Năm nghiên cứu cộng
tác
|
1997 [8]
|
1998/1999 [9]
|
Số phòng thử nghiệm tham gia
|
25
|
27
|
Số phòng thử nghiệm có kết quả gửi đến
|
22
|
20
|
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
|
10
|
3
|
Số kết quả được chấp nhận
|
220
|
60
|
Số mẫu chứa đậu tương
|
220
|
50
|
Kết quả dương tính giả
|
0
|
1 (2 %)
|
Kết quả âm tính giả
|
0
|
1 (2%)
|
A.1.2.2. Đặc hiệu phân tử
A.1.2.2.1. Khái quát
Phụ lục này trình bày chi tiết những yêu cầu
được nêu trong điều 7.
Phương pháp được thiết kế cho trình tự đích được
mô tả trong GenBankÒ3), có số hiệu đăng ký
No. K00821 = M30884.
A.1.2.2.2. Lý thuyết
Gene lectin Le1 đậu tương [10] thu được
từ các ngân hàng dữ liệu gen được sử dụng làm trình tự đích.
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào của các cây trồng khác nhau (các cây
họ đậu, ngũ cốc, rau...) (NCBI BlastNÒ2)) không biến đổi gen được tìm thấy trong ngân
hàng dữ liệu của Phòng thử nghiệm Sinh học phân tử Châu Âu (EMBL), ngày 28
tháng 9 năm 2001). Tuy nhiên, GM03 tương đồng 100% với trình tự có số hiệu đăng
ký trong cơ sở dữ liệu: AX033509, (trình tự 17 từ bản quyền DE19906169),
AX033507 (trình tự 15 từ bản quyền DE19906196) và AX033501 (trình tự 9 từ bản
quyền DE19906169), trong khi GM04 chỉ tương đồng với mã ký hiệu AX033509 (trình
tự 17 từ bản quyền DE19906169). Chú ý rằng mã ký hiệu No.M30884 giống với
K00821, trong GenBank được đăng ký năm 1993.
Số bản sao trình tự đích không xác định được,
nhưng được coi là một gen phiên bản đơn.
A.1.2.2.3. Thực nghiệm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn tuyệt đối chưa xác định được, nhưng
phương pháp đã được chứng minh có thể phát hiện đối với ADN của đậu tương có
hàm lượng 0,1 ng, được xác định bằng huỳnh quang.
A.1.3. Điều chỉnh
Chưa có quy định cụ thể.
A.1.4. Nguyên tắc
Đoạn có chiều dài 118 bp từ gen lectin của
hạt đậu tương được khuếch đại bằng PCR và được xác định bằng điện di trên gel
agaroza.
A.1.5. Thuốc thử
Chất lượng thuốc thử được sử dụng, xem TCVN
7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
A.1.5.1. Nước
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1.5.3. Dung dịch MgCl2, c(MgCl2) = 25
mmol/l
A.1.5.4. Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 2,5
mmol/l (cho mỗi loại)
A.1.5.5. Oligonucleotit
A.1.5.5.1. Mồi xuôi
Gen lectin của Đậu tương (mã ký hiệu trong
GenBank Ò No.K00821).
Mồi GM03: 5'-gCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC
C-3'.
A.1.5.5.2. Mồi ngược
Gen lectin của đậu tương (mã ký hiệu trong
GenBankÒ No.K00821).
Mồi GM04: 5'-gCC CAT CTg CAA gCC TTT TTg
Tg-3'.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1.5.7. Mẫu dò lai (GM)
5'-ggT AgC gTT gCC AgC TTC g-3'.
A.1.5.8. Dung dịch đệm muối natri xitrat (SSC) 5x, pH 7,0.
Dung dịch đệm SSC 5x là dung dịch chứa 0,75
mol/l NaCl và 0,075 mol/l natri xitrat.
A.1.5.9. Dung dịch lai sơ bộ
Bao gồm dung dịch đệm SSC 5x, 0,1 % (nồng độ
khối) N-lauroylsarcosin, 0,02 % (nồng độ khối) natri dodecyl sulfat (SDS) và 1
% chất hãm 5) hoặc 5 % (nồng độ khối) bột sữa không
chứa chất béo [12].
A.1.5.10. Dung dịch lai
Chứa 10 pmol mẫu dò lai trong 2,5 ml dung
dịch đệm trước khi lai (A.1.5.9). Nhiệt độ lai là 50 oC. Thông tin
chi tiết hơn về điều kiện lai xem [12].
A.1.6. Thiết bị
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1.6.2 Buồng điện di, với nguồn điện.
A.1.7. Cách tiến hành
A.1.7.1. Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng A.2. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng A.2 được chứng minh là phù hợp.
Bảng A.2 - Thành phần
thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (μl)
Mẫu ADN khuôn
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
Nước
15,9
Đệm PCR 10 x (không chứa MgCI2)
1 x
2,5
Dung dịch MgCl2a, 25
mmol/l
1,5 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l
0,8 mmol/l
2
Mồi GM03, 5 mmol/l
0,2 mmol/l
1
Mồi GM04, 5 mmol/l
0,2 mmol/l
1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5 IU
0,1
a Nếu dung dịch đệm PCR có chứa MgCI2,
thì nồng độ cuối cùng của MgCI2 trong hỗn hợp phản ứng là 1,5
mmol/l.
A.1.7.2. Kiểm chứng PCR
Về kiểm chứng dương tính, mẫu chuẩn GTS
40-3-2 do Viện Vật liệu và Đo lường chuẩn (IRMM) Geel, Bỉ (IRMM-410) cung cấp,
có thể được sử dụng.
Các kiểm chứng thích hợp khác cần tiến hành
theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
A.1.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng A.3 được sử dụng cho nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt GeneAmpÒ 2400 hoặc GeneAmp Ò 9600 và AmpliTaq
GoldÒ ADN polymeraza 6).
Khi sử dụng máy khác thì phải chỉnh cho phù hợp. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymeraza
được sử dụng. Nếu sử dụng hot-start polymeraza, thì phải tuân theo khuyến cáo
của nhà sản xuất, trừ khi có quy định khác.
Bảng A.3 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10 min /95 oC
Khuếch đại gen
30 s /95 oC
30 s /60 oC
60 s /72 oC
Số chu trình
35
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
3 min/72 oC
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Vì phương pháp này chỉ để đánh giá như phương
pháp kiểm chứng để xác định chất lượng của ADN tách chiết được, nên việc nhận
dạng chỉ dựa vào kích thước của sản phẩm PCR.
Nếu sử dụng phương pháp này cho mục đích khác
thì việc nhận dạng sản phẩm khuếch đại có thể được xác định bằng lai Southern
sử dụng đầu dò lai đã được đánh dấu bằng digoxygenin (từ A.1.5.7 đến A.1.5.10)
hoặc đọc trình tự sản phẩm PCR và so sánh trình tự đó với các gen từ GenBank
trong Bảng A.1.5.5.
A.1.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích được coi là đã phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích thước của trình tự ADN đích dự
kiến, được xác định bằng cách so sánh với các sản phẩm thu được từ mẫu chuẩn
GTSÒ 40-3-2 đã được công
nhận (ví dụ các dãy IRMM-410 của IRMM, Geel, Bỉ).
Về nhận dạng, xem A.1.8.
Sản phẩm PCR có kích thước 118 bp chứng tỏ rằng
dung dịch ADN mẫu có chứa ADN gốc đậu tương có thể khuếch đại nằm trong giới
hạn đặc hiệu được mô tả trong A.1.2.2.
Chi tiết về điện di, xem B.2 của TCVN 7606 :
2007 (ISO 21571 : 2005).
A.2. Phương pháp đặc hiệu taxon-đích để phát
hiện các trình tự ADN nhiều bản sao có mặt trong diệp lục thực vật
A.2.1. Khái quát
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp này thích hợp để kiểm tra xem
việc tách chiết ADN từ mẫu thực phẩm có thành công hay không và để kiểm tra xem
mẫu có chứa ADN của thực vật với hàm lượng có thể phát hiện bằng cách khuếch
đại gen hay không. Đối với nguyên liệu đã qua chế biến, khả năng ứng dụng phương
pháp này phụ thuộc vào mức độ ADN bị phân hủy.
Thông thường tế bào thực vật chứa nhiều bản
sao của trình tự ADN này và kích thước của trình tự đích được khuếch đại về căn
bản lớn hơn các trình tự được sử dụng để phát hiện sự biến đổi đặc thù về gen.
Vì thế, phương pháp không được sử dụng làm kiểm chứng để định lượng ADN.
Số bản sao trên mỗi tế bào có thể khác nhau
giữa các loài và các mô thực vật.
A.2.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
A.2.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi các
nghiên cứu cộng tác [13] được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây
dựng phương pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền” theo
Điều 35 của luật thực phẩm của Liên bang Đức. Phương pháp CTAB được sử dụng để
tách chiết ADN được đưa ra trong TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005), A.3 (nhưng
phần mẫu thử là 100 mg).
Dữ liệu từ các nghiên cứu cộng tác được liệt
kê trong Bảng A.4.
Bảng A.4 - Kết quả từ
nghiên cứu cộng tác
Năm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số phòng thử nghiệm tham gia
18
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
18
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
10
Tổng số mẫu
180
Số kết quả được chấp nhận
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số mẫu khoai tây chứa B33-INV
71
Số mẫu không chứa khoai tây biến đổi gen
109
Kết quả dương tính giả
0 (0 %)
Kết quả âm tính giả
0 (0 %)
A.2.2.2. Đặc hiệu phân tử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phụ lục này trình bày chi tiết những yêu cầu
nêu trong điều 7.
Phương pháp được thiết kế cho trình tự đích được
mô tả trong [14], ví dụ: GenBankÒ, có số hiệu đăng ký No. Z00044, S54304, X15901.
A.2.2.2.2. Lý thuyết
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào từ các sinh vật không phải là thực
vật được tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (NCBI BlastNđ, dữ liệu EMBL, 28 tháng
9 năm 2001).
Mồi được thiết kế để khuếch đại một trình tự
duy nhất của ADN diệp lục (đoạn intron chèn vào gen trmL) cho thấy không
có tương đồng với trình tự khác đích.
A.2.2.2.3. Thực nghiệm
Không có đoạn ADN nào được khuếch đại khi sử
dụng ADN của động vật, nấm và vi khuẩn [14].
Trình tự ADN đích đã được khuếch đại khi sử
dụng ADN khuôn có nguồn gốc từ tảo, cyanobacteria, bryophytes, dương xỉ, cây
hạt trần và cây hạt kín [14].
Số bản sao của trình tự đích phụ thuộc vào
loài và kiểu mô thực vật.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giới hạn tuyệt đối không xác định được nhưng
phương pháp được chứng minh là có thể phát hiện với nồng độ ADN đậu tương nhỏ
hơn 0,1 ng. Nồng độ này đo được bằng máy huỳnh quang.
A.2.3. Điều chỉnh
Chưa có quy định cụ thể.
A.2.4. Nguyên tắc
Một đoạn ADN kích thước từ 500 bp đến 600 bp
có trong gen mã hóa tRNA của diệp lục
[14], được khuếch đại bằng PCR và được tách bằng điện di trên gel agaroza.
A.2.5. Thuốc thử
Chất lượng thuốc thử sử dụng, xem TCVN 7608 :
2007 (ISO 24276 : 2006).
A.2.5.1. Nước
A.2.5.2. Dung dịch đệm PCR (không có MgCl2),
10 x
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2,5.4. Dung dịch dNTP, c(dNTP) =
2,5 mmol/l (cho mỗi loại)
A.2.5.5. Oligonucleotit
A.2.5.5.1. Mồi xuôi
Gen tRNA của diệp lục (GenBankÒ số hiệu đăng ký No.
Z00044, X15901).
Mồi c [14]: 5'-CgA AAT Cgg TAg ACg CTA Cg-3'.
A.2.5.5.2. Mồi ngược
Gen tRNA của diệp lục (GenBankÒ số hiệu đăng ký No.
Z00044, X15901).
Mồi d [14]: 5'-ggg gAT AgA ggg ACT TgA AC-3'.
A.2.5.6. ADN polymeraza chịu nhiệt, 5 lU/ml.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Theo quy định trong A.1.6.
A.2.7. Cách tiến hành
A.2.7.1. Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng A.5. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng A.5 được chứng minh là phù hợp.
Bảng A.5 - Thành phần
thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (ml)
Mẫu ADN
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
Nước
13,9
10 x dung dịch đệm PCR (không có MgCI2)
1 x
2,5
dung dịcha MgCI2, 25 mmol/l
1,5 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
dung dịch dNTP, 10 mmol/l
0,8 mmol/l
2
Mồi c, 10 mmol/l
0,8 mmol/l
2
Mồi d, 10 mmol/l
0,8 mmol/l
2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5 IU
0,1
a Nếu dung dịch đệm PCR có sẵn MgCI2
thì nồng độ cuối cùng của MgCI2 trong mỗi hỗn hợp phản ứng nên
điều chỉnh đến 1,5 mmol/l.
A.2.7.2. Kiểm chứng PCR
Về kiểm chứng dương tính, mẫu chuẩn GTS
40-3-2 do Viện Vật liệu và Đo lường chuẩn (IRMM) Geel, Bỉ (IRMM-410) cung cấp
có thể được sử dụng.
Một số kiểm chứng thích hợp khác nên tiến
hành theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
A.2.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng A.6 được sử dụng cho nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt GeneAmpÒ 2400 hoặc GeneAmp Ò 9600 và AmpliTaq
Goldđ ADN polymeraza 7). Khi sử dụng máy khác thì phải chỉnh
cho phù hợp. Thời gian hoạt hóa/biến tính
ban đầu phụ thuộc vào polymeraza được sử dụng. Nếu sử dụng hot-start
polymeraza, thì phải tuân theo khuyến cáo của nhà sản xuất, trừ khi có quy định
khác.
Bảng A.6 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4 min/94°C
Khuếch đại
30 s/95 0C
30 s/55 0C
120 s/72 0C
Số chu trình
35
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
5 min/72 0C
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Vì phương pháp này chỉ được đánh giá như là
phương pháp đối chứng để xác định chất lượng của ADN được tách chiết nên không
biết chính xác kích thước của sản phẩm PCR. Do đó, việc nhận dạng chỉ dựa vào
kích thước sản phẩm PCR dự đoán trong khoảng từ 500 bp đến 600 bp.
A.2.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích được coi là đã phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích thước của trình tự ADN đích dự
kiến.
Về nhận dạng, xem A.2.8.
Sản phẩm PCR có kích thước từ 500 bp đến 600
bp chứng tỏ rằng dung dịch ADN có chứa ADN của thực vật với nồng độ nằm trong
giới hạn phát hiện đặc hiệu có thể khuếch đại để phát hiện được bằng PCR như
nêu trong A.2.2.2.
Chi tiết về điện di, xem B.2 của TCVN 7606 :
2007 (ISO 21571 : 2005).
A.3. Phương pháp đặc hiệu taxon-đích và sàng
lọc sinh vật biến đổi gen để phát hiện ADN từ cà chua và/hoặc cà chua biến đổi
gen ZenecaÒ.
A.3.1. Khái quát
Đây là quy trình thông thường để phát hiện
trình tự ADN có số bản sao đơn đặc hiệu của cà chua (Lycopersicon esculentum
Mill).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Không có công cụ nào thẩm tra việc nhận dạng
của sản phẩm PCR. Vì thế, phương pháp này không được coi là phương pháp nhận
dạng. Phương pháp này có thể sử dụng để đánh giá khả năng khuếch đại ADN của cà
chua.
A.3.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
A.3.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi các
nghiên cứu cộng tác [15] được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây
dựng phương pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền” theo
Điều 35 của luật thực phẩm của Liên bang Đức. Phương pháp CTAB được sử dụng để
tách chiết ADN được đưa ra trong A.3 của TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005).
Dữ liệu về nghiên cứu cộng tác được liệt kê
trong Bảng A.7.
Bảng A.7 - Kết quả từ
nghiên cứu cộng tác lần đầu
Năm
1998
Số phòng thử nghiệm tham gia
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
18
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
5
Số kết quả được chấp nhận
90
Số mẫu chứa Lycopersicon esculentum
Mill giống Ailsa Craig dòng Nema 282F (Zeneca)
43
Số mẫu chứa Lycopersicon esculentum
Mill giống Ailsa Craig dòng Nema 282C (không biến đổi gen)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kết quả dương tính giả
0 (0 %)
Kết quả âm tính giả
0 (0 %)
Một nghiên cứu cộng tác khác được tiến hành
bởi Viện Nghiên cứu Bảo vệ sức khỏe người
tiêu dùng và Thú y, Cộng hòa Liên bang Đức (BGVV) trong khuôn khổ Dự án Châu Âu
mã SMT4-CT96-2072 theo các tiêu chí trong TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Phương pháp
CTAB được sử dụng để tách chiết ADN được đưa ra trong TCVN 7606 : 2007 (ISO
21571 : 2005), A.3 (nhưng phần mẫu thử là 100 mg).
