Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-24:2018 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 24

• Số hiệu: TCVN8685-24:2018
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2018

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8685-24: 2018

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 24: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH SALMONELLA TYPHIMURIUM Ở GÀ

Vaccine testing procedure - Part 24: Salmonella typhimurium vaccine, inactivated

Lời nói đầu

TCVN 8685-24: 2018 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo tường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:

- TCVN 8685-1: 2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc;

- TCVN 8685-2: 2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;

...

...

...

- TCVN 8685-4: 2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;

- TCVN 8685-5: 2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;

- TCVN 8685-6: 2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;

- TCVN 8685-7: 2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2;

- TCVN 8685-8: 2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc;

- TCVN 8685-9: 2014, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1;

- TCVN 8685-10: 2014, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Lở mồm long móng (FMD);

- TCVN 8685-11: 2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8685-12: 2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

...

...

...

- TCVN 8685-14: 2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;

- TCVN 8685-15: 2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-16: 2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn,

- TCVN 8685-17: 2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;

- TCVN 8685-18: 2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;

- TCVN 8685-19: 2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro;

- TCVN 8686-20: 2018, Phần 20: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Newcastle;

- TCVN 8685-21: 2018, Phần 21: Vắc xin phòng bệnh đậu gà;

- TCVN 8685-22: 2018, Phần 22: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm;

...

...

...

- TCVN 8685-24: 2018, Phần 24: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella typhimurium ở gà;

- TCVN 8685-25: 2018, Phần 25: Vắc xin phòng bệnh giả dại ở lợn

- TCVN 8685-26: 2018, Phần 26: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-27: 2018, Phần 27: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà.

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 24: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH SALMONELLA TYPHIMURIUM Ở GÀ

Vaccine testing procedure - Part 24: Salmonella typhimurium vaccine, inactivated

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định về quy trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt được sản xuất từ chủng vi khuẩn Salmonella typhimurium phòng bệnh thương hàn ở gà.

...

...

...

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684: 2011, Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết.

3  Ký hiệu và chữ viết tắt

ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay.

CFU: Colony Froming Unit.

MLD: Minimum Lethal Dose.

4  Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng phương pháp phân tích trong phòng thử nghiệm và các chỉ tiêu an toàn, hiệu lực được đánh giá trên động vật thí nghiệm.

5  Động vật thí nghiệm và giống gốc công cường độc

...

...

...

5.2  Chuột nhắt trắng trọng lượng từ 18 g đến 20 g, khỏe mạnh.

5.3  Thỏ trọng lượng từ 1,8 kg đến 2 kg, khỏe mạnh không có kháng thể kháng Salmonella typhimurium.

5.4  Vi khuẩn Salmonella typhimurium cường độc

5.5  Nước muối sinh lý, đã được hấp tiệt trùng, nồng độ 0,9 %

6.  Thiết bị, dụng cụ

6.1  Tủ ấm có thể duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0.5°C.

6.2  Tủ lạnh có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

6.3  Tủ lạnh sâu có thể duy trì nhiệt độ âm 80 °C.

6.4  Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 vòng/min đến 2400 vòng/min.

...

...

...

6.6  Nồi hấp có thể duy trì ở các nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C trong thời gian 10 min, 15 min, 20 min.

6.7  Cân điện tử có dải đo từ 0 g đến 200 g, độ chính xác cấp I, d = 0,1 mg, e = 1 mg.

6.8  Nồi đun cách thủy.

6.9  Micropipet đơn kênh, dung tích từ 0,5 µl đến 10 µl, từ 5 µl đến 50 µl, từ 50 µl đến 200 µl, từ 100 µl đến1000 µl.

6.10  Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 µl đến 50 µl, từ 50 µl đến 200 µl.

6.11  Đĩa lồng, ống nghiệm thủy tinh vô trùng.

6.12  Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U.

6.13  Bình tam giác 100 ml, 200 ml vô trùng.

6.14  Dao, kéo, panh kẹp vô trùng.

...

...

...

7.  Cách tiến hành

7.1  Kiểm tra cảm quan

Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt chỉ tiêu cảm quan khi lọ vắc xin đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn.

7.2  Kiểm tra vô trùng

7.2.1  Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn Theo TCVN 8684: 2011.

7.2.2  Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc Theo TCVN 8684: 2011.

7.3.2  Kiểm tra sự có mặt của Formaldehyde Theo TCVN 8684: 2011.

7.3  Kiểm tra tính an toàn

Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

...

...

...

- Tiêm bắp cho ít nhất 10 gà (5.1), mỗi gà 2 liều vắc xin ghi trên nhãn. Theo dõi 10 ngày.

- Vắc xin được coi là đạt chỉ tiêu về an toàn nếu tất cả gà sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân như: sưng, phù nề, loét vị trí tiêm, gà ủ rũ mệt mỏi, chậm chạp, kém ăn, không tăng trọng.

