dịch lỏng hấp thụ hết vào môi trường.

Có thể sử dụng kỹ thuật cấy bằng phương pháp đổ đĩa nhưng trong trường hợp này sự tương đương của các kết quả phải được đánh giá bằng cách so sánh với kết quả được cấy trên bề mặt đĩa và có thể không phân biệt sự khác nhau của nấm men và nấm mốc. Phương pháp cấy bề mặt đĩa có thể cho kết quả định lượng cao hơn. Kỹ thuật dàn đĩa tạo điều kiện cho các tế bòa tiếp xúc tối đa với oxi của không khí và tránh mọi nguy cơ bị bất hoạt do nhiệt của các chồi nấm. Các kết quả có thể phụ thuộc vào từng loại nấm.

9.2.3. Ủ các đĩa đã chuẩn bị (9.2.2) trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thế thẳng đứng trong tủ ấm (6.1) ở 25 °C ± 1 °C trong 5 ngày đến 7 ngày. Để các đĩa thạch trong ánh sáng khuếch tán từ 1 ngày đến 2 ngày, nếu cần.

Nếu nghi ngờ có mặt Xeromyces bisporus thì ủ các đĩa trong 10 ngày.

Khuyến cáo ủ các đĩa trong túi chất dẻo để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trong trường hợp nấm mốc lan ra ngoài đĩa.

9.3. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

Đếm các đĩa sau thời gian ủ qui định, chọn các đĩa (9.2.3) chứa ít hơn 150 khuẩn lạc/chồi/mầm và đếm. Nếu trên các đĩa nấm mốc mọc quá nhanh thì có thể đếm các khuẩn lạc/chồi/mầm sau  khi ủ 2 ngày và đếm lại sau khi ủ 5 ngày đến 7 ngày.

CHÚ THÍCH 1 Các phương pháp định lượng nấm men và đặc biệt là nấm mốc là không chính xác, vì chúng là một hỗn hợp của hệ sợi nấm và các bào tử vô tính và hữu tính. Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc phụ thuộc vào mức độ phân đoạn của sợi nấm và tỷ lệ các bào tử có thể mọc trên môi trường đổ đĩa.

...

...

...

CẢNH BÁO Các bào tử nấm mốc phân bố trong không khí rất mạnh, nên cần thao tác với các đĩa Petri cẩn thận để tránh làm phát triển các khuẩn lạc vệ tinh làm cho việc ước tính kết quả quá cao.

Tiến hành kiểm tra bằng kích khuếch đại hai thị kính (6.9) hoặc bằng kính hiển vi (6.7) để phân biệt giữa các tế bào nấm men hoặc nấm mốc và vi khuẩn từ các khuẩn lạc, nếu cần.

Đếm các khuẩn lạc nấm men và các khuẩn lạc/chồi nấm mốc riêng rẽ, nếu cần.

Để nhận biết nấm men và nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thích hợp.

10. Biểu thị kết quả và giới hạn tin cậy

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

Ghi lại các khuẩn lạc nấm men và các khuẩn lạc/chồi nấm mốc riêng rẽ, nếu cần.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ các thông tin dưới đây:

...

...

...

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được cho là tùy chọn, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được;

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

CÁC VÍ DỤ VỀ HOẠT ĐỘ NƯỚC THEO CHẤT NỀN

Bảng A.1 đưa ra các ví dụ về hoạt độ nước theo các sản phẩm cần phân tích.

Bảng A.1 – Hoạt độ nước a_w theo các chất nền

...

...

...

Các mẫu thực phẩm/chất nền

≥ 0,95

Thực phẩm rất dễ bị hỏng (rau, quả, thịt, cá tươi và đóng hợp), sữa xúc xích đã nấu, bánh mì, thực phẩm chứa đến 4 % sacaroza hoặc 7 % NaCl (muối)

≥ 0,91

Phomat cứng như Cheddar, thịt hun khói, nước quả cô đặc chứa 55 % sacaroza hoặc 12 % NaCl (muối)

≥ 0,87

Xúc xích lên men, bánh ngọt xốp, phomat khô, margarin, thực phẩm chứa 65 % sacaroza hoặc 15 % NaCl (muối)

≥ 0,80

Nước quả cô đặc, sữa đặc, xirô, bột mì, bánh có hàm lượng đường cao, đậu đỗ có độ ẩm từ 15 % đến 17 %

...

...

...

Mứt, mứt nhuyễn, quả ngâm đường, bánh hạnh nhân, kẹo dẻo, bánh ngọt

≥ 0,65

Bột yến mạch có độ ẩm 10 %, mứt, mật mía, quả hạch

≥ 0,60

Quả khô có độ ẩm từ 15 % đến 20 %, caramel, kẹo sữa toffee, mật ong, đậu đỗ ép, thức ăn cho chó, thực phẩm dạng hạt, đậu đỗ và sản phẩm đậu đỗ

≥ 0,50

Mì sợi có độ ẩm 12 %, gia vị có độ ẩm 10 %

≥ 0,40

Bột trứng nguyên quả có độ ẩm 5 %, kẹo nuga

...

...

...

Bánh qui, cracker, vỏ bánh mì có độ ẩm từ 3 % đến 5 %, nước chấm dạng khô

≥ 0,03

Sữa bột nguyên chất có độ ẩm từ 2 % đến 3 %, bột xúp, cà phê hòa tan.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ANDREWS, S., PITT, J.I. Selective medium for isolation of Fusarium species and dematiaceous hyphomycetes from cereals. App. Environ. Microbiol. 1986, 51, pp. 1235-1238

[2] BELL, C, NEAVES, P., WILLIAMS, A.P. Food microbiology and laboratory practice. Blackwell, Oxford, 2005. 324 p.

[3] BEUCHAT, L.R. Media for detecting and enumerating yeasts and moulds. In: CORRY, J.E.L., CURTIS, G.D.W., BAIRD, R.M., editors. Handbook of culture media for food microbiology, pp. 369-386. Elsevier, Amsterdam, 2003. (Progress in industrial microbiology, Vol 37)

[4] BEUCHAT, LP,., FRANDBERG, E., DEAK, T., ALZAMORA, S.M., CHEN, J., GUERRERO, A.S., LOPEZ-MALO, A., OHLSSON, I., OLSEN, M., PEINADO, J.M., SCHNURER, J., DE SILONIZ, M.I., TORNAI-L.EHOCZKI, J. (2001) Performance of mycological media in enumerating desiccated food spoilage yeasts: An interiaboratory study. Int. J. Food Microbiol. 2001, 70, pp. 89-96

...

...

...

[6] HOCKING, A.D., PITT, J.I. Dichloran-glycerol medium for enumeration of xerophilic fungi from low moisture foods. Appl. Environ. Microbiol. 1980, 39, pp. 488-492

1) Tween 80 là một ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử dụng chúng.