Bảng A.8 - Kết quả từ
nghiên cứu cộng tác thứ hai
Năm
1998
Số phòng thử nghiệm tham gia
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
19
Số mẫu của mỗi phòng
10
Số kết quả được chấp nhận
190
Số mẫu chứa Lycopersicon esculenlum
Mill giống Ailsa Craig dòng Nema 282F (Zeneca)
88
Số mẫu chứa Lycopersicon esculenlum
Mill giống Ailsa Craig dòng Nema 282C (không biến đổi gen)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kết quả dương tính giả
0 (0 %)
Kết quả âm tính giả
0 (0 %)
A.3.2.2. Đặc hiệu phân tử
A.3.2.2.1. Khái quát
Phụ lục này đáp ứng những yêu cầu nêu trong
điều 7.
Đây là phương pháp sử dụng để nhận dạng các
trình tự đích đã được mô tả, ví dụ trong GenBankđ mã hiệu No. X04583.
A.3.2.2.2. Lý thuyết
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.2.2.3. Thực nghiệm
Không có trình tự nào được khuếch đại từ ADN
của các cây trồng khác [16].
Số bản sao trình tự đích chưa xác định được,
nhưng người ta cho rằng đó là một gen đơn bản.
A.3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD tuyệt đối chưa xác định được nhưng phương
pháp đã thực hiện để khuếch đại đoạn ADN từ nồng độ 0,1 ng (xác định được bằng
huỳnh quang) được tách chiết từ cà chua tươi.
A.3.3. Điều chỉnh
Sử dụng mẫu qua chế biến kỹ có thể cho kết
quả âm tính do không còn đoạn trình tự đích có kích thước lớn hơn 383 bp.
Việc phát hiện các sản phẩm PCR có kích thước
383 bp chứng tỏ dung dịch ADN mẫu có chứa ADN của cà chua nguyên gốc, còn sản
phẩm PCR có kích thước 180 bp chứng tỏ dung dịch ADN mẫu chứa gen từ cà chua
biến đổi gen (Zeneca; Lycopersicon esculentum Mill giống Ailsa Craig
dòng Nema 282F).
A.3.4. Nguyên tắc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.5. Thuốc thử
Chất lượng của thuốc thử, xem TCVN 7608 :
2007 (ISO 24276 : 2006).
A.3.5.1. Nước
A.3.5.2. Dung dịch đệm PCR (không có MgCI2),
10 x
A.3.5.3. Dung dịch MgCI2, c(MgCI2)
= 25 mmol/l
A.3.5.4. Dung dịch dNTP, c(dNTP) =
2,5 mmol/l (cho mỗi loại)
A.3.5.5. Oligonucleotit
A.3.5.5.1. Mồi xuôi
Gen PG (GenBankÒ số hiệu No. X04583).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.5.5.2. Mồi ngược
Gen PG (GenBankÒ số hiệu No. X04583).
Mồi PG34R: 5'-CgT Tgg TgC ATC CCT gCA Tgg-3'.
A.3.5.6. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho hot-start
PCR), 5 lU/ml.
A.3.6. Thiết bị, dụng cụ
Như quy định trong A.1.6.
A.3.7. Cách tiến hành
A.3.7.1. Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng A.9. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng A.9 được chứng minh là phù hợp.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (μl)
Mẫu ADN
10 ng - 50 ng
1
Nước
16,8
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1 x
2,5
Dung dịch MgCI2a, 25
mmol/l
1,5 mmol/l
1,5
Dung dịch dNTP, 10mmol/l
0,4 mmol/l
1
Mồi PG34L 10 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
Mồi PG34R 10 mmol/l
0,4 mmol/l
1
Taq ADN polymeraza, 5 lU/ml
1 IU
0,2
a Nếu dung dịch đệm cho PCR có sẵn MgCI2
thì nồng độ cuối cùng của MgCI2 hỗn hợp phản ứng phải được điều chỉnh đến
1,5 mmol/l.
A.3.7.2. Kiểm chứng PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các phép kiểm chứng thích hợp khác cần tiến
hành theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
A.3.7.3 Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng A.10 được sử dụng cho nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt GeneAmpÒ 2400 hoặc GeneAmp Ò 9600 và AmpliTaq GoldÒ ADN polymeraza 9).
Khi sử dụng máy khác thì phải chỉnh cho phù hợp. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymeraza
được sử dụng. Nếu sử dụng hot-start polymeraza, thì phải tuân theo khuyến cáo
của nhà sản xuất, trừ khi có quy định khác.
Bảng A.10 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
Hoạt hóa, biến tính ban đầu
10 min/95 °C
Khuếch đại
30 s/94 °C
60 s/60 °C
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số chu trình
35
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
6 min/72 °C
A.3.8. Nhận dạng
Như đã trình bày, việc nhận dạng cơ bản chỉ
dựa vào kích thước sản phẩm PCR.
A.3.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích được coi là đã phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích thước của trình tự ADN đích dự
kiến, được xác định bằng cách so sánh với sản phẩm được tạo ra từ mẫu chuẩn từ
cà chua.
Nhận dạng sản phẩm PCR, xem A.3.8.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chi tiết về các bước điện di, xem B.2 của
TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005).
A.4. Phương pháp đặc hiệu taxon-đích để phát
hiện các thành phần có nguồn gốc từ ngô
A.4.1. Khái quát
Đây là quy trình thông thường để phát hiện
trình tự gen invertaza có số bản sao đơn đặc hiệu của ngô (Zea mays).
Không có công cụ nào thẩm tra việc nhận dạng
của sản phẩm PCR. Vì thế, phương pháp này không được coi là phương pháp nhận
dạng. Phương pháp này có thể sử dụng để đánh giá khả năng khuếch đại ADN của
ngô.
A.4.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
A.4.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi các
nghiên cứu cộng tác, được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu bảo
vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây dựng phương
pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền” theo Điều 35 của
luật thực phẩm của Liên bang Đức. Phương pháp CTAB được sử dụng để tách chiết
ADN được đưa ra trong A.3 của TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005) và một nửa số
phòng thử nghiệm tham gia đã sử dụng WizardÒ ADN-Clean-Up-System 10).
Dữ liệu từ nghiên cứu cộng tác được liệt kê
trong Bảng A.11.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Năm
1999
Số phòng thử nghiệm tham gia
18
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
16
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
6
Số kết quả được chấp nhận
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số mẫu có Bt-176
32
Số mẫu có Bt-11
32
Số mẫu không chứa ngô biến đổi hen
32
Kết quả dương tính giả
0 (0 %)
Kết quả âm tính giả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.4.2.2. Đặc hiệu phân tử
A.4.2.2.1. Khái quát
Phụ lục này đáp ứng những yêu cầu nêu trong
điều 7.
Phương pháp được thiết kế để phát hiện trình
tự như mã số No. U16123 trong ngân hàng gen.
A.4.2.2.2. Lý thuyết
Gen mã hóa
invertaza của ngô thu được từ cơ sở dữ liệu trình tự ADN được chọn làm trình tự
đích.
Một số trình tự tương đồng với một số trình
tự ADN của cây trồng khác (cây đậu, cây ngũ cốc, rau) và của người, côn trùng được
tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (NCBI BlastNÒ search, EMBL
database, ngày 28 tháng 9 năm 2001).
Mồi IVR1-F được lấy từ:
- invertaza IVR1 axit, tan của cây ngô No.
AF171874 (100 % phù hợp);
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- trình tự 22 có số hiệu đăng ký AX033514 từ
bản quyền DE19906169 (21 nucleotit liên tiếp giống nhau).
Mồi IVR1-R được lấy từ:
- invertaza IVR1 axit, tan của cây ngô No.
AF171874 (100 % giống nhau);
- trình tự 30 có số hiệu đăng ký AX150234 từ
bản quyền WO0132919 (100 % giống nhau);
- mRNA phiên mã cho beta-fructosidaza của Triticum
aestivum số hiệu đăng ký AJ224681 (20 nucleotit liên tiếp giống nhau);
- invertaza axit tan của Saccharum
officinarum số hiệu đăng ký AF062735 (19 nucleotit liên tiếp giống nhau);
- invertaza axit tan của Saccharum
robustum số hiệu đăng ký AF062734 (19 nucleotit liên tiếp giống nhau). Số
bản sao của trình tự đích chưa được xác định nhưng được cho là một gen đơn bản.
A.4.2.2.3. Thực nghiệm
Thử nghiệm khuếch đại ADN từ ngô bằng PCR cho
kết quả đặc hiệu cao [21].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
LOD tuyệt đối chưa được xác định, nhưng người
ta đã xác định được là phương pháp có thể khuếch đại với nồng độ ADN £ 0,1 ng được tách chiết từ hạt ngô
(xác định được bằng quang phổ) [20].
A.4.3. Điều chỉnh
Chưa có quy định cụ thể.
A.4.4. Nguyên tắc
Gen mã hóa
cho invertaza của ngô mã hóa cho enzym
tham gia trong quá trình trao đổi carbonhydrat. Một đoạn ADN 226 bp của gen mã hóa invertaza của ngô được khuếch đại bằng PCR
và được tách bằng điện di trên gel agaroza.
A.4.5. Thuốc thử
Chất lượng thuốc thử sử dụng, xem TCVN 7608 :
2007 (ISO 24276 : 2006).
A.4.5.1. Nước
A.4.5.2. Dung dịch đệm PCR (không có
MgCI2), 10 x.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.4.5.4. Dung dịch dNTP, c(dNTP) =
2,5 mmol/l.
A.4.5.5. Oligonucleotit
A.4.5.5.1. Mồi xuôi
Gen invertaza của ngô (số hiệu đăng ký trên
ngân hàng gen No. U16123).
Mồi IVR1-F: 5'-CCg CTg TAT CAC AAg ggC Tgg
TAC C-3'.
A.4.5.5.2. Mồi ngược
Gen invertaza của ngô (số hiệu đăng ký trên
ngân hàng gen No. U16123).
Mồi IVR1-R: 5'-ggA gCC CgT gTA gAg CAT gAC
gAT C-3'.
A.4.5.6. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho hot-start
PCR), 5 lU/ml.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Như quy định trong A.1.6.
A.4.7. Cách tiến hành
A.4.7.1 Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng A.12. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng A.12 được chứng minh là phù hợp.
Bảng A.12 - Thành
phần thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (ml)
ADN Mẫu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2
Nước
15,3
Đệm chạy PCR 10x (không có MgCI2)
1 x
2,5
Dung dịch MgCI2 a ,
25 mmol/l
1,5 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l
0,4 mmol/l
1
Mồi IVR1-F, 10 mmol/l
0,5 mmol/l
1,25
Mồi IVR1-R, 10 mmol/l
0,5 mmol/l
1,25
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1 IU
0,2
a Nếu dung dịch đệm cho PCR đã có sẵn MgCl2
thì nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng được điều chỉnh đến1,5
mmol/l.
A.4.7.2. Kiểm chứng PCR
Về kiểm chứng dương tính, có thể sử dụng mẫu
chuẩn đã được công nhận, ví dụ ngô Bt 11 (IRMM-412) hoặc ngô dòng (Event) 176
(Bt 176) (IRMM-411).
Các phép kiểm chứng thích hợp khác tiến hành
theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
A.4.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng A.13 được sử dụng cho nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt GeneAmpÒ 2400 hoặc GeneAmp Ò 9600 và AmpliTaq
GoldÒ ADN polymeraza 11).
Khi sử dụng máy khác thì phải chỉnh cho phù hợp. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymeraza
được sử dụng. Nếu sử dụng hot-start polymeraza, thì phải tuân theo khuyến cáo
của nhà sản xuất, trừ khi có quy định khác.
Bảng A.13 - Chương
trình thời gian - nhiệt độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
12m in/95 oC
Khuếch đại
30 s/95 oC
30 s/64 oC
60 s/72 oC
Số chu trình
35
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
10 min/72 oC
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Việc nhận dạng chỉ dựa vào kích thước sản
phẩm PCR.
A.4.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích được coi là đã phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích thước của trình tự ADN đích dự
kiến, được xác định bằng cách so sánh với sản phẩm được tạo ra từ mẫu ngô chuẩn
(ví dụ, IRMM-412 [Bt11 ngô] hoặc IRMM-411 [Ngô dòng 176] do IRMM, Geel, Bỉ cung
cấp.
Nhận dạng sản phẩm PCR, xem A.4.8.
Sản phẩm PCR có kích thước 226 bp cho thấy
dung dịch mẫu ADN có chứa ADN của ngô gốc, với nồng độ AND nằm trong giới hạn
phát hiện đặc hiệu nêu trong A.4.2.2.
Chi tiết về các bước
điện di xem B.2 của TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005).
PHỤ LỤC
B
(tham khảo)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.1. Phương pháp sàng lọc để phát hiện ADN
của thực vật biến đổi gen (promoter 35S- CaMV)
B.1.1. Khái quát
Phương pháp này để phát hiện trình tự ADN có
nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) 35S của virut khảm súp lơ (CaMV) có số
bản sao khác nhau. Do promoter 35S-CaMV có mặt trong một số thực vật biến đổi
gen, nên phương pháp này có thể được sử dụng để sàng lọc sự có mặt của ADN có
nguồn gốc từ thực vật biến đổi gen [22], [23].
B.1.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
B.1.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp này được đánh giá hiệu lực bởi
nhiều nghiên cứu cộng tác tiến hành trên các chất nền thực phẩm qua chế biến
[24], [25].
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi
nghiên cứu cộng tác [24] được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây
dựng phương pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền”. Số
phòng thử nghiệm tham gia cũng như số mẫu được nêu trong TCVN 6910-2 (ISO
5725-2). Phương pháp CTAB được sử dụng để tách chiết ADN được đưa ra trong A.3
của TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005) (nhưng phần mẫu thử là 100 mg).
Dữ liệu nghiên cứu cộng tác được liệt kê
trong bảng B.1
Bảng B.1 - Kết quả
nghiên cứu cộng tác
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1999
Số phòng thử nghiệm tham gia
27
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
23
Số mẫu nghiên cứu của mỗi phòng
5
Số kết quả được chấp nhận
115
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
59
Số mẫu chứa đậu tương không biến đổi gen
56
Kết quả dương tính giả
0 (0 %)
Kết quả âm tính giả
0 (0 %)
B.1.2.2. Đặc hiệu phân tử
B.1.2.2.1. Khái quát
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp được thiết kế cho trình tự đích được
mô tả trong GenBankÒ, có số hiệu đăng ký No.V00141.
Danh mục thực vật biến đổi gen có chứa
Promoter 35S-CaMV được liệt kê trong phần phụ lục của [24].
Kết quả dương tính giả có thể xảy ra vì trình
tự được khuếch đại có nguồn gốc từ virut khảm súp lơ gây bệnh cho súp lơ và các
thành viên khác thuộc họ Brassicaceae (Cruciferae) cũng như họ Resedaceae
và Solanaceae [26], [27].
Vì thế, kết quả dương tính từ các mẫu Brassicaceae,
Resedaceae và Solanaceae cần được xử lý cẩn thận. Kết quả dương tính
có thể chỉ ra sự có mặt của các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật biến đổi gen
nhưng không nên kết luận khi chưa có thêm bằng chứng xác đáng.
Để phân biệt giữa nhiễm virut và vật liệu
biến đổi gen, phương pháp phát hiện virut gây nhiễm súp lơ có thể được sử dụng
[6].
B.1.2.2.2. Lý thuyết
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào từ cây trồng không biến đổi gen được
tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (NCBI BlastNÒ, EMBL database, 28
tháng 9 năm 2001) được tìm thấy. Tuy nhiên, cả hai mồi đều trùng hợp với trình
tự mà không thể xác định được đó là trình tự virut khảm súp lơ hay trình tự
trong vector tái tổ hợp hay bản quyền mã: S70105 cp (protein vỏ) [virut khảm dưa
chuột]. Mồi cũng trùng hợp với hơn 100 trình tự của virut khảm súp lơ, vector
tái tổ hợp, các bản quyền.
B.1.2.2.3. Thực nghiệm
Sản phẩm PCR được khuếch đại không có ở ADN
của cây trồng không biến đổi gen và không bị nhiễm virut [22], [24], [25],
[28].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số bản sao của trình tự ADN là khác nhau.
B.1.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn tuyệt đối chưa xác định được. LOD tương
đối đã được chứng minh với nồng độ bột đậu tương biến đổi gen chiếm 0,1 % (khối
lượng) bột đậu tương IRMM-410 và hàm lượng ngô biến đổi gen dòng (Event) 176
(Bt 176) IRMM-411 chiếm 0,1 % (khối lượng) trong bột ngô (mẫu chuẩn đã được
công nhận CRMs) [25].
B.1.3. Điều chỉnh
Chưa có quy định cụ thể.
B.1.4. Nguyên tắc
Đoạn ADN 195 bp trong promoter 35S-CaMV được
khuếch đại bằng PCR và được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza sau khi
tách. Để nhận dạng chính xác sản phẩm PCR, phải tiến hành các bước thẩm tra
tiếp theo.
Promoter là vùng được nhận dạng bởi
ARN-polymeraza (RNA-polymeraza), chịu trách nhiệm cho việc biểu hiện gen. Vì
thế, promoter 35S-CaMV cấu thành thường được sử dụng trong thực vật biến đổi
gen [24].
B.1.5. Thuốc thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.1.5.1. Nước
B.1.5.2. Dung dịch đệm PCR (không chứa
MgCI2), 10 x
B.1.5.3. Dung dịch MgCI2, c(MgCI2)
= 25 mmol/l
B.1.5.4. Dung dịch dNTP, c(dNTP) =
2,5 mmol/l (cho mỗi loại)
B.1.5.5. Oligonucleotit
B.1.5.5.1. Mồi xuôi
Promoter 35S-CaMV, 35s-1: (2),(28)5'-
gCT OCT ACA AAT gCC ATC A -3'.
Mồi xuôi cùng với mồi ngược được thiết kế để
khuếch đại trình tự mã No. V00141.
B.1.5.5.2. Mồi ngược
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mồi ngược cùng với mồi xuôi được thiết kế để
khuếch đại trình tự mã No. V00141.
B.1.5.6. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho hot-start
PCR), 5 lU/ml.
B.1.5.7. Enzym giới hạn: Xmn I (= Asp 700).
B.1.6. Thiết bị, dụng cụ
B.1.6.1. Máy chu trình nhiệt
B.1.6.2. Bộ điện di, có nguồn cung cấp.
B.1.7 Cách tiến hành (Chuẩn bị PCR)
B.1.7.1. Khái quát
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng B.2. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng B.2 được chứng minh là phù hợp.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (ml)
Mẫu ADN
10 ng - 50 ng
1
Nước
15,9
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1 x
2,5
Dung dịch MgCI2 a, 25
mmol/l
1,5 mmol/l
1,5
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l
0,8 mmol/l
2
Mồi 35s-1,5 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
Mồi 35S-2,5 mmol/l
0,2 mmol/l
1
Taq ADN polymeraza, 5 lU/ml
0,5 IU
0,1
a Nếu dung dịch đệm PCR có sẵn MgCI2,
thì nồng độ cuối cùng của MgCI2 được điều chỉnh đến 1.5 mmol/l.
B.1.7.2. Kiểm chứng PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các kiểm chứng thích hợp khác cần tiến hành
theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
B.1.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng A.3 được sử dụng cho nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt GeneAmpÒ 2400 hoặc GeneAmp Ò 9600 và AmpliTaq
GoldÒ ADN polymeraza12).
Khi sử dụng máy khác thì phải chỉnh cho phù hợp. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymeraza
được sử dụng. Nếu sử dụng hot-start polymeraza, thì phải tuân theo khuyến cáo
của nhà sản xuất, trừ khi có quy định khác.
Bảng B.3 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
Hoạt hóa, biến tính ban đầu
10 phút/95oC
Quá trình khuếch đại
20 s/94oC
40 s/54oC
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số chu trình
40
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
3 min/72oC
B.1.8. Nhận dạng
Việc nhận dạng sản phẩm PCR có thể phải được
kiểm tra bằng enzym giới hạn Xmn I. Enzym này cắt sản phẩm PCR thành 2
đoạn (có kích thước 115 bp và 80 bp) [22], [24].
B.1.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích được coi là đã phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích thước của trình tự ADN đích dự
kiến, được xác định bằng cách so sánh với các sản phẩm thu được từ mẫu chuẩn
(ví dụ [GTSÒ 40-3-2] các dãy
IRMM-410 của IRMM, Geel, Bỉ).
Về nhận dạng, xem B.1.8.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chi tiết về điện di, xem B.2 của TCVN 7606 :
2007 (ISO 21571 : 2005).
B.2. Phương pháp sàng lọc thay thế để phát
hiện ADN của thực vật biến đổi gen (promoter 35S-CaMV)
B.2.1. Khái quát
Phương pháp này dùng để phát hiện trình tự
ADN promoter 35S từ virut khảm súp lơ (CaMV) có số bản sao khác nhau trong các
chất nền thực phẩm đã qua chế biến. Do promoter 35S-CaMV có mặt ở nhiều thực
vật biến đổi gen nên phương pháp này có thể sử dụng để sàng lọc ADN có nguồn
gốc từ thực vật biến đổi gen [22], [23], [29].
Không có biện pháp nào để kiểm chứng việc
nhận dạng các sản phẩm PCR. Do đó, phương pháp này không được coi là phương
pháp nhận dạng. Phương pháp này chỉ có thể sử dụng để đánh giá khả năng khuếch
đại của đoạn trình tự đích.
B.2.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
B.2.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực theo
TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Nghiên cứu cộng tác giữa 23 phòng thử nghiệm của châu
Âu và được điều phối bởi EC JRC [29], [30]. Phương pháp được đánh giá cho việc
phát hiện các sinh vật biến đổi gen trong nhiều chất nền thực phẩm đã qua chế
biến (hạt ngô luộc, sữa dành cho cho trẻ nhỏ, bánh bích quy, thức ăn chứa đậu tương
đã bị axit hóa) chứa 0 %, 2 %, và 100 %
(10 % thay cho 100 % đối với bánh bích quy) của GTS 40-3-2 hoặc dòng (Event)
176. Mỗi phòng thử nghiệm tham gia nhận 4 mẫu đối chứng và 30 mẫu kép độc lập
chưa biết trong đó có 10 mẫu chứa 0 % sinh vật biến đổi gen và 20 mẫu chứa các
phần trăm khác nhau của mẫu biến đổi gen. Tất cả các phòng đều nhận được bản mô
tả phương pháp chi tiết để tách ADN bằng CTAB hoặc bằng bộ kit có sẵn trên thị
trường. Tuy nhiên, các phòng thử nghiệm đã tự do sử dụng các phương pháp của họ
để tách ADN trong khi các điều kiện cho PCR phải được tối ưu hóa đối với các
thiết bị tại chỗ của họ để có kết quả đặc hiệu. Các phòng phải phân tích mỗi
mẫu một lần và xem xét chính xác mẫu dương tính hay âm tính với sinh vật biến
đổi gen. Vì hầu hết các phòng thử nghiệm đều có kết quả đúng (14 phòng có số tỷ
lệ đúng 90 % đến 100 %; và 3 phòng có tỷ lệ đúng 80 % đến 90 %) và không có tỷ
lệ đúng trong khoảng 70 % đến 80 %, nên giới hạn kết quả đúng được chọn là 80
%. Do đó, 5 phòng thử nghiệm không được đưa vào phân tích thống kê tiếp theo.
Trung bình 96,1 % kết quả đúng đối với mẫu chứa thực vật không biến đổi gen
(3,9 % kết quả dương tính giả) và trung bình 98,1 % kết quả đúng đối với mẫu có
chứa sinh vật biến đổi gen (1,9 % kết quả âm tính giả) [30]. Kết quả được nêu
trong Bảng B.4.
Bảng B.4 - Kết quả
của nghiên cứu cộng tác
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1999
Số phòng thử nghiệm tham gia
30
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
18
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
12
Tổng số mẫu
360
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
540
Kết quả dương tính giả
3,9 %
Kết quả âm tính giả
1,9 %
B.2.2.2. Đặc hiệu phân tử
B.2.2.2.1. Khái quát
Phụ lục này trình bày chi tiết những yêu cầu
nêu trong điều 7.
Phương pháp được thiết kế cho trình tự đích được
mô tả, ví dụ trong GenBankÒ,
có số hiệu đăng ký No. V00141. Danh mục các thực vật biến đổi gen chứa promoter
35S-CaMV, xem [23] và [24].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kết quả dương tính từ các mẫu Brassicaceae,
Resedaceae và Solanaceae phải được xử lý cẩn thận. Kết quả dương
tính có thể chỉ ra sự có mặt của sản phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen
nhưng để chắc chắn thì phải kiểm tra và có bằng chứng.
Để phân biệt giữa sự nhiễm virut và nguyên
liệu biến đổi gen, phương pháp phát hiện virut khảm súp lơ có thể được sử dụng
[6].
B.2.2.2.2. Lý thuyết
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào từ các sinh vật không phải là thực
vật được tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (NCBI BlastNÒ, dữ liệu EMBL, 28
tháng 9 năm 2001). Mồi bắt cặp được với hàng loạt gen trong ngân hàng gen, và
bắt cặp tốt nhất với gen của virut khảm súp lơ, vector tái tổ hợp và các bằng
phát minh.
B.2.2.2.3. Thực nghiệm
Không có trình tự nào được khuếch đại khi sử
dụng ADN của đậu tương không biến đổi gen cho thử nghiệm trước khi tiến hành
nghiên cứu cộng tác [29].
B.2.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn tuyệt đối cho phương pháp này chưa
xác định được, nhưng nó đã được thử nghiệm để phát hiện ít nhất 50 bản sao ADN
của GTS 40-3-2 [29].
LOD tương đối được xác định nhưng nghiên cứu
cộng tác [8] đã chỉ ra rằng có thể phát hiện được trong bánh bích quy, sữa dành
cho trẻ em và đậu tương axit hóa có chứa
sinh vật biến đổi gen [GTS 40-3-2 (đậu tương Roundup ReadyÒ) và/ hoặc ngô dòng
(Event) 176 (Bt 176)] chiếm 2 %, kết quả chính xác 100 % [30].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chưa có quy định cụ thể.
B.2.4. Nguyên tắc
Đoạn ADN có kích thước 123 bp từ promoter
35S-CaMV được khuếch đại bằng PCR và phát hiện được bằng điện di trên gel
agaroza. Việc nhận dạng sản phẩm PCR có thể được kiểm tra xác nhận, ví dụ bằng
cách giải trình tự. Tuy nhiên chưa có quy trình thẩm tra nào được xác nhận có
hiệu lực.
Promoter là trình tự được RNA polymeraza nhận
dạng và gắn vào, chúng chịu trách nhiệm cho việc biểu hiện gen. Vì thế promoter
35S-CaMV thường được sử dụng trong thực vật biến đổi gen [22].
B.2.5. Thuốc thử
Chất lượng của thuốc thử, xem TCVN 7608 :
2007 (ISO 24276 : 2006).
B.2.5.1. Nước
B.2.5.2. Dung dịch đệm PCR, c(MgCI2)
= 15 mmol/l, 10 x
B.2.5.3. dNTP dung dịch, c(dNTP) = 4
mmol/l (cho mỗi loại)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.2.5.4.1. Mồi xuôi
Promoter 35S-CaMV, 35s-cf3: 5'- CCA CgT CTT
CAA AgC AAg Tgg-3'.
Mồi xuôi được thiết kế để khuếch đại promoter
35S-CaMV ví dụ gen với mã hiệu No. V00141.
B.2.5.4.2. Mồi ngược
Promoter 35S-CaMV, 35s-cr4: 5'-TCC TCT CCA
AAT gAA ATg AAC TTC C-3'.
Được thiết kế để khuếch đại promoter
35S-CaMV, ví dụ gen với mã hiệu No. V00141.
B.2.5.5. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho hot-start
PCR), 5 lU/ml.
B.2.6. Thiết bị, dụng cụ
Được quy định trong B.1.6.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.2.7.1. Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng B.5. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng B.5 được chứng minh là phù hợp.
Bảng B.5 - Thành phần
thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (ml)
Mẫu ADN
5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
14,84
Đệm PCR 10 x (có
MgCI2 15 mmol/l)a
1 x
2,5
Dung dịch dNTP, 16 mmol/l
0,64 mmol/l
1
Mồi 35s-cf3, 20 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,75
Mồi 35S-cr4, 20 mmol/l
0,6 mmol/l
0,75
Taq ADN polymeraza, 5 lU/ml
0,8 IU
0,16
a Nếu sử dụng đệm PCR không chứa MgCI , thể
tích và nồng độ của mỗi thuốc thử nên điều chỉnh lại cho hợp lý.
B.2.7.2. Kiểm chứng PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các kiểm chứng thích hợp khác nên tiến hành
theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
B.2.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng A.6 được sử dụng cho nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt của Perkin Elmer 2400/9600/9700 và AmpliTaq GoldÒ ADN polymeraza13).
Khi sử dụng máy khác thì phải chỉnh cho phù
hợp. Thời gian để hoạt hóa/biến tính ban
đầu phụ thuộc vào polymeraza được sử dụng. Nếu sử dụng hot-start polymeraza,
thì phải tuân theo khuyến cáo của nhà sản xuất, trừ khi có quy định khác.
Bảng B.6 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
Hoạt hóa, biến tính ban đầu
10 min/95 °C
Khuếch đại
25 s/95 oC
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
45 s/72 oC
Số chu trình
50
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
7 min/72 oC
B.2.8. Nhận dạng
Nên thẩm tra sản phẩm PCR được khuếch đại từ
mẫu không biết, ví dụ bằng enzym giới hạn, đọc trình tự ADN hoặc lai ADN.
B.2.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích được coi là đã phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích thước của trình tự ADN đích dự
kiến, được xác định bằng cách so sánh với sản phẩm PCR khuếch đại từ mẫu chuẩn
có trình tự ADN đích đã được chứng nhận (ví dụ mẫu IRMM-410 từ IRMM, Geel, Bỉ).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sản phẩm PCR có kích thước 123 bp chứng tỏ
mẫu ADN có chứa ADN promoter 35S-CaMV có nồng độ nằm trong giới hạn phát hiện
trong B.2.2.2.
Chi tiết về điện di, xem B.2 của TCVN 7606 :
2007 (ISO 21571 : 2005).
B.3. Phương pháp sàng lọc để phát hiện ADN
thực vật biến đổi gen (NOS-terminator của Agrobacterium tumefaciens)
B.3.1. Khái quát
Phương pháp này dùng để phát hiện trình tự
kết thúc (terminator) trên gen nopalin synthaza (NOS) có số lượng bản sao khác
nhau có nguồn gốc từ Agrobacterium tumefaciens. Do nhiều thực vật biến
đổi gen có chứa trình tự NOS-terminator nên phương pháp này có thể được sử dụng
để sàng lọc sự có mặt của thành phần từ thực vật biến đổi gen [22], [23] [29],
[30].
Không có công cụ nào thẩm tra việc nhận dạng
của sản phẩm PCR. Vì thế, phương pháp này không được coi là phương pháp nhận
dạng. Phương pháp này có thể sử dụng để đánh giá khả năng khuếch đại ADN chứa
trình tự đích.
B.3.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
B.3.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực theo
TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Nghiên cứu cộng tác giữa 23 phòng thử nghiệm của châu
Âu và được điều phối bởi EC JRC [29], [30]. Phương pháp được đánh giá để phát
hiện các sinh vật biến đổi gen trong nhiều chất nền thực phẩm đã qua chế biến
(hạt ngô luộc, sữa cho trẻ, bánh bích quy, thức ăn chứa đậu tương đã bị axit hóa) chứa 0 %, 2 %, và 100 % (10 % thay cho 100
% đối với bánh bích quy) của GTS 40-3-2 hoặc dòng (Event) 176. Vì ngô dòng
(Event) 176 không có trình tự NOS-terminator, nên mẫu chứa dòng (Event) 176
không được đánh giá bằng phương pháp này. Tuy nhiên, vì nghiên cứu cộng tác được
tổ chức có liên quan đến phương pháp phát hiện promoter 35S nên tất cả mẫu được
đưa vào đều được sử dụng để đánh giá. Kết quả PCR từ hạt ngô luộc đã không được
đưa vào trong phân tích thống kê tiến hành ở giai đoạn sau.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng B.7 - Kết quả từ
nghiên cứu cộng tác
Năm
1999
Số phòng thử nghiệm tham gia
30
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
18
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
12
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
360
Số kết quả được chấp nhận
540
Kết quả dương tính giả
1,8%
Kết quả âm tính giả
2,1%
B.3.2.2. Đặc hiệu phân tử
B.3.2.2.1. Khái quát
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp được thiết kế để xác định sự có
mặt của trình tự kết thúc mã hóa nopalin
synthaza của Agrobacterium tumefaciens mô tả trong ngân hàng gen với số
hiệu No.V00087.