7.3.2  Phương pháp thay thế

- Tiêm phúc xoang cho ít nhất 10 chuột nhắt trắng (5.2), mỗi con 4/5 liều vắc xin ghi trên nhãn. Theo dõi 10 ngày.

- Vắc xin được coi là đạt chỉ tiêu về an toàn nếu tất cả chuột nhắt trắng sống, khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân như: sưng, loét vị trí tiêm, lông xù chuột gầy yếu, chậm chạp...

7.4  Kiểm tra hiệu lực

Chọn 1 trong 3 phương pháp sau:

7.4.1  Phương pháp công cường độc trên gà

Gà được chia làm 2 nhóm:

...

...

...

- Nhóm 2: Tiêm bắp ít nhất 10 gà (5.1) nước muối sinh lý (5.5) vô trùng với liều lượng như tiêm vắc xin.

- 21 ngày sau miễn dịch, toàn bộ gà nhóm 1 và nhóm 2 được thử thách với vi khuẩn Salmonella typhimurium cường độc (5.4) mỗi con 1 MLD theo đường dưới da.

- Theo dõi động vật thí nghiệm trong 7 ngày.

- Vắc xin được coi là đạt nếu:

+ Gà nhóm 2 chết hoặc có bệnh tích điển hình > 70%.

+ Gà nhóm 1 phải sống ≥ 70%.

7.4.2  Phương pháp công cường độc trên chuột nhắt trắng

Chuột nhắt trắng được chia làm 2 nhóm:

- Nhóm 1: Tiêm phúc xoang ít nhất 20 chuột nhắt trắng (5.2), mỗi con tiêm 1/5 liều vắc xin theo quy định được ghi trên nhãn của sản phẩm.

...

...

...

- 21 ngày sau miễn dịch, toàn bộ chuột nhóm 1 và chuột nhóm 2 được thử thách với vi khuẩn Salmonella typhimurium cường độc (5.4) mỗi con 1 MLD theo đường phúc xoang.

Theo dõi trong 10 ngày, vắc xin được coi là đạt nếu:

+ Chuột nhóm 2 chết > 70%

+ Chuột nhóm 1 sống ≥ 70%.

7.4.3  Phương pháp huyết thanh học

Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

7.4.3.1  Đánh giá hàm lượng kháng thể bằng phản ứng ELISA

- Tiêm dưới da cho ít nhất 20 gà (5.1) mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. Ba tuần sau khi miễn dịch, gà được lấy máu, chắt huyết thanh làm phản ứng ELISA.

- Đánh giá kết quả: Mẫu vắc xin đạt tiêu chuẩn khi kết quả phù hợp với quy định của KIT.

...

...

...

- Tiêm dưới da cho ít nhất 20 gà (5.1) mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. Ba tuần sau khi miễn dịch, gà được lấy máu, chắt huyết thanh làm phản ứng ngưng kết chậm (xem phụ lục A).

- Đánh giá: Vắc xin đạt tiêu chuẩn nếu hiệu giá kháng thể của ít nhất 75 % mẫu huyết thanh miễn dịch phải cho kết quả ≥ 4log2.

8.  Kết luận

Vắc xin đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm khi đạt các chỉ tiêu kiểm tra cảm quan, kiểm tra vô trùng, kiểm tra tính an toàn và kiểm tra hiệu lực.

Phụ lục A

(Quy định)

Kiểm tra hiệu giá kháng thể Salmonella Typhimurium bằng phản ứng ngưng kết chậm

A.1  Chuẩn bị môi trường hóa chất

...

...

...

- Canh thang Brain heart infusion (BHI) được pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sau đó chia 4 ml/ống, đem hấp vô trùng.

- Acid Chlohydric 1N (HCl 1N).

- Sodium Hydroxide 1N (NaOH 1N).

- Formaldehyde solution 37 % (HCHO 37%).

- Dung dịch NaCl: 1000ml được pha theo công thức sau:

Natri clorua (NaCl)  9 g

Nước  1000 ml

Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (6.6) ở nhiệt độ 121 °C trong 1 h. Bảo quản ở tủ lạnh (6.2).

A.2  Chuẩn bị kháng nguyên

...

...

...

A.2.2  Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch BAB (A.2.1) cấy vào môi trường canh thang BHI (A.1) rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 16 h.

A.2.3  Láng 4 ml canh trùng (A.2.2) lên 2 đĩa thạch BAB (A.1) rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 18 h.

A.2.4  Thu hoạch vi khuẩn sau khi láng trên mặt thạch BAB (A.2.3) bằng cách dùng 5ml NaCl (A.1) rửa bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu được vào ống nghiệm.

