Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8710-1:2011 bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán

• Số hiệu: TCVN8710-1:2011
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2011

Mồi	Trình tự nucleotit
MBV 1.4F	5'-CGA- TTC-CAT-ATC-GGC-CGA-ATA-3'
MBV 1.4R	5'-TTG-GCA-TGC-ACT-CCC-TGA-GAT-3'
MBV 1.4NF	5'-TCC-AAT-CGC-GTC-TGC-GAT-ACT-3'
MBV 1.4NR	5'-CGC-TAA-TGG-GGC-ACA-AGT-CTC-3'

Cặp mồi MBV 1.4 F/R dùng để khuếch đại đoạn ADN của vi rút MBV có kích thước 533 bp. Cặp mồi MBV 1.4NF /NR dùng để khuếch đại đoạn ADN có kích thước 361 bp, nằm trong đoạn ADN sản phẩm bước 1 của vi rút MBV.

Chuẩn bị mồi:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µL làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µL: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).

3.2.1.5.2.2 Chuẩn bị phản ứng

Tùy theo điều kiện phòng thử nghiệm, chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theohướng dẫn của nhà sản xuất.

Hỗn hợp phản ứng bước 1 và bước 2 được chuẩn bị trong 1 ống Eppendorf dựa trên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm. Sau đó hút 22,5 µl hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml; ghi kí hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, chứng dương và chứng âm.

3.2.1.5.2.3 Tiến hành phản ứng PCR vòng ngoài (bước 1).

Thêm 2,5 µl ADN mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứngPCR (thành phần gồm: KCl 50 mM; Tris/HCl 10 mM, pH 9; Triton X-100 0,1 %; mỗi dNTP có nồng độ0,2 mM; MgCl2 1,5 mM; mỗi mồi MBV1.4F và MBV1.4R có nồng độ 0,25 µM; 1,25 U Taq ADNpolymerase và nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.

...

...

...

Hỗn hợp phản ứng PCR vòng ngoài (bước 1), sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mixcủa Promega, 2X như trong Bảng 2.

Bảng 2 - Hỗn hợp phản ứng PCR vòng ngoài

Thành phần

Thể tích cho 1 mẫu, µl

Nồng độ cuối cùng

Promega Gotag Green Master Mix, 2X 

12,5

1 X

 MBV1.4F mồi 

...

...

...

0,25 µM

 MBV1.4R mồi

0,3125 (20 µM)

0,25 µM

ADN mạch khuôn

2,5

Nước

9,375

...

...

...

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.

Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR bước 1 được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR bước 1

Bước

Nhiệt độ/thời gian

Số chu kỳ

96 oC/5 min

1

...

...

...

94 oC/30 s

40

Bắt cặp

65 oC/30 s

Kéo dài mạch

72 oC/60 s

Kéo dài mạch

72 oC/7 min

1

...

...

...

4 oC

Giữ ổn định

3.2.1.5.2.4 Tiến hành phản ứng PCR vòng trong (bước 2)

Thêm 2,5 µl ADN mạch khuôn (sản phẩm bước 1) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng PCR (thành phần gồm: KCl 50 mM; Tris/HCl 10 mM, pH 9; Triton X-100 0,1 %; mỗi dNTP có nồng độ0,2 mM; MgCl2 1,5 mM; mỗi mồi MBV1.4F và MBV1.4R có nồng độ 0,25 µM; 1,25 U Taq ADNpolymerase và nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.

Có thể sử dụng thành phần hoá chất riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại vẫn đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần như trên, sử dụng cặp mồi MBV1.4NF và MBV1.4NR.

Hỗn hợp phản ứng PCR bước 2, sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 4.

Bảng 4 - Hỗn hợp phản ứng PCR bước 2

Thành phần

25 µl/ phản ứng

...

...

...

Promega Gotag Green Master Mix, 2X

12,5

1 X

MBV1.4NF mồi

0,3125 (20 µM)

0,25 µM

MBV1.4NR mồi

0,3125 (20 µM)

0,25 µM

...

...

...

2,5

Nước

9,375

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt. Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR

bước 2 được nêu trong Bảng 5.

Bảng 5 - Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR bước 2

Bước

...

...

...

Số chu kỳ

96 ºC/5 min

1

Biến tính

94 ºC/30 s

Bắt cặp

60 ºC/30 s

...

...

...

Kéo dài mạch

72 ºC/60 s

Kéo dài mạch

72 ºC/7 min

1

4 ºC

Giữ ổn định

...

...

...

3.2.1.5.3 Chạy điện di

3.2.1.5.3.1 Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC thì cho vào 5 µl etidi bromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.

Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn. Tiến hành đổ vào bản gel, không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm. 

Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.

Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel.

3.2.1.5.3.2 Điện di

Hút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.