Kết quả dương tính giả có thể xuất hiện vì
trình tự được khuếch đại là của Agrobacterium, một vi sinh vật đất có
trong tự nhiên. Các kết quả dương tính này có thể nói lên sự có mặt của sản
phẩm từ cây trồng biến đổi gen nhưng không nên nói chắc chắn điều đó nếu không
có thêm xác nhận. Nên xem xét khả năng nguyên liệu sử dụng bị nhiễm Agrobacterium
hoặc vi khuẩn có liên quan.
B.3.2.2.2. Lý thuyết
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào từ các thực vật không biến đổi gen được
tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (tìm trong NCBI BlastNÒ, ngân hàng dữ liệu
EMBL, ngày 28 tháng 9 năm 2001). Chú ý mồi ngược giống 100 % với gen mã hóa polymeraza của virut ức chế sinh trưởng ở
lúa số hiệu AF015682. Cả hai mồi để có khả năng phù hợp với nhiều trình tự đã được
đăng ký và phù hợp nhất với các vector tách dòng, gen trong bản quyền cũng như
với gen mã hóa nopalin synthaza.
B.3.2.2.3. Thực nghiệm
Không có trình tự nào được khuếch đại từ cây
trồng và các chất nền thực phẩm chế biến từ cây trồng không biến đổi gen. Kết
quả này tiến hành trước nghiên cứu cộng tác giữa các phòng thử nghiệm [30].
B.3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện tuyệt đối không xác định được,
nhưng phương pháp này đã có thể phát hiện 50 bản sao ADN của GST 40-3-2.
Trong nghiên cứu cộng tác, phương pháp này có
thể phát hiện được khi hàm lượng GTS 40-3-2 (đậu tương Roundup ReadyÒ) chiếm 2 % trong
bánh bích quy, sữa bột dành cho trẻ em, sữa chua đậu tương với độ chính xác tối
thiểu là 96,4 % [29].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chưa có quy định cụ thể.
B.3.4. Nguyên tắc
Đoạn ADN có kích thước 118 bp nằm trong trình
tự kết thúc (terminator) của NOS được khuếch đại bằng PCR và được phát hiện
bằng điện di trên gel agaroza. Việc nhận dạng sản phẩm phải được thẩm tra ví dụ
bằng giải trình tự ADN. Tuy nhiên chưa có quy trình thẩm tra nào được xác nhận
hiệu lực.
B.3.5. Thuốc thử
Chất lượng của các thuốc thử xem trong TCVN
7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
B.3.5.1. Nước
B.3.5.2. Dung dịch đệm PCR, c(MgCl2)
= 15 mmol/l, 10 x
B.3.5.3. Dung dịch dNTP, c(dNPT) = 4
mmol/l (cho mỗi loại)
B.3.5.4. Oligonucleotit
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
NOS-terminator của Agrobacterium
tumefaciens, HA-nos118f: 5’-gCA TgA CgT TAT TTA TgA gATggg-3’. Mồi được
thiết kế để khuếch đại trình tự có số hiệu đăng ký No. V00087.
B.3.5.4.2. Mồi ngược
NOS-terminator của Agrobacterium
tumefaciens, HA-nos118r: 5’-gAC ACC gCg CgC AgT AAT TTA TCC-3’.
Mồi được thiết kế để khuếch đại trình tự có
số hiệu đăng ký No. V00087.
B.3.5.5. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho hot-start
PCR), 5 IU/ml.
B.3.6. Thiết bị, dụng cụ
Theo quy định trong B.1.6
B.3.7. Cách tiến hành (Chuẩn bị PCR)
B.3.7.1. Khái quát
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng B.8 - Thành phần
thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (μl)
Mẫu ADN
5
Nước
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đệm PCR 10x (có 15 mmol/l MgCl2)a
1x
2,5
dNTP, 16 mmol/l
0,64 mmol/l
1
Mồi HA-nos118f, 20 mmol/l
0,6 mmol/l
0,75
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,6 mmol/l
0,75
Taq ADN polymeraza, 5 IU/ml
0,8 IU
0,16
a Nếu dung dịch đệm PCR không có MgCl2,
nồng độ và thể tích cần được điều chỉnh cho phù hợp
B.3.7.2. Kiểm chứng PCR
Kiểm chứng dương tính có thể sử dụng mẫu
chuẩn GST 40-3-2 (chứa 0,1 % thành phần thực vật biến đổi gen) do Viện Vật liệu
và Đo lường chuẩn [Institute for Reference Materials AND Measurements (IRMM)]
Geel, Bỉ (IRMM-410) cung cấp.
Các kiểm chứng thích hợp khác nên tiến hành
theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng B.9 đã được sử dụng cho nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy PCR
của Perkin Elmer 2400/9600/9700 và AmpliTaq GoldÒ ADN polymeraza14).
Nếu sử dụng máy khác thì cần điều chỉnh thích hợp. Thời gian cho hoạt hóa, biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymeraza
sử dụng. Nếu dùng hot-start polymeraza, nhà sản xuất khuyên nên giữ nguyên chương
trình trừ khi quy trình có quy định khác.
Bảng B.9 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
Hoạt hóa, biến tính ban đầu
10 min/95 °C
Khuếch đại
25 s/95 oC
30 s/62 oC
45 s/72 oC
Số chu trình
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
7 min/72 oC
B.3.8. Nhận dạng
Nên kiểm tra sản phẩm PCR được khuếch đại từ
mẫu chưa biết bằng các phương pháp, ví dụ như enzym giới hạn, đọc trình tự ADN
hoặc lai ADN.
B.3.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích xem là đã được phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương đồng với chiều dài của trình tự ADN đích, được
xác định bằng cách so sánh với sản phẩm PCR khuếch đại từ mẫu chuẩn có trình tự
ADN đích đã được chứng nhận (ví dụ IRMM-410 từ IRMM, Geel, Bỉ).
Về nhận dạng sản phẩm PCR xem B.3.8.
Sản phẩm PCR được nhận dạng có kích thước 118
bp chứng tỏ mẫu ADN có chứa ADN từ NOS- terminator với nồng độ nằm trong giới
hạn phát hiện trong B.3.2.2.
Chi tiết về điện di, xem TCVN 7606 : 2007
(ISO 21571 : 2005), B.2.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.4.1. Khái quát
Phương pháp này dùng để phát hiện gen mã hóa cho neomycin phosphotransferaza (npt
II). Vì gen này được sử dụng để thiết kế các vector chuyển gen có khả năng tích
hợp vào cây trồng để tạo cây biến đổi gen nên gen có thể được dùng để sàng lọc
các thể sinh vật biến đổi gen.
B.4.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
B.4.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi các
nghiên cứu cộng tác, được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu bảo
vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây dựng phương
pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền”. Số phòng thử
nghiệm tham gia và số mẫu được chọn theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2).
Phương pháp CTAB được sử dụng để tách chiết
ADN được đưa ra trong A.3 của TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005) (nhưng với
phần mẫu thử là 100 mg).
Dữ liệu từ nghiên cứu thực nghiệm được nêu
trong Bảng B.10.
Bảng B.10 - Kết quả
nghiên cứu cộng tác
Mẫu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mồi
APH2 ngắn/APH2 ngược
Năm
1998
Số phòng thử nghiệm tham gia
10
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
9
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số kết quả được chấp nhận
45
Số mẫu chứa gen neomycin phosphotransferaza
của cà chua Zeneca
22
Kết quả dương tính giả
0 (0 %)
Kết quả âm tính giả
0 (0 %)
B.4.2.2. Đặc hiệu phân tử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phụ lục này đáp ứng những yêu cầu nêu trong
trong điều 7.
Phương pháp được thiết kế để khuếch đại trình
tự đích có số hiệu đăng ký No.AF269238 trong GenBankÒ.
Neomycin phosphotransferaza có nguồn gốc từ
E. coli K12 và có mặt trong nhiều sinh vật biến đổi gen.
Gen npt II có nguồn gốc từ E. coli
K12 và có mặt trong nhiều sinh vật biến đổi gen.
Kết quả dương tính giả có thể xảy ra vì gen
đích có trong E. coli K12. Kết quả dương tính không được coi là bằng
chứng xác định sự có mặt của sản phẩm có nguồn gốc thực vật biến đổi gen
B.4.2.2.2. Lý thuyết
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào từ các thực vật không biến đổi gen được
tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (NCBI BlastNÒ, EMBL database, 28
tháng 9 năm 2001). Chỉ thử các mồi transposon Tn5 và trình tự được tổng hợp đã
công bố bản quyền.
B.4.2.2.3. Thực nghiệm
Không có trình tự nào được khuếch đại khi sử
dụng ADN của cây trồng hoặc các thực phẩm có nguồn gốc từ cây trồng không bị
biến đổi gen.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Việc đánh giá xác nhận được đã tiến hành với
nguyên liệu chứa 0 % và 100 % thành phần biến đổi gen.
B.4.3. Điều chỉnh
Chưa có quy định cụ thể.
B.4.4. Nguyên tắc
Đoạn ADN có kích thước 215 bp trong gen
neomycin phosphotransferaza được khuếch đại bằng PCR và được phát hiện bằng
điện di trên gel agaroza. Để nhận dạng sản phẩm PCR, có thể phải kiểm tra bằng
enzym giới hạn.
Neomycin phosphotransferaza giúp cho vi khuẩn
kháng lại kháng sinh neomycin/kanamycin và gen đã được đưa vào chỉ làm gen chỉ
thị.
B.4.5. Thuốc thử
Chất lượng của thuốc thử, xem TCVN 7608 :
2007 (ISO 24276 : 2006).
B.4.5.1. Nước
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.4.5.3. Dung dịch dNTP, c(dNTP) =
2,5 mmol/I (cho mỗi loại)
B.4.5.4. Oligonucleotit
B.4.5.4.1. Mồi xuôi
APH2 short: 5'-CTC ACC TTg CTC CTg CCg
AgA-3"
B.4.5.4.2. Mồi ngược
APH2 ngược: 5'-CgC CTT gAg CCT ggC gAA CAg
-3'
B.4.5.5. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho hot-start
PCR), 5 lU/ml
B.4.5.6. Enzym giới hạn: Rsa I
B.4.6. Thiết bị, dụng cụ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.4.7. Cách tiến hành (Chuẩn bị PCR)
B.4.7.1 Khái quát
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng B.11. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng B.11 được chứng minh là phù hợp.
Bảng B.11 - Thành
phần thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (μl)
Mẫu ADN
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước
14,6
Đệm PCR 10x (có MgCI2 15 mmol/l)
1 x
2,5
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l
0,2 mmol/l
0,5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,4 mmol/l
1
Mồi APH2 ngược, 10 mmol/l
0,4 mmol/l
1
Taq ADN polymeraza, 5 lU/ml
2 IU
0,4
B.4.7.2. Kiểm chứng PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.4.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng B.12 đã được sử dụng để nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt GeneAmpÒ 2400 hoặc GeneAmpÒ 9600 và AmpliTaq GoldÒ ADN polymeraza 16).
Nếu sử dụng máy khác thì cần điều chỉnh thích hợp. Thời gian hoạt hóa, biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymeraza
được sử dụng. Nếu sử dụng hot-start PCR, nhà sản xuất khuyên giữ nguyên chương
trình trừ khi thực hiện với quy trình khác.
Bảng B.12 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
Hoạt hóa, biến tính ban đầu
10 min/95°C
Khuếch đại
25 s/95 oC
30 s/60 oC
45 s/72 oC
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
35
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
7 min/72 oC
B.4.8. Nhận dạng
Nên thẩm tra sản phẩm PCR có nguồn gốc từ mẫu
ADN chưa biết bằng, ví dụ, enzym giới hạn, đọc trình tự ADN hoặc lai ADN. Sản
phẩm PCR khi cắt bằng Rsa sẽ tạo ra hai đoạn gen (có kích thước 122 bp
và 93 bp tương ứng) [24].
B.4.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích coi là đã được phát hiện nếu
kích thước sản phẩm PCR tương ứng với kích thước của trình tự đích như dự tính,
được xác định bằng cách so sánh với sản phẩm PCR khuếch đại từ mẫu chuẩn thích
hợp (ví dụ plasmit có chứa trình tự đích có bán sẵn trên thị trường).
Về nhận dạng sản phẩm PCR, xem B.4.8.
Sản phẩm PCR được nhận dạng có kích thước 215
bp chứng tỏ mẫu ADN có chứa ADN gen npt II với nồng độ nằm trong giới
hạn phát hiện trong B.4.2.2.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.5. Phương pháp sàng lọc để phát hiện ADN có
nguồn gốc từ cà chua biến đổi gen (ZenecaÒ F282)
Phương pháp này được mô tả chi tiết trong
A.3.
PHỤ
LỤC C
(Tham khảo)
Phương
pháp xác định cấu trúc đặc thù
C.1. Phương pháp xác định cấu trúc đặc thù để
phát hiện các trình tự ADN bị biến đổi từ GTS 40-3-2 biến đổi gen (Đậu tương
Roundup ReadyÒ)
C.1.1. Khái quát
Phương pháp này dùng để phát hiện đậu tương
GTS 40-3-2 (Roundup ReadyÒ17) biến đổi gen kháng
glyphosat có trong các nguyên liệu thô hoặc đã qua chế biến [8], [11] bằng cách
khuếch đại trình tự có một bản sao, kích thước 172 bp đặc trưng cho vùng nối
giữa promoter 35S-CaMV và trình tự tín hiệu lục lạp dẫn protein nằm trước trình
tự gen EPSPS của Agrobacterium.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Không thể sử dụng phương pháp này để phân
biệt giữa GTS 40 3-2 và các cây trồng khác được tạo ra từ việc lai GTS 40 3-2
và các cây đậu tương khác, trừ khi phân tích được thực hiện trên một hạt hoặc
cây có chứa/hoặc không chứa các trình tự gen có nguồn gốc từ dòng khác và có
thể được kiểm tra lại.
C.1.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
C. 1.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi các
nghiên cứu cộng tác [8] được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây
dựng phương pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền” theo
Điều 35 của luật thực phẩm của Liên bang Đức. Phương pháp CTAB được sử dụng để
tách chiết ADN được đưa ra trong TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005), A.3 (nhưng
phần mẫu thử là 100 mg).
Dữ liệu từ nghiên cứu cộng tác được nêu trong
Bảng C.1.
Bảng C.1 - Kết quả
của nghiên cứu cộng tác
Năm
1998
Số phòng thử nghiệm tham gia
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
24
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
5
Số kết quả được chấp nhận
105
Số mẫu chứa GTS 40-3-2
56
Số mẫu chứa đậu tương không biến đổi gen
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kết quả dương tính giả
0 (0 %)
Kết quả âm tính giả
0 (0 %)
C.1.2.2. Đặc hiệu phân tử
C.1.2.2.1. Khái quát
Phụ lục này đáp ứng những yêu cầu nêu trong
điều 7.
Phương pháp được mô tả trong [8]. Thông tin
về việc thiết kế gen để đưa vào hệ gen đậu tương đã được nêu trong [31].
C.1.2.2.2. Lý thuyết
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.1.2.2.3. Thực nghiệm
Không có sản phẩm PCR nào được khuếch đại khi
sử dụng ADN từ đậu tương, khoai tây, cà chua, ngô và củ cải đường không bị biến
đổi gen hoặc từ ngô dòng (Event) 176 (Bt 176), Bt 11, T 25, MON 810 bị biến đổi
gen.
C.1.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Dựa vào giả định rằng chỉ có một bản sao của
trình tự gen được thiết kế trong hệ gen đơn bội (AGBIOS database: http://www.aqbios.com/)
và kích thước hệ gen đơn bội của đậu tương là 1,13 x 109 bp (xem
[5]), thì LOD tuyệt đối là 50 ng ADN đậu tương trong đó có 0,1 % khối lượng là
sinh vật biến đổi gen trong hạt nghiền, tương đương với 40 bản sao của hệ gen
đơn bội [32].
LOD tương đối đã được xác định là tốt hơn
hoặc tương đương với nồng độ đậu tương 0,1 % trong bột đậu tương (mẫu chuẩn
IRMM-410R đã được công nhận, do IRMM, Geel, Bỉ cung cấp) [9]. Bằng cách này,
bột đậu tương chứa 0,45 % GTS 40-3-2 cũng đã được phát hiện sau khi làm bánh
[33].
C.1.3. Điều chỉnh
Chưa có quy định cụ thể.
C.1.4. Nguyên tắc
Đậu tương GTS 40-3-2 kháng glyphosat là do có
chứa trình tự gen được thiết kế mã hóa
cho enolpyruvylshikimi-3-phosphat synthaza (EPSPS) có nguồn gốc từ Agrobacterium
chủng CP4 được nối với trình tự của peptit chuyển hóa
diệp lục (CTP) có nguồn gốc từ Petunia hybrida (trình tự tín hiệu cho
phép protein đi qua màng, CTP để chuyển EPSPS đi vào lục lạp). Glyphosat ức chế
EPSPS ở thực vật. Đoạn ADN có kích thước 172 bp nối giữa promoter 35S-CaMV và
CTP được khuếch đại bằng PCR và được nhận dạng trên gel agaroza. Để xác định
chính xác sản phẩm PCR có thể dùng mẫu dò lai.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thuốc thử được chỉ dẫn trong TCVN 7608 : 2007
(ISO 24276 : 2006).
C.1.5.1. Nước
C.1.5.2. Dung dịch đệm PCR (không chứa MgCI2),
10 x
C.1.5.3. Dung dịch MgCI2, c(MgCI2) = 25
mmol/l
C.1.5.4. Dung dịch dNTP, c(dNTP) =
2,5 mmol/l (cho mỗi loại)
C. 1.5.5. Oligonucleotit
C.1.5.5.1. Mồi xuôi
35s-f2: 5'- TgA TgT gAT ATC TCC ACT gAC g
-3'.
Số hiệu đăng ký No.(GenBankÒ): V00141, J02048.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
petu-r1: 5'- TgT ATC CCT TgA gCC ATg TTg T
-3'.
Số hiệu đăng ký No.(GenBankÒ): M21084, J03227.
C.1.5.6. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho hot-start
PCR), 5 lU/ml.
C.1.5.7. Mẫu dò lai
H-35s-ar1: 5'- ggg TCT TgC gAA ggA TAg Tg-3'.
C.1.5.8. Dung dịch lai sơ bộ, bao gồm
dung dịch đệm SSC 5x, 0,1 % N-lauroylsarcosin (nồng độ khối), 0,02 % SDS (nồng
độ khối), 1 % chất hãm [8].
C. 1.5.9. Dung dịch lai, bao gồm 10 pmol mẫu
dò ADN trong 2,5 ml dung dịch lai sơ bộ (C.1.5.8). Lai ở nhiệt độ 50 oC.
Ngoài ra, các thông tin về điều kiện lai đã được đưa ra trong [12].
C.1.6. Thiết bị, dụng cụ
C.1.6.1. Máy chu trình nhiệt
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.1.6.3. Thiết bị lai
C.1.7. Cách tiến hành
C.1.7.1. Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng C.2. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng C.2 được chứng minh là phù hợp.
Bảng C.2 - Thành phần
thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (mi)
Mẫu ADN
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
Nước
15,9
Đệm PCR 10x (không chứa MgCI2)
1 x
2,5
Dung dịch MgCI2, 25 mmol/l
1,5 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l
0,8 mmol/l
2
Mồi 35s-f 2,5 mmol/l
0,2 mmol/l
1
Mồi petu-r1, 5 mmol/l
0,2 mmol/l
1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5 IU
0,1
a Nếu trong dung dịch đệm PCR đã chứa MgCI2
thì nồng độ cuối cùng của MgCI2 trong hỗn hợp phản ứng là 1,5
mmol/l.
C.1.7.2. Kiểm chứng PCR
Kiểm chứng dương tính sử dụng mẫu chuẩn GTS
40-3-2 đã được chứng nhận (chứa 0,1 % thành phần thực vật biến đổi gen), do
Viện Vật liệu và Đo lường chuẩn (IRMM), Geel, Bỉ (IRMM-410) cung cấp.
Một số đối chứng thích hợp khác nên tiến hành
theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
C.1.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng C.3 đã được sử dụng để nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt GeneAmpÒ 2400 hoặc GeneAmpÒ 9600 và AmpliTaq
GoldÒ ADN polymeraza18).
Nếu sử dụng máy khác thì cần điều chỉnh chương trình. Thời gian hoạt hóa, biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymeraza
được sử dụng.
Bảng C.3 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10 min ở 95 oC
Khuếch đại
30 s/95 oC
30 s/60 oC
25 s/72 oC
Số chu trình
35 đến 40
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
3 min/72 oC
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mức độ đặc hiệu của sản phẩm PCR được xác
định dựa vào lai Southern, sử dụng mẫu dò oligonucleotit H35s-ar1 (C.1.5.7 to
C.1.5.9) được đánh dấu huỳnh quang. Các mẫu không bị biến đổi gen nên sử dụng
làm đối chứng âm trong thử nghiệm lai [8].
C.1.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích coi như đã được phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương đương với kích thước của trình tự đích theo
lý thuyết. Kích thước này được xác định bằng cách so sánh với sản phẩm PCR được
khuếch đại từ mẫu chuẩn đã được chứng nhận GTS 40-3-2 (ví dụ IRMM-410 từ IRMM,
Geel, Bỉ).
Về nhận dạng sản phẩm PCR, xem C.1.8.
Sản phẩm PCR là đoạn gen có kích thước 172 bp
chứng tỏ mẫu ADN có chứa ADN có nguồn gốc từ GTS 40-3-2 với nồng độ nằm trong
giới hạn phát hiện đặc hiệu nêu trong C.1.2.2. Chi tiết về điện di, xem B.2 của
TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005).
C.2. Phương pháp cấu trúc đặc thù để phát
hiện trình tự ADN biến đổi từ cà chua biến đổi gen (ZenecaÒF282)
C.2.1. Khái quát
Phương pháp này để phát hiện cà chua biến đổi
gen làm chậm quá trình chín của quả (Zeneca) trong các nguyên liệu thô bằng
cách khuếch đại PCR đoạn ADN nối giữa đoạn có bản sao đơn có nguồn gốc từ
NOS-terminator của Agrobacterium tumefaciens và gen polygalacturonaza
(PG) từ Lycopersicon esculentum Mill, hai đoạn ADN này được nối với nhau
bằng cách tái tổ hợp trong ống nghiệm.
Trong tương lai, phương pháp cấu trúc đặc thù
này có thể được sử dụng trong các sinh vật biến đổi gen khác.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.2.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi các
nghiên cứu cộng tác [15] được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây
dựng phương pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền”. Số
phòng thử nghiệm tham gia cũng như số mẫu được thực hiện theo TCVN 6910-2 (ISO
5725-2). Phương pháp CTAB được sử dụng để tách chiết ADN được đưa ra trong A.3
của TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005), (nhưng phần mẫu thử là 100 mg).
Dữ liệu từ nghiên cứu cộng tác được nêu trong
Bảng C.4.
Bảng C.4 - Kết quả
nghiên cứu và cộng tác
Năm
1999
Số phòng thử nghiệm tham gia
18
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
5
Số kết quả được chấp nhận
90
Số mẫu cà chua biến đổi gen (Zeneca 282F)
43
Số mẫu cà chua không biến đổi gen (Zeneca
282C)
47
Kết quả dương tính giả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kết quả âm tính giả
0 (0 %)
C.2.2.2. Đặc hiệu phân tử
C.2.2.2.1. Khái quát
Phụ lục này đáp ứng những yêu cầu nêu trong
điều 7.
Phương pháp được mô tả trong [15] và [16].
Thông tin về thiết kế gen để đưa vào hệ gen của cà chua được nêu trong [18].
C.2.2.2.2. Lý thuyết
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào của cà chua, hoặc các cây trồng khác
không biến đổi gen được tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (GenBankÒ database; BlastNÒ 2.2.1, 1 tháng 7 năm
2001). Hơn nữa, bộ mồi được thiết kế chỉ để khuếch đại đặc hiệu trình tự nối
nhân tạo chứ không có trong tự nhiên.
C.2.2.2.3. Thực nghiệm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.2.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Dựa vào giả định rằng chỉ có một bản sao của
trình tự gen được thiết kế trong hệ gen đơn bội (AGBIOS database: http://www.aqbios.com/)
và kích thước hệ gen đơn bội của cà chua là 1,0 x 109 bp (xem [5],
thì LOD tuyệt đối là 10 ng ADN cà chua trong đó 100 % là sinh vật biến đổi gen
tương đương với 10 bản sao của hệ gen đơn bội [19].
C.2.3. Điều chỉnh
Để nhận dạng sự biến đổi gen trong bột cà
chua, nên tách chiết axit nucleic với lượng nhiều hơn 5 lần theo quy định trong
TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005). Sau khi đã trộn lẫn các axit nucleic đã được
tách chiết, bước tinh sạch bằng bộ thử QIAquyck PCR Purification19)
để có được lượng ADN đủ và thích hợp cho PCR.
C.2.4. Nguyên tắc
Tính trạng của cà chua biến đổi gen (Lycopersicon
esculentum Mill.) được tạo ra từ Zeneca làm chậm quá trình chín của quả.
Tính trạng này có được là do khả năng ức chế sự tạo thành polygalacturonaza
(PG).
Sự biến đổi gen trong hệ gen của cà chua tạo
ra bằng cách đưa đoạn gen polygalacturonaza (PG) không hoàn thiện dưới dạng
cADN (cDNA) vào trong hệ gen cà chua. Sự có mặt của gen này làm giảm mạnh sự
tạo thành enzym PG. Enzym này chịu trách nhiệm làm mềm cà chua [17].
Phương pháp này khuếch đại đoạn trình tự kích
thước 350 bp nhân tạo, nối giữa đoạn cADN (cDNA) của gen PG và đoạn
NOS-terminator bên cạnh. Trình tự này chỉ có mặt trong cà chua biến đổi gen. Để
xác định chính xác sản phẩm PCR, phương pháp lai đặc hiệu bằng mẫu dò lai như
đã mô tả có thể được sử dụng.
C.2.5. Thuốc thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.2.5.1. Nước
C.2.5.2 .Dung dịch đệm PCR (không chứa MgCI2),
10 x
C.2.5.3. Dung dịch MgCI2, c(MgCI2)
= 25 mmol/l
C.2.5.4. Dung dịch dNTP, c(dNTP) =
2,5 mmol/l (cho mỗi loại)
C.2.5.5. Oligonucleotit
C.2.5.5.1. Mồi xuôi
PG34L: 5'- ggA TCC TTA gAA gCA TCT AgT-3'.
Số hiệu đăng ký X04583.
C.2.5.5.2. Mồi ngược
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số hiệu đăng ký NC002147.
C.2.5.6. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho hot-start
PCR), 5 IU/ml.
C.2.5.7. Mẫu dò lai Tomate-2
ADN mẫu dò lai đã được đánh dấu bằng
digoxygenin (Dig) (Tomate-2) có trình tự sau:
5'-Dig-CCT CTA gAg Tcg ACC TgC Agg TCg-3'.
C.2.5.8. Dung dịch lai sơ bộ, bao gồm dung dịch
đệm SSC 5x, 0,1 % W-lauroyl-sarcosin (theo nồng độ khối), 0,02 % SDS (theo nồng
độ khối) và 1 % chất hãm [15].
C.2.5.9. Dung dịch lai, bao gồm 10 pmol mẫu dò lai
trong 2,5 ml dung dịch lai sơ bộ (C.2.5.8).
Nhiệt độ lai 60 oC. Ngoài ra, các
thông tin cho điều kiện lai đã được đưa ra trong [12].
C.2.5.10. Enzym giới hạn: Eae I hoặc Mwo I.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Theo quy định trong C.1.6.
C.2.7. Cách tiến hành
C.2.7.1. Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng C.5. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng C.5 được chứng minh là phù hợp.
Bảng C.5 - Thành phần
thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (ml)
Mẫu ADN
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5
Nước
17,3
10 x Đệm PCR (không chứa MgCI2)
1 x
2,5
Dung dịch MgCI2 a, 25
mmol/l
1,5 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l eac
0,4 mmol/l
1,0
Mồi PG34L, 10 mmol/l
0,4 mmol/l
1,0
Mồi t-NOS, 10 mmol/l
0,4 mmol/l
1,0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1 IU
0,2
a Nếu trong dung dịch đệm PCR đã chứa MgCI2
thì nồng độ cuối cùng của MgCI2 trong hỗn hợp phản ứng là 1,5
mmol/l.
C.2.7.2. Chuẩn bị PCR
Trên thị trường không có sẵn mẫu chuẩn để sử
dụng làm đối chứng dương20).
Một số đối chứng khác nên tiến hành theo TCVN
7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
C.2.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng C.6 đã được sử dụng để nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt (PCR) GeneAmpÒ
2400 hoặc GeneAmpÒ 9600 và AmpliTaq
GoldÒ ADN polymeraza21).
Nếu sử dụng máy khác thì cần điều chỉnh chương trình. Thời gian hoạt hóa, biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymeraza
được sử dụng.
Bảng C.6 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10 min/95 oC
Khuếch đại
30 s/94 oC
60 s/60 oC
Số chu trình
35
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
6 min/72 oC
C.2.8. Nhận dạng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Để xác định sản phẩm PCR được khuếch đại có
thể sử dụng các enzym giới hạn Eae I hoặc Mwo I. Khi bị cắt bởi Eae
I, sản phẩm PCR sẽ tạo ra 2 đoạn tương ứng có kích thước 126 bp và 224 bp. Khi
bị cắt bởi Mwo I, sản phẩm PCR sẽ tạo ra 3 đoạn có kích thước tương ứng
là 8 bp, 164 bp và 178 bp.
C.2.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích coi như đã được phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương đương với kích thước của trình tự đích theo
lý thuyết. Kích thước này được xác định bằng cách so sánh với sản phẩm PCR được
khuếch đại từ mẫu chuẩn thích hợp.
Về nhận dạng sản phẩm PCR, xem C.2.8.
Sản phẩm PCR là đoạn gen có kích thước 350 bp
chứng tỏ mẫu ADN có chứa ADN có nguồn gốc từ cà chua Zeneca bị biến đổi gen với
nồng độ nằm trong giới hạn phát hiện đặc hiệu nêu trong C.2.2.2. Chi tiết về
điện di, xem B.2 của TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005).
C.3. Phương pháp cấu trúc đặc thù để phát
hiện trình tự ADN biến đổi từ ngô Bt 11 biến đổi gen
C.3.1. Khái quát
Phương pháp này dùng để phát hiện ngô Bt 11
biến đổi gen tạo ra độc đối của Bacillus thuringiensis (Syngenta, trước
kia là Novartis) trong nguyên liệu thô bằng cách khuếch đại vùng nối của trình
tự bản sao đơn có nguồn gốc từ 1S-lntron 2 adh (IVS2) của ngô và gen pat của Streptomyces
viridochromogenes.
Trong tương lai, phương pháp này có thể được
sử dụng trong nhiều sinh vật biến đổi gen khác.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.3.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
C.3.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi các
nghiên cứu cộng tác [20] được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây
dựng phương pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền”. Số
phòng thử nghiệm tham gia cũng như số mẫu được thực hiện theo TCVN 6910-2 (ISO
5725-2). Một nửa số phòng thử nghiệm tham gia sử dụng CTAB để tách ADN theo A.3
của TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005), còn một nửa số phòng còn lại sử dụng
WizardÒ ADN-Clean-Up-System22).
Dữ liệu từ nghiên cứu cộng tác được nêu trong
Bảng C.7.
Bảng C.7 - Kết quả
nghiên cứu và cộng tác
Năm
2000
Số phòng thử nghiệm tham gia
18
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
16
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
6
Số kết quả được chấp nhận
96
Số mẫu có chứa ngô dòng (Event) 176
32
Số mẫu chứa ngô Bt 11
32
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
32
Kết quả dương tính giả
3 (5 %)
Kết quả âm tính giả
3 ( 1 0 % )
Ngoài ra, 14 phòng thử nghiệm đã nhận các mẫu
ADN tách chiết từ ngô biến đổi gen dòng Bt 11 với nồng độ ADN là 0,05 ng, 0,5
ng, 5 ng và 50 ng. Kết quả trong Bảng C.8 [20].
Bảng C.8 - Kết quả từ
nghiên cứu và cộng tác
Lượng ADN
Kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chính xác
Lỗi
50 ng
14
-
5 ng
14
-
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5 ng
12
1
Âm tính giả
1
Không rõ ràng
0,05 ng
7
5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2
Không rõ ràng
C.3.2.2. Đặc hiệu phân tử
C.3.2.2.1. Khái quát
Phụ lục này đáp ứng những yêu cầu nêu trong
điều 7.
Phương pháp đã được mô tả trong [20].
Thông tin về việc cấu trúc ADN để đưa vào hệ
gen ngô được nêu trong [34]. ADN đã được thiết kế có trong EMBL/GenBankÒ số hiệu đăng ký No.
AR110602 (đã được cấp bằng sáng chế). Đoạn ADN này chứa tất cả các phần tử theo
thứ tự đã được báo cáo đối với chủng Bt 11.
C.3.2.2.2. Lý thuyết
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào của ngô và các cây trồng khác không
biến đổi gen được tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (GenBankÒ database; BlastNÒ 2.2.1, 1 tháng 7 năm
2001). Hơn nữa, bộ mồi được thiết kế chỉ để khuếch đại đặc hiệu trình tự nối
nhân tạo chứ không có trong tự nhiên.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Không có đoạn ADN nào được khuếch đại khi sử
dụng ADN từ ngô không biến đổi gen hoặc GTS 40-3-2 biến đổi gen (đậu tương
Roundup ReadyÒ) hoặc các ngô dòng
(Event) 176 (Bt 176), T25 và MON 810.
Số lượng các trình tự đích là 1.
C.3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Dựa vào giả định rằng chỉ có một bản sao của
trình tự gen được thiết kế trong hệ gen (AGBIOS database: http://www.aqbios.com/)
và kích thước hệ gen đơn bội của ngô là 2,65 x 109 bp (xem [5], thì
LOD tuyệt đối là 50 ng ADN ngô có chứa 0,1 % sinh vật biến đổi gen trong hạt
nghiền thì tương đương với 20 bản sao của hệ gen [34]. LOD tương đối được tính
khi sinh vật biến đổi gen có nồng độ cao hơn hoặc tương đương 0,1 % trong bột
ngô nghiền [34].
C.3.3. Điều chỉnh
Chưa có quy định cụ thể.
C.3.4. Nguyên tắc
Gen Bt có nguồn gốc từ vi khuẩn đất Bacillus
thuringiensis. Protein mã hóa từ gen
này được tạo ra từ mô thực vật và có khả năng bảo vệ chống lại ấu trùng đục
thân ngô ở Châu Âu. Protein Bt trở thành dạng hoạt động trong ruột côn trùng
tạo thành lỗ trên màng tế bào và làm mất cân bằng thẩm thấu dẫn đến ly giải tế
bào.
Gen pat có nguồn gốc từ vi khuẩn đất Streptomyces
viridochromogenes mã hóa cho enzym
phosphinothricin-A/-acetyltransferaza giúp cho cây trồng kháng lại thuốc diệt
cỏ amoni glufosinat. Amoni glufosinat làm mất quá trình tổng hợp glutamin ở
thực vật. Đoạn ADN có kích thước 189 bp là vùng liên kết giữa intron IVS2 gen adh
và gen pat được khuếch đại bằng PCR và được phát hiện bằng điện di
trên gel agaroza. Để xác định chính xác sản phẩm PCR, phương pháp lai bằng mẫu
dò lai có thể được sử dụng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chất lượng các thuốc thử, xem TCVN 7608 :
2007 (ISO 24276 : 2006).
C.3.5.1. Nước
C.3.5.2. Dung dịch đệm PCR (không chứa MgCI2),
10 x
C.3.5.3. Dung dịch MgCI2, c(MgCI2)
= 25 mmol/l
C.3.5.4. Dung dịch dNTP, c(dNTP) =
2,5 mmol/l (cho mỗi loại)
C.3.5.5. Oligonucleotit
C.3.5.5.1. Mồi xuôi
Intron IVS2-2: 5'-CTg ggA ggC CAA ggT ATC TAA
T-3'
Số hiệu đăng ký No. AR110602
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Vùng mã hóa
cho protein PAT, PAT-B: 5'-gCT gCT gTA gCT ggC CTA ATC T-3'
Số hiệu đăng ký No. AR110602
C.3.5.6. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho hot-start
PCR), 5 lU/ml
C.3.5.7. Mẫu dò lai được đánh dấu đầu
5' (ví dụ như được đánh dấu bằng digoxygenin) mẫu dò Bt: 5'- TAT CTg TCT CAg
ggg CAg ACT C-3'; c = 20 mmol/l.
C.3.5.8. Dung dịch lai sơ bộ, bao gồm dung dịch
đệm SSC 5x, 0,1 % W-lauroyl-sarcosin, (theo nồng độ khối), 0,02 % SDS (nồng độ
khối) và 1 % chất hãm.
C.3.5.9. Dung dịch lai, bao gồm 10
pmol mẫu dò trong 2,5 ml dung dịch lai sơ bộ (C.3.5.7). Tiến hành lai ở nhiệt
độ 60 oC. Ngoài ra, các thông tin và điều kiện lai đã được trình bày
trong [12].
C.3.5.10 Enzym giới hạn
Hinf l.
C.3.6. Thiết bị, dụng cụ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.3.7. Cách tiến hành
C.3.7.1. Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 μl cho một phản ứng với các thành phần như liệt kê trong Bảng C.9. PCR cũng
có thể tiến hành với thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù
hợp. Nồng độ cuối cùng của các thuốc thử đưa ra trong Bảng C.9 được chứng minh
là phù hợp.
Bảng C.9 - Thành phần
thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (ml)
Mầu ADN
10 ng tới 50 ng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước
15,8
10 x Đệm PCR (không chứa MgCI2)
1 x
2,5
Dung dịch MgCI2 a ,
25 mmol/l
2 mmol/l
2,0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,4 mmol/l
1,0
Mồi IVS2-2, 10 mmol/l
0,5 mmol/l
1,25
Mồi PAT-B, 10 mmol/l
0,5 mmol/l
1,25
Taq ADN polymeraza, 5 lU/ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,2
a Nếu trong dung dịch đệm PCR đã chứa MgCI
thì nồng độ cuối cùng của MgCI trong hỗn hợp phản ứng được điều chỉnh là 2
mmol/l.
C.3.7.2. Kiểm chứng PCR
Kiểm chứng dương tính sử dụng mẫu chuẩn đã được
công nhận, ví dụ chứa 0,1 % thành phần ngô Bt 11 biến đổi gen, do Viện Vật liệu
và Đo lường chuẩn (IRMM), Geel, Bỉ (IRMM-410) cung cấp.
Một số phương pháp kiểm chứng thích hợp khác
nên tiến hành theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
C.3.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng C.10 đã được sử dụng để nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt GeneAmpÒ 2400 hoặc GeneAmpÒ 9600 và AmpliTaq
GoldÒ ADN polymeraza23).
Nếu sử dụng máy khác thì cần điều chỉnh chương trình. Thời gian hoạt hóa, biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymeraza
được sử dụng.
Bảng C.10 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
Hoạt hóa, biến tính ban đầu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khuếch đại
30 s/95 oC
30 s/64 oC
30 s/72 oC
Số chu trình
38
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
10 min/72 oC
C.3.8. Nhận dạng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Việc nhận dạng sản phẩm PCR có thể được tiến
hành bằng các enzym giới hạn. Khi sử dụng Hinf I cắt sản phẩm PCR sẽ tạo
hai đoạn gen có kích thước 116 bp và 73 bp tương ứng [20].
C.3.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích coi như đã được phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương đương với kích thước của trình tự đích theo
lý thuyết. Kích thước này được xác định bằng cách so sánh với sản phẩm PCR được
khuếch đại từ mẫu chuẩn Bt11 đã được công nhận (ví dụ dòng IRMM-412 từ IRMM,
Geel, Bỉ).
Về nhận dạng sản phẩm PCR, xem C.3.8.
Sản phẩm PCR là đoạn gen có kích thước 189 bp
chứng tỏ mẫu ADN có chứa ADN có nguồn gốc từ ngô Bt 11 bị biến đổi gen với nồng
độ nằm trong giới hạn phát hiện đặc hiệu nêu trong C.3.2.2. Chi tiết về điện
di, xem B.2 của TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005).
C.4. Phương pháp cấu trúc đặc thù để phát hiện
trình tự ADN biến đổi từ ngô dòng 176 biến đổi gen
C.4.1. Khái quát
Phương pháp này dùng để phát hiện ngô dòng
(Event) 176 (Syngenta) trong các nguyên liệu thô hoặc đã qua chế biến bằng cách
khuếch đại vùng nối nhân tạo giữa hai bản sao của một cấu trúc gen dùng để tích
hợp vào hệ gen thực vật. Ngô bị biến đổi có khả năng tạo độc tố Bt (loại
crylA(b)) có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis, bằng cách gắn gen Bt
vào promoter CDPK của ngô (Zea mays).
Trong tương lai, phương pháp cấu trúc tương
tự sẽ được sử dụng trong các sinh vật biến đổi gen khác.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.4.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
C.4.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi các
nghiên cứu cộng tác [20] được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây
dựng phương pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền”. Số
phòng thử nghiệm tham gia cũng như số mẫu được thực hiện theo TCVN 6910-2 (ISO
5725-2). Một nửa số phòng thử nghiệm tham gia sử dụng CTAB để tách ADN theo A.3
của TCVN 7606 : 2007 (ISO 21571 : 2005), còn một nửa số phòng còn lại sử dụng
WizardÒ ADN-Clean-Up-System24).
Dữ liệu từ nghiên cứu cộng tác được nêu trong
Bảng C.11.
Bảng C.11 - Kết quả
từ nghiên cứu cộng tác
Năm
2000
Số phòng thử nghiệm tham gia
18
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
16
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
6
Số kết quả được chấp nhận
96
Số mẫu chứa ngô dòng (Event) 176
32
Số mẫu chứa ngô Bt 11
32
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
32
Kết quả dương tính giả
0 (0 %)
Kết quả âm tính giả
0 (0 %)
Ngoài ra, 13 phòng thử nghiệm đã nhận được
mẫu ADN của ngô có nguồn gốc từ bột ngô khô chứa 0,1 % khối lượng thuộc dòng
(Event)) 176 (ngô Bt 176) biến đổi gen (mẫu chuẩn đã được công nhận, do IRMM,
Geel, Bỉ cung cấp). Mười hai phòng thử nghiệm xác định mẫu dương tính với ngô
dòng (Event) 176 (Bt 176) và một phòng có kết quả không rõ ràng.
C.4.2.2. Đặc hiệu phân tử
C.4.2.2.1. Khái quát
Phụ lục này đáp ứng những yêu cầu nêu trong
điều 7.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thông tin về thiết kế gen để đưa vào hệ gen
của ngô được mô tả trong [35].
C.4.2.2.2. Lý thuyết
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào của ngô và các cây trồng khác không
biến đổi gen được tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (GenBankÒ database; BlastNÒ 2.2.1, 1 tháng 7 năm
2001). Hơn nữa, bộ mồi được thiết kế chỉ để khuếch đại đặc hiệu trình tự nối
nhân tạo chứ không có trong tự nhiên.
C.4.2.2.3. Thực nghiệm
Không có đoạn ADN nào được khuếch đại khi sử
dụng ADN từ đậu tương (GTS 40-3-2) và ngô dòng Bt 11, T25 và MON810 [11] biến
đổi gen hoặc từ ngô không bị biến đổi gen [11], [20].
Số bản sao của trình tự là 2.
C.4.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Dựa vào giả định rằng có hai bản sao của
trình tự gen được thiết kế trên một hệ gen (AGBIOS database: http://www.aqbios.com/)
và kích thước hệ gen đơn bội của ngô là 2,65 x 109 bp (xem [5], thì
LOD tuyệt đối là 50 ng ADN ngô có chứa 0,1 % sinh vật biến đổi gen trong hạt
nghiền, tương đương với 20 bản sao của hệ gen [34]. LOD tương đối được
tính khi sinh vật biến đổi gen có nồng độ cao hơn hoặc tương đương 0,1 % trong
bột ngô nghiền [34].
C.4.3. Điều chỉnh
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.4.4. Nguyên tắc
Độc tố Bt từ Bacillus thuringiensis là
chất diệt côn trùng có nguồn gốc từ vi khuẩn. Thực vật biến đổi gen chứa gen Bt
tạo ra protein kháng sâu bệnh. Ngô dòng (Event) 176 (ngô Bt 176) chứa gen Bt
tổng hợp loại CrylA(b) được điều khiển bởi promoter CDPK6. Đoạn gen kích thước
211 bp ở vùng nối giữa promoter CDPK6 và gen Bt được khuếch đại bằng PCR và sản
phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza. Để xác định chính xác
sản phẩm PCR, phương pháp lai với mẫu dò lai được mô tả và có thể được sử dụng.
C.4.5. Thuốc thử
Chất lượng các thuốc thử, xem TCVN 7608 :
2007 (ISO 24276 : 2006).
C.4.5.1. Nước
C.4.5.2. Dung dịch đệm PCR (không chứa MgCI2),
10 x
C.4.5.3. MgCI2 dung dịch, c(MgCI2)
= 25 mmol/l
C.4.5.4. dNTP dung dịch, c(dNTP) =
2,5 mmol/l (cho mỗi loại)
C.4.5.5. Oligonucleotit
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Cry03: 5-CTC TCg CCg TTC ATg TCC gT-3'
Chưa đăng ký số hiệu. Mồi nằm trong vùng điều
khiển CDPK6. Trình tự mồi 100 % giống với dòng ngô CDPK, số hiệu đăng ký. L27484.1.
C.4.5.5.2. Mồi ngược
Cry04: 5'-ggT CAg gCT Cag gCT gAT gT-3'
Số hiệu đăng ký là 41419 (xem [36]). Mồi nằm
trong vùng gen tổng hợp CrylA(b).
C.4.5.6. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho
hot-start PCR), 5 lU/ml.
C.4.5.7. Trình tự mẫu dò (Cry01)
5'-ATg gAC AAC AAC CCC AAC ATC-3.'
C.4.5.8. Dung dịch lai sơ bộ, chứa SSC 5 x, 0,1 %
N-lauroyl-sarcosin (theo nồng độ khối), 0,02 % SDS (nồng độ khối) và 1 % thuốc
hãm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Quá trình lai diễn ra ở nhiệt độ 50 oC.
Ngoài ra, các thông tin về điều kiện lai được nêu trong [12].
C.4.6. Thiết bị, dụng cụ
Như quy định trong C.1.6.
C.4.7. Cách tiến hành
C.4.7.1. Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng C.12. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng C.12 được chứng minh là phù hợp.
Bảng C.12 - Thành
phần thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu ADN
10 ng tới 50 ng
2
Nước
15,4
Đệm PCR 10 x (không chứa MgCI2)
1
2,5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,5 mmol/l
1,5
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l
0,4 mmol/l
1.0
Mồi Cry03, 5 mmol/l
0,25 mmol/l
1,25
Mồi Cry04, 5 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,25
Taq ADN polymeraza, 5 lU/ml
0,5 IU
0,1
a Nếu trong dung dịch đệm PCR đã chứa MgCI2
thì nồng độ cuối cùng của MgCI2 trong hỗn hợp phản ứng được điều chỉnh là
1,5 mmol/l.
C.4.7.2. Kiểm chứng PCR
Để kiểm chứng dương tính, sử dụng mẫu chuẩn
đã được công nhận [ví dụ, chứa 0,1 % thành phần ngô dòng (Event) 176 (Bt 176)
biến đổi gen, do Viện Vật liệu và Đo lường chuẩn (IRMM), Geel, Bỉ (IRMM-410,
MZ-0,1) cung cấp.
Một số đối chứng thích hợp khác nên tiến hành
theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
C.4.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng C.13 - Chương
trình thời gian-nhiệt độ
Hoạt hóa,
biến tính ban đầu
12phút/95 oC
Khuếch đại
30 giây/95 0C
30 giây/63 0C
30 giây/72 0C
Số chu trình
38
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6 phút/72 0C
C.4.8. Nhận dạng
Kiểm chứng sản phẩm PCR bằng phương pháp lai
Southern sử dụng mẫu dò oligonucleotit CryOI đánh dấu digoxygenin (C.4.5.7 đến
C.4.5.9). Mẫu không biến đổi gen nên được dùng làm đối chứng âm trong thử
nghiệm lai này [20].
Việc kiểm chứng sản phẩm được khuếch đại có
thể sử dụng enzym giới hạn Hae III, Taq I hoặc Dde I. Sản
phẩm PCR khi bị cắt bằng Hae III sẽ cho 2 đoạn có kích thước 162 bp và
49 bp, tương ứng. Sản phẩm PCR khi bị cắt bằng Taq I sẽ cho 3 đoạn có kích thước
168, 22 và 21 bp tương ứng. Còn khi cắt bằng Dde I, sản phẩm PCR sẽ tạo 3 đoạn
ADN có kích thước 128, 72 và11 bp, tương ứng [20].