A.2.5  Nhỏ 0,02 ml Formaldehyde solution 37 % (A.1) vào huyễn dịch vi khuẩn thu được (A.2.4) rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h, sau đó đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch vi khuẩn bằng cách ria trên môi trường BAB, ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h.

A.2.6  Huyễn dịch vi khuẩn (A.2.5) đạt chỉ tiêu vô trùng (không có khuẩn lạc nào mọc trên môi trường kiểm tra) sẽ được ly tâm bằng máy ly tâm (6.5) 3000 g trong 15 min ở nhiệt độ 4 °C, thu lấy cặn, hoàn nguyên lại bằng 5 ml NaCl (A.1), lắc đều rồi để ở tủ lạnh (6.2).

A.2.7  Kiểm tra kháng nguyên (A.2.6) xem có tự ngưng kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không có hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên lắng tròn đáy giếng.

A.3  Chuẩn bị huyết thanh kiểm tra

A.3.1  Huyết thanh thí nghiệm

- Lấy máu động vật (7.4.3.2), chắt lấy huyết thanh. Sau đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi cách thủy (6.8) ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min.

...

...

...

A.3.2.1  Từ canh trùng (A.2.4) pha thành canh trùng có mật độ 2 tỷ CFU/ml.

A.3.2.2  Tiêm 2 ml dưới da cho thỏ (5.3) canh trùng (A.3.2.1).

A.3.2.3  Sau 7 ngày tiêm tiếp cho thỏ (5.3) 0.2 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.4  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 0.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.5  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 1 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.6  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 1.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.7  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 2 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.8  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 2.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.9  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 3 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

...

...

...

A.3.2.11  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 4 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.12  Sau 1 tuần tiêm mũi cuối cùng tiến hành lấy máu thỏ thu hoạch huyết thanh tối miễn dịch.

A.3.3  Cách pha canh trùng 2 tỷ

A.3.3.1  Cho 9 ml nước muối sinh lý vô trùng/ ống vào 7 ống nghiệm vô trùng có đánh số từ 1 đến 7.

A.3.3 2  Cho 1 ml canh trùng đếm số vào ống thứ 1 trộn đều chuyển sang ống thứ 2 cứ như vậy đến ống thứ 7 (pha loãng 1/10)

A.3.3.3  Hút 0,01 ml ở ống thứ 7 nhỏ lên đĩa thạch máu thỏ rồi ria đều (mỗi nồng độ 2 đĩa), để tủ ấm 37 °C (6.1).

A3.3.4  Hút 0,01 ml ở ống thứ 6 nhỏ lên đĩa thạch máu thỏ rồi ria đều (mỗi nồng độ 2 đĩa) để tủ ấm 37°C (6.1).

A.3.3.5  Sau 18 h đến 20 h, đọc kết quả: Đếm số khuẩn lạc mọc trên mỗi dĩa.

Cách tính kết quả

...

...

...

Trong đó: C: Là số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa có nồng độ liền nhau.

V: Là thể tích cấy ở mỗi nồng độ

n1: Số đĩa của độ pha loãng ban đầu 10^-7 (2 đĩa)

n2: Số đĩa của độ pha loãng tiếp theo 10^-6

d: Độ pha loãng ban đầu (nhân nghịch đảo): 10^6

Pha canh trùng 2 tỷ CFU/ml:

Canh trùng 2 × 10^9 CFU/ml = 1 ml canh trùng (A.2.4) + (N/2×10^9 - 1) ml NaCl.

A.4  Cách tiến hành

...

...

...

- Bố trí thí nghiệm.

+ Giếng thí nghiệm: Từ A1 đến H8.

+ Giếng đối chứng âm: Từ A9 đến H10.

+ Giếng đối chứng dương: Từ A11 đến H12.

Sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm

- Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như trên.

- Đối với các giếng thí nghiệm:

+ Cho 50 µl dung dịch NaCl (A.1) vào các dãy giếng thí nghiệm (A1 đến H8).

...

...

...

+ Nhỏ vào các giếng 50 µl kháng nguyên (A.2).

- Đối với các giếng đối chứng:

+ Đối chứng âm: 50 µl dung dịch NaCl (A.1) + 50 µl kháng nguyên (A.2).

+ Đối chứng dương: 50 µl huyết thanh tối miễn dịch (A.3.2) + 50 µl kháng nguyên (A.2).

+ Lắc nhẹ cho đều rồi đậy nắp để ở tủ ấm 37 °C (6.1) qua đêm.

- Đọc kết quả:

+ Phản ứng âm tính: Kháng nguyên lắng tròn đáy giếng

+ Phản ứng dương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng

- Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1]  Chapter 2.9.8 - Salmonellosis (OIE Terrestrial Manual 2016).

[2]  HSSX vắc xin Avipro Salmonella vac E.

[3]  Hồ sơ sản xuất vắc xin Galliimun SE + ST.