...

...

...

Điện di ở hiệu điện thế 100 volt đến 150 volt (quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di.

CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 µl loading dye 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 µl nhỏ vào một giếng trên bản gel.

3.2.1.5.4 Đọc kết quả

Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm.

Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang ADN, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa ra kết luận.

Bảng 6 - Kết quả điện di

Giếng

Vạch 533 bp

Vạch 361 bp

...

...

...

Thang ADN

Phân vạch rõ ràng và sáng theo kích thước sử dụng Điện di tốt

Điện di tốt

Mẫu kiểm chứng dương tính

Có

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

Không

Có

...

...

...

Không

Không

Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng, enzym hỏng

Có

Không

Không đạt yêu cầu 

Mẫu kiểm chứng âm tính

Không

Không

...

...

...

Có

Có

Bị ngoại nhiễm

Có

Không

Không

Có

...

...

...

Có

Có

Dương tính MBV

Không

Có

Dương tính với MBV

Không

Không

Âm tính với MBV

...

...

...

Không

Không chấp nhận kết quả. Phân tích lại mẫu

 Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 533 bp bước 1 và 361 bp bước 2 hoặc chỉ có vạch 361 bp. Thang ADN phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm không có vạch sáng.

 Kết quả mẫu thử âm tính khi: Không có vạch sáng kích thước 361 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối chứng dương tính. Thang ADN phân vạch rõ ràng.

3.2.2 Phương pháp mô học

3.2.2.1 Thuốc thử và vật liệu thử

- Dung dịch Davidson (xem A.1).

- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).

- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).

...

...

...

- Xylen.

- Cồn 70 %, 90 % và cồn tuyệt đối.

- Parafin.

- Keo dán, ví dụ Bom Canada.

3.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:

- Kính giải phẫu

- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen

- Lọ nhỏ cố định mẫu

...

...

...

- Bộ phận làm lạnh mẫu

- Máy cắt mẫu microtome

- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ

- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu

- Kính hiển vi quang học

- Cassete

- Khung đúc mẫu.

3.2.2.3 Lấy mẫu

Thu những mẫu tôm có biểu hiện bệnh có dấu hiệu không bình thường, tôm còi, cơ thể yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ hay xanh đen, sinh trưởng chậm, chuyển giai đoạn chậm không đều. Không dùng tôm chết hoặc tôm bảo quản đá để cắt mô.

...

...

...

3.2.2.4.1 Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm mô tươi

Mẫu tôm tiến hành từ hậu ấu trùng 5 ngày tuổi (postlarvae 5) đến hậu ấu trùng trưởng thành.

3.2.2.4.1.1 Mẫu mô gan tụy

Số tôm thu để nhuộm tươi đối với tôm ấu trùng và tôm giống là từ 30 con đến 50 con, đối với tôm nuôi là từ 5 con đến 10 con.

Đặt tôm lên lam kính, nhỏ một giọt nước muối sinh lý vừa đủ không làm mẫu khô. Dùng kính giải phẫuquan sát để lấy gan tụy của tôm.

Dùng hai kim giải phẫu nhọn, kim bên trái giữ phần mắt và anten, kim bên phải đặt lên đốt bụng thứ nhất. Từ từ tách phần bụng ra khỏi phần ngực, gan tụy lộ ra ngoài dính với phần bụng. Tách lấy phần gan tụy.

Nhỏ giọt xanh malachit (MG) 0,5 % lên khối gan tụy, dùng lamen ép mỏng quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100X, 400X.

Đọc kết quả:

Tế bào bình thường: nhân và tế bào chất bắt màu MG đậm hơn.

...

...

...

3.2.2.4.1.2 Mẫu phân

CHÚ THÍCH: Ưu điểm của phương pháp là có thể kiểm tra cả đối với tôm giống, tôm có kích thước lớn, tôm bố mẹ mà khônggây chết tôm, vẫn có thể loại bỏ được những đàn tôm mang mầm bệnh MBV.

Mẫu phân thu trong hồ bể nuôi, sau khi dải phân lắng xuống đáy hồ.

Mẫu phân thu đặt trên lam, nhỏ giọt MG 0,5 %, ép lamen và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Nếu tôm nhiễm bệnh sẽ quan sát thấy các thể ẩn hình cầu có tính khúc xạ nên sáng rõ hơn các thể hình cầu khác thấy trong phân.

Đánh giá cường độ cảm nhiễm MBV theo 3 mức:

Mức thấp (+): tổng số nhân tế bào gan tuỵ bị nhiễm MBV nhỏ hơn 30 %.

Mức trung bình (++): tổng số nhân tế bào gan tuỵ bị nhiễm MBV từ 30 % đến 60 %. Mức cao (+++): tổng số nhân tế bào gan tuỵ bị nhiễm MBV lớn hơn 60 %.