C.4.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích coi như đã được phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương đương với kích thước của trình tự đích theo
lý thuyết. Kích thước này được xác định bằng cách so sánh với sản phẩm PCR được
khuếch đại từ mẫu chuẩn của ngô dòng (Event) 176 (Bt 176) đã được công nhận (ví
dụ: dòng IRMM-411 từ IRMM, Geel, Bỉ).
Để nhận dạng sản phẩm PCR, xem C.4.8.
Sản phẩm PCR là đoạn gen có kích thước 211 bp
chứng tỏ mẫu ADN có chứa ADN có nguồn gốc từ ngô dòng (Event) 176 (Bt 176) biến
đổi gen với nồng độ nằm trong giới hạn phát hiện đặc hiệu trong C.4.2.2.
Chi tiết về điện di, xem B.2 của TCVN 7606 :
2007 (ISO 21571 : 2005).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.5.1. Khái quát
Phương pháp này dùng để phát hiện ngô
T25/"LibertyLink" kháng lại thuốc diệt cỏ nhờ biến đổi gen trong các
nguyên liệu thô bằng cách khuếch đại vùng nối giữa trình tự ADN có nguồn gốc từ
promoter 35S-CaMV và gen pat, hai đoạn gen này được nối với nhau nhờ tái tổ hợp
trong ống nghiệm. Trong tương lai, cấu trúc tương tự có thể được sử dụng trong
nhiều sinh vật biến đổi gen khác.
Phương pháp không phân biệt được các giống
ngô mà chỉ phát hiện được sự có mặt hay không có mặt của đoạn gen trong các hạt
và cây đơn.
C.5.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
C.5.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi các
nghiên cứu cộng tác [20] được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây
dựng phương pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền”. Số
phòng thử nghiệm tham gia cũng như số mẫu được thực hiện theo TCVN 6910-2 (ISO
5725-2). ADN được tách chiết bằng phương pháp CTAB theo A.3 của TCVN 7606 :
2007 (ISO 21571 : 2005).
Mẫu từ bột hạt nghiền chứa T25 (0,1 %, 1 %),
MON 810 (0,1 %, 1 %) và ngô không biến đổi gen đã sử dụng trong nghiên cứu cộng
tác.
Dữ liệu từ nghiên cứu cộng tác được nêu trong
Bảng C.14 và 15.
Bảng C.14 - Các kết
quả từ nghiên cứu và cộng tác
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2001
Số phòng thử nghiệm tham gia
16
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
16
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
5
Số kết quả được chấp nhận
75
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
33
Số mẫu chứa MON 810
31
Số mẫu chứa ngô không biến đổi gen
11
Kết quả dương tính giả
0 (0 %)
Kết quả âm tính giả
4( 12% )
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các dạng mẫu
Số lượng mẫu
Dương tính
Âm tính
Các mẫu âm tính T25:
0 % sinh vật biến
đổi gen
11
11
0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
13
13
0
1 % MON810
18
18
0
Các mẫu dương tính T25:
0,1 %T25
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
15
3 (âm tính)a
1 % T25
15
14
1 (âm tính)
a Mọi kết quả âm tính giả nhận được từ một
phòng thử nghiệm.
C.5.2.2. Đặc hiệu phân tử
C.5.2.2.1. Khái quát
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp này đã được mô tả trong [20].
Chú thích: Thông tin về việc xây dựng phương
pháp này do Bayer Crop Science cung cấp (trước kia là Aventis CropScience).
Thông tin về thiết kế gen để đưa vào hệ gen
ngô có trong [37].
C.5.2.2.2. Lý thuyết
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào của ngô và các cây trồng khác không
biến đổi gen được tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (GenBankÒ database; BlastNÒ 2.2.1, 1 tháng 7 năm
2001). Hơn nữa, bộ mồi được thiết kế chỉ để khuếch đại đặc hiệu trình tự nối
nhân tạo chứ không có trong tự nhiên.
C.5.2.2.3. Thực nghiệm
Không có đoạn ADN nào được khuếch đại khi sử
dụng ADN từ ngô không biến đổi gen, đậu tương GTS 40-3-2 (Roundup ReadyÒ) biến đổi gen hoặc
các dòng ngô biến đổi gen Bt dòng (Event) 176 (Bt 176), Bt 11 và MON 810.
Số bản sao của trình tự là 1.
C.5.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.5.3. Điều chỉnh
Chưa có quy định cụ thể.
C.5.4. Nguyên tắc
Gen pat có nguồn gốc từ vi sinh vật
đất Streptomyces viridochromogenes mã hóa
enzym hosphinothricin-W-acetyltransferaza giúp cho cây trồng kháng lại thuốc
diệt cỏ amoni glufosinat. Amoni glufosinat phá vỡ quá trình tổng hợp glutamin ở
thực vật.
Đoạn gen có kích thước 209 bp nằm trong vùng
nối giữa promoter 35S-CaMV và gen pat được khuếch đại bằng PCR và được phát
hiện bằng điện di trên gel agaroza. Để nhận dạng chính xác sản phẩm PCR có thể
sử dụng enzym giới hạn như đã mô tả.
C.5.5. Thuốc thử
Chất lượng các thuốc thử, xem TCVN 7608 :
2007 (ISO 24276 : 2006).
C.5.5.1. Nước
C.5.5.2. Dung dịch đệm PCR (không chứa MgCI2),
10 x
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.5.5.4. Dung dịch dNTP, c(dNTP) =
2,5 mmol/l (cho mỗi loại)
C. 5.5.5. Oligonucleotit
C.5.5.5.1. Mồi xuôi
T25-F7: 5'-ATg gTg gAT ggC ATg ATg TTg-3'
Số hiệu đăng ký (GenBankÒ) là NC001497. Mồi
nằm trong promoter 35S-CaMV
C.5.5.5.2. Mồi ngược
T25-R3: 5'- TgA gCg AAA CCC TAT AAg AAC CC
-3'
Chưa được đăng ký số hiệu trên ngân hàng. Mồi
nằm trong vùng gen mã hóa protein PAT
C.5.5.6. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng
cho hot-start PCR), 5 lU/ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.5.6. Thiết bị, dụng cụ
Theo quy định trong C.1.6.1 và C.1.6.2.
C.5.7. Cách tiến hành
C.5.7.1. Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng C.16. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng C.16 được chứng minh là phù hợp.
Bảng C.16 - Thành
phần thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích trên mẫu (ml)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10 ng tới 50 ng
2
Nước
14,8
Đệm PCR (không chứa MgCI2) 10x
1 x
2,5
Dung dịcha MgCI2, 25
mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2,0
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l
0,4 mmol/l
1,0
Mồi T25-F7, 10 mmol/l
0,5 mmol/l
1,25
Mồi T25-R3, 10 mmol/l
0,5 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Taq ADN polymeraza, 5 lU/ml
1 IU
0.2
a Nếu trong dung dịch đệm PCR đã chứa MgCI2
thì nồng độ cuối cùng của MgCI2 trong hỗn hợp phản ứng được điều
chỉnh là 2 mmol/l.
C.5.7.2. Kiểm chứng PCR
Mẫu chuẩn không có sẵn trên thị trường26).
Một số đối chứng thích hợp khác nên tiến hành
theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
C.5.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
Chương trình thời gian-nhiệt độ nêu trong
Bảng C.17 đã được sử dụng để nghiên cứu thẩm tra phương pháp, sử dụng máy chu
trình nhiệt GeneAmpÒ 2400 hoặc GeneAmpÒ 9600 và AmpliTaq
Goldđ ADN polymeraza27). Nếu sử dụng máy khác thì cần điều
chỉnh chương trình. Thời gian hoạt hóa,
biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymera được sử dụng. Nếu sử dụng hot-start
polymeraza, nhà sản xuất khuyên cũng nên sử dụng chương trình đó trừ khi quy
trình quy định khác.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hoạt hóa/Biến tính ban đầu
12 min/95 oC
Khuếch đại
30 s/95 oC
30 s/64 oC
30 s/72 oC
Số chu trình
40
Kéo dài sợi trước khi kết thúc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.5.8. Nhận dạng
Sản phẩm PCR có thể được thẩm tra bằng các
enzym giới hạn như Hinf I hoặc Mwo I. Sản phẩm PCR cắt bằng Hinf
I tạo ra hai đoạn có kích thước 121 và 88 bp, tương ứng. Khi cắt bằng Mwo
I sản phẩm PCR sẽ cho hai đoạn gen có kích thước 141 và 68 bp, tương ứng [20].
C.5.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích coi như đã được phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương đương với kích thước của trình tự đích theo
lý thuyết. Kích thước này được xác định bằng cách so sánh với sản phẩm PCR được
khuếch đại từ mẫu chuẩn có nguồn gốc từ ngô T25.
Về nhận dạng sản phẩm PCR, xem C.5.8.
Sản phẩm PCR là đoạn gen có kích thước 209 bp
chứng tỏ mẫu ADN có chứa ADN có nguồn gốc từ ngô T25 bị biến đổi gen với nồng
độ nằm trong giới hạn phát hiện đặc hiệu nêu trong C.5.2.2.
Chi tiết về điện di, xem B.2 của TCVN 7606 :
2007 (ISO 21571 : 2005).
PHỤ
LỤC D
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương
pháp phân tích dòng đặc hiệu
D.1. Phương pháp phân tích dòng đặc hiệu dùng
để phát hiện các trình tự ADN bị biến đổi từ ngô MON 810 biến đổi gen
D.1.1. Khái quát
Phương pháp này dùng phát hiện ngô MON
810/"YieldGuard" biến đổi gen để chống côn trùng trong các nguyên
liệu thô bằng cách khuếch đại vùng gen nối giữa hệ gen của ngô có bản sao đơn
và trình tự tích hợp được gắn vào có nguồn gốc từ promoter 35S-CaMV bằng tái tổ
hợp gen trong ống nghiệm.
Cây trồng tạo ra bằng phương pháp lai không
thể phân biệt được bằng cách này mà phương pháp này chỉ phân biệt được hạt đơn
hoặc cây đơn có hay không có trình tự gen này mà thôi.
D.1.2. Tình trạng hiệu lực và tiêu chí thực
hiện
D. 1.2.1. Nghiên cứu cộng tác
Phương pháp đã được đánh giá hiệu lực bởi các
nghiên cứu cộng tác [20] được tổ chức bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và Viện Thú Y Liên bang Đức với đề tài “Xây
dựng phương pháp nhận dạng thực phẩm được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền”. Số
phòng thử nghiệm tham gia cũng như số mẫu được thực hiện theo TCVN 6910-2 (ISO
5725-2). ADN được tách chiết bằng phương pháp CTAB theo A.3 của TCVN 7606 :
2007 (ISO 21571 : 2005).
Mẫu từ bột hạt nghiền chứa "MON 810 DK
513/59179" (0,1 %, 1 %), T25 (0,1 %, 1 %) và ngô không biến đổi gen đã được
sử dụng trong nghiên cứu cộng tác. Dữ liệu từ nghiên cứu cộng tác được nêu
trong Bảng D.1 và D.2.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Năm
2001
Số phòng thử nghiệm tham gia
16
Số phòng thử nghiệm gửi kết quả
16
Số mẫu của mỗi phòng thử nghiệm
5
Số kết quả được chấp nhận
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số mẫu chứa MON 810
31
Số mẫu chứa T25
33
Số mẫu chứa ngô không biến đổi gen
11
Kết quả dương tính giả
0 (0 %)
Kết quả âm tính giả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng D.2 - Kết quả từ
nghiên cứu cộng tác
Mẫu
Số mẫu
Đúng tính
Sai
MON 810 mẫu âm tính:
0 % sinh vật biến
đổi gen
11
11
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,1 %T25
18
18
0
1 % T25
15
15
0
MON 810 Các mẫu dương tính:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
13
13
0
1 % MON 810
18
18
0
D.1.2.2. Đặc hiệu phân tử
D.1.2.2.1. Khái quát
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp này đã được mô tả trong [20].
CHÚ THÍCH: Thông tin về quá trình xây dựng phương
pháp này do Monsanto cung cấp.
Thông tin về thiết kế gen để đưa vào hệ gen
ngô có sẵn trong [38].
D.1.2.2.2. Lý thuyết
Trình tự cấu trúc ADN được đưa vào không có
sự tương đồng với bất kỳ trình tự ADN nào của ngô và cây trồng khác không biến
đổi gen được tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu (GenBankÒ database; BlastNÒ 2.2.1, 1 tháng 7 năm
2001). Ngoài ra, mồi được thiết kế chỉ để khuếch đại trình tự đặc hiệu nối nhân
tạo (vùng nối nhân tạo) vốn không có trong tự nhiên.
D.1.2.2.3. Thực nghiệm
Không có đoạn ADN nào được khuếch đại khi sử
dụng ADN từ ngô không biến đổi gen, đậu tương GTS 40-3-2 (Roundup ReadyÒ) hoặc các dòng
(Event) 176 (Bt 176), Bt 11 và T25 biến đổi gen. Số bản sao của trình tự là 1.
D.1.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Dựa vào giả định rằng chỉ có một bản sao của trình
tự gen được thiết kế trên một hệ gen (AGBIOS database: http://www.aqbios.com/)
và kích thước hệ gen đơn bội của ngô là 2,65 x 109 bp (xem [5], thì
LOD tuyệt đối là 50 ng ADN ngô có chứa 0,1 % sinh vật biến đổi gen trong hạt
nghiền, tương đương với 20 bản sao của hệ gen [34]. LOD tương đối được tính khi
sinh vật biến đổi gen có nồng độ cao hơn hoặc tương đương 0,1 % trong bột ngô
nghiền [34].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chưa có quy định cụ thể.
D.1.4. Nguyên tắc
Gen Bt có nguồn gốc từ vi sinh vật đất Bacillus
thuringiensis loài phụ kurstaki. Protein này được tạo ra trong mô
cây trồng giúp cây trồng chống lại sự tấn công của sâu đục thân. Protein hoạt
động trong ruột của côn trùng và tạo thành lỗ trên màng tế bào dẫn đến phá hủy cân bằng thẩm thấu của màng tế bào, kết quả
là tế bào bị phân giải.
Đoạn ADN có kích thước 170 trong vùng nối
giữa hệ gen với đoạn ADN có nguồn gốc từ promoter 35S- CaMV được tích hợp được
khuếch đại bằng PCR và được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza. Để nhận
dạng sản phẩm PCR có thể sử dụng enzym giới hạn như đã mô tả (xem D.1.8).
D.1.5. Thuốc thử
Sử dụng thuốc thử có chất lượng như trong
TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
D.1.5.1. Nước
D.1.5.2. Dung dịch đệm PCR (không chứa MgCI2),
10 x
D.1.5.3. Dung dịch MgCI2, c(MgCI2)
= 25 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
D.1.5.5. Oligonucleotit
Vùng tích hợp hệ gen đã được ấn bản [38] với
số đăng ký AF434709
D.1.5.5.1. Mồi xuôi
VW01: 5'-TCg AAg gAC gAA ggA CTC TAA Cg-3'
Số hiệu đăng ký là AF434709. Mồi nằm trong hệ
gen của ngô.
D.1.5.5.2. Mồi ngược
VW03: 5'-TCC ATC TTT ggg ACC ACT gTC g-3'.
Số hiệu đăng ký (GenBankÒ) là V00141, J02048.
Mồi nằm trong promoter CaMV-35S.
D.1.5.6. ADN polymeraza chịu nhiệt (dùng cho hot-start
PCR), 5 lU/ml.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
D.1.6. Thiết bị, dụng cụ
D.1.6.1. Máy chu trình nhiệt
D.1.6.2. Bộ điện di, có nguồn cung cấp.
D.1.7. Cách tiến hành
D.1.7.1. Chuẩn bị PCR
Phương pháp này định rõ tổng thể tích PCR là
25 ml cho một phản ứng
với các thành phần như liệt kê trong Bảng D.3. PCR cũng có thể tiến hành với
thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Nồng độ cuối cùng
của các thuốc thử đưa ra trong Bảng D.3 được chứng minh là phù hợp.
Bảng D.3 - Thành phần
thuốc thử
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu ADN
10 ng tới 50 ng
2
Nước
14,8
10 x Đệm PCR (không chứa MgCI2)
1 x
2,5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2 mmol/l
2,0
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l
0,4 mmol/l
1,0
Mồi VW01, 10 mmol/l
0,5 mmol/l
1,25
Mồi VW03, 10 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,25
Taq ADN polymeraza, 5 IU/ml
1 IU
0,2
a Nếu trong dung dịch đệm PCR đã chứa MgCI2
thì nồng độ cuối cùng của MgCI2 trong hỗn hợp phản ứng được điều
chỉnh là 2 mmol/l.
D.1.7.2. Kiểm chứng PCR
Để kiểm chứng dương tính có thể sử dụng mẫu
chuẩn IRMM-413 đã được IRMM công nhận.
Một số đối chứng thích hợp khác nên tiến hành
theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006).
D.1.7.3. Chương trình thời gian-nhiệt độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng D.4 - Chương trình thời gian-nhiệt độ
Hoạt hóa, biến tính ban đầu
12 min/95 oC
Khuếch đại
30 s/95 oC
30 s/64 oC
30 s72 oC
Số chu trình
40
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10 min/72 oC
D.1.8. Nhận dạng
Sản phẩm PCR được khuếch đại có thể được thẩm
tra bằng enzym giới hạn Hae III hoặc Mwo I. Sản phẩm PCR được cắt
bằng Hae III tạo hai đoạn gen có kích thước 126 và 44 bp tương ứng. Khi cắt
bằng Mwo I, sẽ tạo ra hai đoạn có kích thước 109 bp và 61 bp tương ứng.
D.1.9. Đảm bảo chất lượng và diễn giải kết
quả
Trình tự đích coi như đã được phát hiện nếu
kích thước của sản phẩm PCR tương đương với kích thước của trình tự đích theo
lý thuyết. Kích thước này được xác định bằng cách so sánh với sản phẩm PCR được
khuếch đại từ mẫu chuẩn có nguồn gốc từ ngô MON 810 (ví dụ, IRMM-413 từ IRMM,
Geel, Bỉ).
Về nhận dạng sản phẩm PCR, xem D.1.8.
Sản phẩm PCR là đoạn gen có kích thước 170 bp
chứng tỏ mẫu ADN chứa ADN có nguồn gốc từ ngô MON 810 biến đổi gen với nồng độ
nằm trong giới hạn phát hiện đặc hiệu nêu trong D.1.2.2.
Chi tiết về điện di, xem B.2 của TCVN 7606 :
2007 (ISO 21571 : 2005).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[1] SAIKI, R.K., SCHARF, S., FALOONA, F.,
MULLIS, K.B., HORN, G.T., ERLICH, H.A., and ARNHEIM, N.: Enzymatic
amplification of R-globin genomic sequences and restriction site analysis for
diagnosis of sickle cell anemia. Science, 1985, 230, pp 1350-1354
[2] MULLIS, K.B. and FALOONA, F.A.: Specific
synthesis of ADN in vitro via a polymeraza-catalyzed reaction. Methods
Enzymol., 1987,155, pp 335-350
[3] HEATON, P.A.: Quantification of total ADN
by spectroscopy. In Analytical Molecular Biology: Quality and Validation,
ed. Saunders, G.S and Parkes, H.C. RSCpublications, 1999, U.K
[4] BICKLEY and HOPKINS: Inhibitors and
enhancers of PCR in Analytical Molecular Biology: Quality and Validation, ed.
Saunders, G.S and Parkes, H.C. RSC publications, 1999, U.K
[5] ARUMUGANATHAN, K. and EARLE, E.D.:
Nuclear content of some important plant species, Plant Mol. Biol. Rep.,
9(3), 1991, pp 208-218
[6] WOLF, C, SCHERZINGER, M., WURZ, A.,
PAULI, U., HOBNER, P., and LUTHY, J,: Detection of cauliflower mosaic virut by
the polymeraza chain reaction: testing of food components for false-positive 35S-promoter
screening results. Eur. Food Res. Technol., 2000, 210, pp 367-372
[7] HOLST-JENSEN, A., RONNING, S.B., LOVSETH,
A. and BERDAL, K.G.: PCR technology for screening and quantification of
genetically modified organisms (GMOs). Anal. Bioanal. Chem., 2003, 375,
pp 985-993
[8] Detection of a genetic modification of
soybeans by amplification of the modified ADN sequence by means of the
polymeraza chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a ADN
probe, No. L 23.01.22-1. Collection of official methods under article 35 of
the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods,
tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office,
Loose leaf edition as of March 1998, Berlin, Koln, Beuth Verlag GmbH
[9] Report of the EU tender No.
XXIV/98/A3/001. Development of qualitative as well as quantitative detection
methods to identify a genetic modification in soybean and maize. http://www.europa.eu.int/comm/food/fs/biotech/biotech02
en.html,2000
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[II] BROLL, H., WAGNER, U., SPIEGELBERG, A,
ZAGON, J., and SCHAUZU, M.: Anwendung von Methoden zum Nachweis von
gentechnisch veranderten Sojabohnen und gentechnisch verandertem Mais in im
Handel befindlichen Lebensmitteln, Bundesgesundhblatt, 1998,12,
pp 560-562.
[12] SAMBROOK, J. and RUSSELL, D.W.: Molecular
cloning: a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.
[13] Detection of a genetic modification of
potatoes by amplification of the modified ADN sequence using the polymeraza
chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a ADN probe, No.
L 24.01 -1: Collection of official methods under article 35 of the German
Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products,
cosmetics and commodity goods/Federal Health Office, Loose leaf edition as
of January 1997, Berlin, Koln, Beuth Verlag GmbH.
[14] TABERLET, P., GIELLY, L., PAUTOU, G.,
and BOUVET, J.: Universal Mồis for amplification of three noncoding regions of
chloroplast ADN. Plant Mol. Biol., 1991,17, pp 1105-1109.
[15] Detection of a genetic modification of
tomatoes by amplification of the modified ADN sequence by means of the
polymeraza chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a ADN
probe or restriction analysis of the PCR product, No. L 25.03.01. Collection
of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods
of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity
goods/Federal Health Office, Loose leaf edition as of November 1999, Berlin,
Koln, Beuth Verlag GmbH.
[16] BUSCH, U., MUHLBAUER, B., SCHULZE, M.,
and ZAGON, J.: Screening- und spezifische Nachweismethode filr transgene
Tomaten (Zeneca) mit der Polymerazakettenreaktion. Deutsche
Lebensmittelrundschau, 1999, Heft 2, 52-56.
[17] GIERSON, E., TUCKER, G.A., KEEN, J.,
RAY, J., BIRD, C.R., and SCHUCH, W.: Sequencing and identiffication of a cADN
clone for tomato polygalacturonase. Nucleic Acid Research, 1986, 14, pp
8595-8603.
[18] SMITH, C.J.S., WATSON, C.F., BIRD, C.R.,
RAY, J., SCHUCH, W., and GIERSON, D.: Expression of a truncated tomato
polygalacturonase gene inhibits expression of the endogenous gene in transgenic
plants. Mol. Gen. Genet, 1990, 224, pp 477-481.
[19] BROLL, H., JANSEN, B., SPIEGEL BERG, A.,
LEFFKE, A., ZAGON, J., and SCHAUZU, M.: ADN- analytische Nachweismethoden fur
gentechnisch veranderte Tomaten in Tomatenprodukten. Deutsche
Lebensmittel-Rundschau, 1999, 95, 48-51.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[21] EHLERS, B., STRAUCH, E., GOLTZ, M.,
KUBSCH, D., WAGNER, H., MAIDHOF, H., BENDIEK, J., APPEL, B. and BUHK, H.-J.:
Nachweis gentechnischer VerSnderungen in Mais mittels PCR. Bundesgesundhbl.,1997',
4, pp 118-121.
[22] PIETSCH, K., WAIBLINGER, H.U., BRODMANN,
P. and WURZ. A: Screening method for the detection of genetically modified
plants, Dtsch Lebensm. Rundsch. 1997, 93, pp 35-38.
[23] HEMMER, W.: Foods Derived from
Genetically Modified Organisms and Detection Methods. In: BATS- report
(Agency for Biosafety research and assessment of technology Impacts of the
Swiss priority Programme Biotechnology of the Swiss National Science
Foundation, Basel, Switzerland), 1997,2/97, pp 40-44.
[24] Screening procedurre for the detection
of genetically modified ADN sequences in foods by identification of PCR of ADN
sequences that frequently occur in genetically modified organisms. No L 00.00-31.
Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods
Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and
commodity goods/Federal Health Office, Loose leaf edition as of September
1998, revised version: state 05/2001; Berlin, Koln, Beuth Verlag GmbH.
[25] LIPP, M., BRODMANN, P., PIETSCH, K.,
PAUWELS, J., and ANKLAM, E.: IUPAC Collaborative trial of a method to detect
genetically modified soy beans and maize in dried powder, J. AOAC Int.,
1999, 82, pp 923-928.
[26] BRUNT, A., CRABTREE, K., DALLWITZ, M.,
GIBBS, A., WATSON, L: Virutes of Plants: Descriptions and Lists from the
VIDE Database. 1996, 1484 pp. C.A.B. International, U.K.
[27] Qiu, S.G., WINTERMANTEL, W.M., SHA, Y.
and SCHOELZ, J.E.: Light-Dependent Systemic Infection of Solanaceous Species by
Cauliflower Mosaic Virut Can Be Conditioned by a Viral Gene Encoding an Aphid
Transmission Factor. Virology, 1997, 227, pp 180-188.
[28] Schweizerisches Lebensmittelhandbuch
Kapitel 52B, Eidgenossische Drucksachen- und Materialienzentrale, Bern, 1998.
[29] van den EEDE, G., LIPP, M., EYQUEM, F.
and ANKLAM, E.: Validation of an analytical method for the detection of
GMO-derived ADN in processed foodstuffs. EUR 19677 EN, Report issued by the
IHCP ISPRA, 2000.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[31] PADGETTE, S.R., KOLACZ, K.H., DELANNY,
X., RE, D.B., LAVELLEE, B.J., TINIUS, C.N., RHODES, W.K., OTERO, Y.I., BARY,
G.F., EICHHOLTZ, DA, PESCHKE, V.M., NIDA, D.L, TAYLOR, N.B., KISHORE, G.M.:
Development, identiffication of PCR and characterization of a
glyphosate-tolerant soybean line. Crop Sci., 35,1995, pp 1451-1461.
[32] WURZ, A., WILLMUND, R.: identiffication
of PCR of transgenic glyphosate-resistant soybeans. In: G.A. Schreiber, K.W.
Bogl (Eds.). Foods produced by means of genetic engineering - 2nd status
report. BgVV-Heft 1/1997 (BgW, Berlin), pp. 115-117.
[33] STRAUB, J.A., HERTEL, C. and HAMMES,
W.P.: Limits of a PCR-based detection method for genetically modified soya
beans in wheat bread production. Z Lebensm Unters Forsch A, 208, 1999,
pp. 77-82.
[34] ZIMMERMANN, A., LUTHY, J., PAULI, U.:
Event specific transgene detection in Bt11 corn by quantitative PCR at the
integration site. Lebensm.- Wiss. U. Technol., 33, 2000, pp. 210-216.
[35] HUPFER, C, HOTZEL, H., SACHSE, K., ENGEL
, K.-H.: Detection of the genetic modification in heat treated products of Bt
maize by polymeraza chain reaction. Lm. Unters. Forsch., 206 (Band A),
1998, pp. 203-207.
[36] VAITILINGOM, M., PIJNENBURG, H., GENDRE,
F. and BRIGNON, P.: Real-time quantitative PCR detection of genetically
modified maximizer maize and RoundupReady soybean in some representative foods.
J. Agric. Food Chem. 47, 1999, pp. 5261-5266.
[37] MATSUOKA, T., KAWASHIMA, Y., AKIYAMA,
H., MIURA, H., GODA, Y., KUSAKABE, Y., ISSHIKI, Kạ TOYODA, M., HINO, A.: A
method of detecting recombinant ADNs from four lines of genetically modified
maize. Journal of Food Hygienic Society of Japan, 41, 2000, pp.
137-143.
[38] HOLCK, A., VAITILINGOM, M., DIDIERJEAN,
Lạ RUDI, K.: 5'-Nuclease PCR for quantitative Event specific detection of the
genetically modified Mon810 MaisGard maize. Eur Food Res Technol, 214,
2002, pp. 449-454.
[39] ISO 5725-2, Accuracy (trueness and
precision) of measurement methods and results - Part 2: Basic method for the
determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement
method.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[41] ISO 21570, Foodstuffs - Methods of
analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products - Quantitative nucleic acid based methods.
MỤC LỤC
Lời giới thiệu
1. Phạm vi áp dụng
2. Tài liệu viện dẫn
3. Thuật ngữ và định nghĩa
4. Nguyên tắc
5. Thuốc thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7. Cách tiến hành
8. Diễn giải kết quả
9. Biểu thị kết quả và đảm bảo chất lượng
10. Báo cáo thử nghiệm
Phụ lục A Phương pháp đặc hiệu/taxon đích
Phụ lục B Phương pháp sàng lọc
Phụ lục C Phương pháp xác định cấu trúc đặc
thù
Phụ lục D Phương pháp phân tích dòng đặc hiệu
Thư mục tài liệu tham khảo
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2)
Blast và Genbank là những ví dụ về sản phẩm thích hợp có sẵn trên thị trường.
Thông tin này đưa ra để tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định
phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm khác nếu chúng cho các kết quả
tương tự.
3)
Blast và Genbank là những ví dụ về sản phẩm thích hợp có sẵn trên thị trường.
Thông tin này đưa ra để tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định
phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu chúng cho kết quả
tương tự.
4)
10 x có nghĩa là 10 lần; hay nói cách khác dung dịch đệm PCR chứa 1,5 mol/l
Tris-HCI. pH 8,3.
5)
Chất hãm (Blocking reagent) là sản phẩm có sẵn trên thị trường được sản xuất
bởi Boehringer, Mannheim. Thông tin này đưa ra để tiện cho người sử dụng tiêu
chuẩn, ISO không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm khác
nếu chúng cho các kết quả tương tự.
6)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các ví dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của
Applied Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này
đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử
dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
7)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các ví dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của
Applied Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này
đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử
dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
8)
Về các loại mẫu chuẩn thích hợp, liên hệ với Cơ quan chuẩn Quốc gia.
9)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các ví dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của
Applied Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này
đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử
dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự
10)
WizardÒ ADN-Clean-Up-System là ví dụ thích
hợp về sản phẩm có sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra để tiện cho người
sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các
sản phẩm khác nếu chúng cho các kết quả tương tự.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
12)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các ví dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của
Applied Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này
đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử
dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
13)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các ví dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của Applied
Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này đưa ra
tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử dụng sản
phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
14)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các ví dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của
Applied Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này
đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử dụng
sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
15)
Để có các mẫu kiểm chứng, liên hệ với cơ quan chuẩn Quốc gia.
16)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các ví dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của
Applied Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này
đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử
dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
17)
Roundup Ready là tên thương mại của Monsanto. Thông tin này đưa ra để thuận
tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể
sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
18)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các máy PCR thích hợp có sẵn trên thị được cung cấp bởi Applied
Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Các thông tin này
được giới thiệu để tiện sử dụng Tiêu chuẩn Quốc tế này chứ ISO không bắt buộc.
Các máy khác có thể được sử dụng nếu chúng có thể cho ra kết quả tương tự.
19)
QIAquyck PCR Purification Kit là tên thương mại của sản phẩm của hãng QIAGEN,
Hilden, Đức. Thông tin này đưa ra để tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO
không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết
quả tương tự.
20)
Để có các mẫu chuẩn thích hợp để làm đối chứng, liên hệ với Cơ quan chuẩn Quốc
gia.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
22)
WizardÒ ADN-Clean-Up-System là bộ Kit thích
hợp, có sẵn trên thị trường. Thông tin này được đưa ra tạo thuận tiện cho người
sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản
phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
23)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các ví dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của
Applied Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này
đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử
dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
24)
WizardÒ ADN-Clean-Up-System là bộ Kit thích
hợp có sẵn trên thị trường. Thông tin này được đưa ra tạo thuận tiện cho người
sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản
phẩm khác nhếu cho các kết quả tương tự.
25) GeneAmpÒ 2400, 9600 và
AmpliTaq GoldÒ polymeraza là các ví
dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của Applied Biosystems,
trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này đưa ra tạo thuận
tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.
Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
26)
Để có các mẫu chuẩn để làm đối chứng, liên hệ với cơ quan chuẩn Quốc gia.
27)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các ví dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của
Applied Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này
đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử
dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.
28)
GeneAmpÒ 2400, 9600 và AmpliTaq GoldÒ
polymeraza là các ví dụ thích hợp về các sản phẩm có sẵn trên thị trường của
Applied Biosystems, trước kia là Perkin Elmer/Applied Biosystems. Thông tin này
đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử
dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương tự.