Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6264:1997 sữa và các sản phẩm sữa - định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc

• Số hiệu: TCVN6264:1997
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 1997

Tripton Cao men Glucoza ngậm 1 phân tử nước (C6H12O6.H2O) Sữa bột gầy[1]^) Thạch Nước	5,0 g 2,5 g 1,0 g 1,0 g 10 g đến 15 g ^2) 1 000 ml
^1) Sữa bột gầy không được chứa các chất ức chế. Điều này phải được kiểm tra bằng thử so sánh dùng sữa bột gầy đã biết trước là không chứa các chất này. ^2) Tùy theo độ đông của thạch.

5.6.2. Chuẩn bị

5.6.2.1. Chuẩn bị từ môi trường hoàn chỉnh khô thương phẩm

Tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất, nhưng trong mọi trường hợp, phải cho thêm sữa bột gầy, ngay cả khi nhà sản xuất coi việc thêm như vậy là không cần thiết.

Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng, pH là 7,0, ở 25^0C.

5.6.2.2. Chuẩn bị từ các thành phần chính khô

Hòa tan và phân tán trong nước theo trình tự sau: cao men, tripton, glucôza và cuối cùng là sữa bột gầy. Nước được hâm nóng sẽ giúp cho việc hòa tan tốt hơn.

Cho thêm thạch và đun sôi, khuấy đều cho đến khi thạch tan hoàn toàn, hoặc đun nóng trong nồi hơi nước trong khoảng 30 phút. Nếu cần, dùng giấy lọc để lọc.

Nếu cần, chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0, ở 25^0C.

5.6.2.3. Phân phối, khử trùng và bảo quản

...

...

...

Khử trùng bằng nồi hấp (6.1) ở 121^0C ± 1^0C trong 15 phút. Nếu môi trường dùng ngay thì làm nguội đến 45^0C trong nồi cách thủy (6.5). Nếu không dùng ngay, trước khi bắt đầu tiến hành thử nghiệm vi sinh, để tránh mọi sự chậm trễ khi rót môi trường, làm tan chảy hoàn toàn môi trường trong nồi cách thủy nóng (6.6), sau đó làm nguội đến 45^0C trong nồi cách thủy (6.5).

Chú thích

1) Để kiểm tra được nhiệt độ của thạch, đặt một nhiệt kế vào một lượng dung dịch 15g/l thạch được đựng trong một bình riêng biệt giống hệt loại bình để đựng môi trường. Dung dịch kiểm tra nhiệt độ này phải được tiến hành các thao tác tương tự về đun nóng và làm nguội, giống như đối với môi trường nuôi cấy.

2) không được để môi trường trong nồi cách thủy quá 3 giờ.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Chú ý - Phải khử trùng tất cả các dụng cụ tiếp xúc với mẫu thử, với chất pha loãng, với dung dịch pha loãng, hoặc với môi trường nuôi cấy phù hợp với TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) (6.1).

Chú thích 3 - Có thể dùng các dụng cụ sử dụng một lần để thay cho các dụng cụ thủy tinh có thể sử dụng nhiều lần, nếu như nó phù hợp với các yêu cầu quy định.

Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử và các dung dịch pha loãng theo quy định của TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) và đặc biệt là:

6.1. Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp), xem ISO 7218.

...

...

...

6.3. Đĩa Petri, làm bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

6.4. Pipet chia độ, được nhét nút bông, đã hiệu chỉnh dung tích 1 ml ± 0,02ml, hoặc 10 ml ± 0,2 ml.

6.5. Nồi cách thủy, có khả năng hoạt động ở 45^0C ± 1^0C.

6.6. Nồi cách thủy, có khả năng hoạt động từ 100^0C trở lên.

6.7. Thiết bị đếm khuẩn lạc, bao gồm một bộ phận chiếu sáng có nền đen, được gắn với kính lúp có độ khuếch đại 1,5 lần và có một dụng cụ đếm cơ hoặc điện tử.

6.8. pH mét bù nhiệt, chính xác tới ± 0,1 đơn vị pH, ở 25^0C.

6.9. Ống nghiệm có dung tích khoảng 20 ml (hoặc bình, lọ có dung tích tương tự) và lọ hoặc bình có dung tích từ 150 ml đến 250 ml, dùng để khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy.

Chú thích 4 - Có thể dùng lọ hoặc bình có nắp xoáy, bằng kim loại không độc.

Lấy mẫu theo ISO 707.

...

...

...

Chú thích 5 - Để tăng độ chính xác của phương pháp, việc chuẩn bị các dung dịch pha loãng phải được chuẩn hóa cẩn thận. Những yếu tố tác động đến độ chính xác là:

- kiểu loại thiết bị khuấy trộn;

- thời gian khuấy trộn;

- chất pha loãng;

- thời gian để cho các hạt to lắng xuống;

- thời gian khuấy cho phép khi chuẩn bị các dung dịch loãng theo hệ thập phân.

Chú ý - Phải thực hiện các thao tác vô trùng thông thường. Những thao tác quy định trong 8.1 và 8.2 không được tiến hành dưới ánh nắng mặt trời.

8.1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch pha loãng ban đầu

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989).

...

...

...

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989).

8.3. Thời gian tiến hành

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989), 8.3.

8.4. Cấy và nuôi ấm

8.4.1 Lấy hai đĩa Petri (6.3) vô trùng. Dùng một pipet vô trùng (6.4) cho vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử, nếu là dạng lỏng, hoặc 1 ml chất huyền phù ban đầu nếu là sản phẩm dạng khác.