Tỉ lệ cảm nhiễm là số tôm nhiễm bệnh trên tổng số tôm kiểm tra

3.2.2.4.2 Chẩn đoán bằng phương pháp cắt mô

...

...

...

Cố định mẫu trong dung dịch Dadvison. Đối với ấu trùng hoặc tôm hậu ấu trùng có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.

Đối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó có chứa gan tụy), dùng dung dịch Davidson tiêm vào gan tuỵ và vùng xung quanh gan tuỵ. Lượng thuốc dùng từ 0,1 ml đến 10 ml (thay đổi tuỳ kích thước tôm), sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 3 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.

3.2.2.4.2.2 Khử mẫu cố định

Ngâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.

3.2.2.4.2.3 Làm trong mẫu

Ngâm sang lọ xylen 1 để trong 30 min đến 60 min. 
Ngâm sang lọ xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.

Sau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56 ºC đến 58 ºC trong 1 h.

Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắtđược tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.

3.2.2.4.2.4 Cắt mẫu

...

...

...

Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt 4 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.

3.2.2.4.2.5 Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượttrong cồn tuyệt đối, cồn 90 % và cồn 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòinước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ cồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, vídụ Bom Canada. Để khô và soi kính.

3.2.2.4.2.6 Đọc kết quả

Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao (100 X; 400 X, 1000 X).

Khi tôm bị bệnh MBV cho thấy một số thể ẩn hình cầu, bắt màu hồng của eosin, nằm trong nhân tế bào biểu mô gan tuỵ phình to. Ở những đàn tôm bị nhiễm nặng, trong mỗi nhân tế bào phình to có chứa hàng chục thể ẩn và có một tỷ lệ lớn những nhân tế bào có chứa thể vùi. Đây chính là căn cứ để đánh giá mức độ nhiễm nặng hay nhẹ ở một mẫu tôm nghiên cứu.

...

...

...

Tôm được xác định nhiễm bệnh MBV khi có kết quả dương tính một trong hai phương pháp sau:

- Phản ứng PCR phát hiện vi rút dương tính.

- Mẫu mô nhuộm tươi và mẫu cắt mô xuất hiện thể ẩn của MBV.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1 Dung dịch Davidson

Cồn 95 %:                                                       330 ml

...

...

...

Axit axetic đậm đặc:                                       115 ml

Nước:                                                             335 ml

A.2 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin - Mayer)

Hematoxylin dạng tinh thể:                             1 g

Natri iodat:                                                       0,2 g

Amoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g

Axit xitric:                                                        1 g

Cloral hydrat:                                                  50 g

Nước:                                                             1000 ml

...

...

...

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3 Thuốc nhuộm eosin

Eosin Y:                                                           1 g

Cồn 70 %:                                                       1 lít

Axit axetic băng:                                             5 ml

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn 70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axitaxetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.4 Dung dịch xanh malachit 0,5 %

Xanh malachit (MG):                                      5 g

...

...

...

Hoà tan MG trong nước, sau đó lọc qua giấy lọc. 

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Belcher C.R. & Young P.R. 1998. Colourimetric PCR-based detection of Monodon baculovirus in whole Penaeus monodon postlarvae. J. Virol. Methods, 74, p. 21-29.

[2] Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Bệnh học thuỷ sản.

[3] Doubrovsky A., P.J.L., Sambhi S.K., Atherton J.G. & Lester R.J.G. 1988. Observations on the ultrastructure of baculovirus in Australian Penaeus monodon and Penaeus merguiensis. Aust. J. Mar. Freshwater Res. 39: p. 743 - 749.

[4] Lightner, D.V., Redman, R.M., Bell, T.A., Observations on the geographic distribution, pathogenesis and morphology of the baculovirus from Penaeus monodon fabricius. Aquaculture, 1983. 32: p. 209- 233.

[5] Lightner DV (ed). A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. World Aquaculture Soc., Baton Roug. 1996.

...

...

...

[7] Leobert D. de la Pena , C.R.L.P., Corina Belle R. Villar, Milagros G. Paner Geimbo C. Capulos, Prevalence of monodon baculovirus (MBV) in wild shrimp Penaeus monodon in the Philippines. Aquaculture 2008. 285 p. 19-22.

[8] Oanh, D.T.H., Phuong, N.T., Presto, N., Hodgson, R.,Walker, P., , Prevalence of White Spot Syndrome virus (WSSV) and Monodon baculovirus (MBV infection in Penaeus monodonpostlarvae in Vietnam. Walker, P., Lester, R., Bondad Reantaso, M.G., 2005. Diseases in Asian Aquaculture V. Fish Health Section: p. 395-404.

[9] OIE, Manual of diagnostic tests for Aquatic animals 2006.