8.4.2. Lấy tiếp hai đĩa Petri vô trùng. Dùng một pipet vô trùng khác cho vào mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng 10^-1(sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc 1 ml dung dịch pha loãng 10^-2(sản phẩm ở dạng khác).

8.4.3. Nếu cần, lặp lại thao tác này, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.

8.4.4. Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng từ 12 ml đến 15 ml môi trường nuôi cấy (5.6), đã được làm cho tan chảy từ trước và giữ ở 45^0C trong nồi cách thủy (6.5).

8.4.5. Khuấy trộn thật kỹ chất cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa Petri và để cho hỗn hợp đông đặc bằng cách đặt các đĩa Petri này trên một mặt phẳng nằm ngang, mát.

...

...

...

8.4.7. Chuẩn bị đủ số đĩa đối chứng để kiểm tra độ vô trùng.

8.4.8. Lật ngược các đĩa đã cấy xong và đặt chúng vào tủ ấm (6.2), đặt ở nhiệt độ 30^0C trong 72 h ± 3 h.

Chú thích 6 - Để ngăn hiện tượng lan rộng cần phải đề phòng như sau:

- phủ thêm một lớp môi trường nuôi cấy lên trên mặt các đĩa cấy sau khi đã đông đặc, hoặc

- nhỏ thêm một giọt glixerol lên giấy lọc ở nắp của đĩa.

8.4.9. Không chồng quá 6 đĩa lên nhau. Để các chồng đĩa tách xa hẳn nhau cũng như xa thành và xa nóc tủ ấm.

8.5. Đọc kết quả

8.5.1. Đếm số khuẩn lạc trong mỗi đĩa (xem 9.1) sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc (6.7).

Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu. Điều này rất quan trọng vì những chấm khuẩn lạc nhỏ cũng phải được đếm, nhưng điều cơ bản là người kỹ thuật viên phải tránh lẫn lộn các hạt nhỏ không tan hoặc các chất kết tủa trong đĩa với khuẩn lạc nhỏ. Kiểm tra thật cẩn thận các đốm còn nghi ngờ, dùng kính lúp có độ khuếch đại cao hơn nếu thấy cần, để phân biệt được khuẩn lạc với các chất lạ.

...

...

...

9. Biểu thị kết quả

9.1. Chỉ giữ lại các đĩa có ít nhất là 10 khuẩn lạc, nhiều nhất là 300 khuẩn lạc.

Tính số vi sinh vật CFU từ các vi sinh vật, N, trong 1 gam hoặc trong 1 mililít sản phẩm, theo công thức:

trong đó:

åC là tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại;

n1 là số đĩa của độ pha loãng thứ nhất, có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc;

n2 là số đĩa của độ pha loãng thứ hai có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.

...

...

...

trong đó:

n3 là số đĩa của độ pha loãng thứ 3 được giữ lại, có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc.

Làm tròn số kết quả thu được đến 2 chữ số có nghĩa. Khi số cần làm tròn là 5 mà không có chữ số có nghĩa nào đứng theo sau thì làm tròn số đứng trước chữ số 5 cho thành số chẵn. Thí dụ: 28 500 làm tròn thành 28 000, và 11 500 được làm tròn thành 12 000.

Lấy kết quả là số đơn vị khuẩn lạc CFU của vi sinh vật trong 1 mililít hoặc trong 1 gam sản phẩm, biểu thị bằng một số từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10^x, trong đó x là lũy thừa tương ứng của 10.

Thí dụ:

Việc đếm khuẩn lạc vi sinh vật ở 30^0C cho kết quả sau (hai đĩa Petri cho mỗi độ pha loãng đã được ủ):

- độ pha loãng thứ nhất (10^-2) được giữ lại, chứa 168 và 215 khuẩn lạc 

- độ pha loãng thứ hai (10^-3) được giữ lại, chứa 14 và 25 khuẩn lạc

...

...

...

Làm tròn kết quả như hướng dẫn trên thu được 19 000 hoặc 1,9 x 10^4 CFU vi sinh vật trong một gam hoặc trong một mililít sản phẩm.

9.2. Nếu có hai đĩa tương ứng với mẫu thử (sản phẩm lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) có chứa ít hơn 10 khuẩn lạc thì báo cáo kết quả như sau:

- ít hơn 10 vi sinh vật CFU trong một mililít (sản phẩm lỏng).

- ít hơn 10 x 1/d vi sinh vật CFU trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu. 

9.3. Nếu tất cả các đĩa đều chứa nhiều hơn 300 khuẩn lạc, thì tính số lượng ước tính từ các đĩa có số khuẩn lạc gần 300 nhất và nhân số này với số nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất. Báo cáo kết quả theo “số lượng đơn vị khuẩn lạc vi sinh vật ước tính trong một gam hoặc một mililít sản phẩm”.

10. Độ lặp lại

Độ chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được từ hai lần thử nghiệm riêng rẽ, khi sử dụng cùng một phương pháp, phân tích trên cùng nguyên liệu, do cùng một người tiến hành trong cùng một phòng thí nghiệm dùng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được vượt quá 30% của kết quả thấp hơn.

Chú thích

8) Nếu các trường hợp không thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại là 5%, hoặc lớn hơn thì cần xem xét nguồn gốc có khả năng gây ra sai lỗi.

...

...

...

11. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng, kết quả thử nghiệm thu được và phương pháp biểu thị đã sử dụng. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử.