Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-44:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 44

• Số hiệu: TCVN8400-44:2019
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2019

Thành phần	Khối lượng
Trypticase pepton	2 g
Yeast extract	1 g
Maltose	0.5 g
L-cysteine hydrochloride	0.1 g
L- ascorbic acid	0.02 g
Nước cất chứa 0.08g mối loại K2HPO4 và KH2PO4, pH 7,2-7,4	90 ml
Thạch agar	0.05 g

Môi trường trên được hấp chín trong 10 min ở 121 °C, để nguội đến 49 °C, sau đó thêm 10 ml huyết thanh bò vô hoạt (vô hoạt ở 56 °C, trong 30 min), 100 000 đơn vị Penicilin C tinh thể và 0,1 g Streptocmycin sulphat vô trùng được thêm vào. Môi trường được chia vào lọ kín (16 mm x 125 mm) vô trùng, mỗi lọ 10 ml và để ở tủ lạnh 4 °C tới khi sử dụng. Các môi trường nên được nuôi cấy ở 37 °C trong khoảng 7 ngày, các mẫu môi trường nên được kiểm tra ở nhiều thời điểm hàng ngày. Khi pha môi trường, chia môi trường cần hạn chế tối đa sự tạp nhiễm vi khuẩn từ bên ngoài.

6.2.4.2  Nuôi cấy bằng kít thương mại InPouch _TM TF

Cách sử dụng và nuôi cấy thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.3.5  Đọc kết quả

- Sử dụng kính hiển vi quang học độ phóng đại 40 lần hoặc 100 lần quan sát thấy hình thái Tritrichomonas foetus như sau:

Ký sinh trùng dài từ 8 µm đến 18 µm và rộng từ 4 µm đến 9 µm, hình quả lê, có nhân lớn, có 3 roi phía trước và roi thứ 4 cong uốn khúc về phía sau, nối với thân bằng màng rung động, sau màng này là phần roi tự do, dọc thân có trụ giữa hình đũa.

CHÚ Ý: Có thể dùng kính hiển vi soi trực tiếp đối với kít thương mại InPouch _TM TF

6.4  Phương pháp PCR phát hiện kháng nguyên Tritrichomonas foetus

6.4.1  Lấy mẫu

...

...

...

6.4.2  Bảo quản mẫu

Xem 6.1.2

6.4.3  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là mẫu dịch âm đạo, tử cung bò cái, hoặc niêm mạc dương vật bò đực, nhau thai.

6.4.4  Cách tiến hành

6.4.4.1  Tách chiết DNA

Sử dụng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ: dùng kít tách chiết DNAeasy^® Blood & Tissue Kit, Qiagen (Cat. No.69504)3) (xem phụ lục D)

6.4.4.2  Chuẩn bị cặp mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp PCR và sử dụng cặp mồi (3.2.3) được nêu trong phần E1 phụ lục E.

...

...

...

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM.

6.4.4.3  Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem 6.4.4.2).

Sử dụng kít nhân gen (3.2.2) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Promega (Cat No.M7122)2

Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt xem phần E2, phụ lục E

6.4.4.4  Điện di

6.4.4.4.1  Chuẩn bị bản gel

Pha thạch Agarose (3.2.5) ở nồng độ từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (xem phụ lục C) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc cho tan.

...

...

...

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.3.5), đổ dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (xem phụ lục C) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe DNA gel stain4)) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.4.4.4.2  Chạy điện di

Hút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.3.5), chạy kèm theo thang chuẩn DNA (3.2.9) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn DNA (3.2.10) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

Bản thạch sau khi điện di xong được lấy ra và đọc kết quả trên máy đọc gel (4.3.6).

...

...

...

6.4.5  Đọc kết quả

Đặt bản gen lên trên máy đọc gel (4.3.6):

- Điều kiện phản ứng được công nhận khi: Mẫu đối chứng dương tính có vạch sản phẩm kích thước 347 bp và mẫu đối chứng âm tính không có vạch sản phẩm;

- Mẫu dương tính có hiển thị vạch sản phẩm giống như đối chứng dương và có kích thước 347 bp;

- Mẫu âm tính giống đối chứng âm và không có vạch sản phẩm xuất hiện;

- Mẫu nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không rõ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản phẩm. Trường hợp này cần lặp lại xét nghiệm.

6.5  Phương pháp Realtime PCR phát hiện kháng nguyên Tritrichomonas foetus

6.5.1  Lấy mẫu

Xem 6.1.1

...

...

...

Xem 6.1.2

6.5.3  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là mẫu dịch âm đạo, tử cung bò cái, hoặc niêm mạc dương vật bò đực, nhau thai.

6.5.4  Cách tiến hành

6.5.4.1  Tách chiết DNA

Sử dụng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít tách chiết DNAeasy^® Blood & Tissue Kit, Qiagen (Cat. No.69504)5) (xem phụ lục D)

6.5.4.2  Chuẩn bị cặp mồi và mẫu dò

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp Realtime PCR và sử dụng cặp mồi và mẫu dò được nêu trong Phần F1-Phụ lục F.

...

...

...

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindovvn (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM, pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease.

- Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 5 µM: pha loãng mẫu dò gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease.

6.5.4.3  Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.5.4.2).

Thành phần cho một phản ứng và chu trình nhiệt được nêu trong phần F2 phụ lục F.

6.5.4  Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy nhân gen realtime PCR dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền);

- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính có giá trị Ct biết trước và mẫu đối chứng âm tính không có giá trị Ct;

...

...

...

Những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại quy trình xét nghiệm hoặc xét nghiệm bằng phương pháp khác để khẳng định.

7  Kết luận

Bò được kết luận là mắc bệnh roi trùng do Tritrichomonas foetus khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và có kết quả xét nghiệm dương tính với một trong các phương pháp sau:

- Nuôi cấy;

- Soi tươi hoặc nhuộm Giemsa;

- PCR, realtime PCR.

Phụ lục A

(Quy định)

...

...

...

A.1  Dung dịch PBS 0,01 M (pH = 7,0)

Natri hydrophotphat (Na₂HPO₄) 9,47 g

Kali dihydrophotphat (KH₂PO₄) 9,08 g

Nước cất 900 ml

Hòa tan natri hydrophotphat, kali dihydrophotphat trong nước và lắc cho tan hết.

CHÚ Ý: có thể sử dụng PBS thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Dung dịch Giemsa 10 %

Dung dịch Giemsa azur-Eosin-Methylene blue 1 phần

Dung dịch PBS 0,01 M (pH = 7,0) 9 phần

...

...

...

Phụ lục B

(Quy định)

Dung dịch PBS pH 7,2

Thành phần

Natri clorua (NaCl) 8 g

Kali clorua (KCl) 0,2 g

Dinatri hidrophosphat (Na₂HPO₄) 1,15 g

Kali dihidrophosphat (KH₂PO₄) 0,2 g

...

...

...

Hòa tan các thành phần trong nước, bảo quản ở 4 °C.

Phụ lục C

(Quy định)

Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

C.1  Thành phần

Dung dịch TBE 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng: 1000 ml dung dịch TBE 1X

...

...

...

Lấy 100 ml dung dịch TAE hoặc TBE 10X với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết DNA

Tách chiết DNA của Tritrichomonas foetus bằng kit thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ dùng kit tách chiết DNAeasy ^® Blood & Tissue Kit, Qiagen (Cat. No.69504) như sau:

Pha dung dịch

- Dung dịch rửa 1: thêm 25 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào 19 ml dung dịch rửa AW1 đậm đặc;

...

...

...

Cách tiến hành

- Bước 1: ly giải mẫu

• Với mẫu niêm mạc âm đạo, dương vật: nhỏ 180 ml dung dịch ATL vào ống 1.5 ml; nhỏ 20 µl protease K vào ống. Trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3), ủ ở 56 °C trong 10 phút đến khi kết thúc quá trình ly giải, và trộn lại bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3) 15 s trước khi chuyển sang bước 2;

- Bước 2: nhỏ 200 µl dung dịch AL vào ống; trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3) trong 15 s. Ủ mẫu ở 56 °C trong 10 min;

- Bước 3: nhỏ 200 µl etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào ống, trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3).

- Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 µl dung dịch rửa 1, ly tâm ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 µl dung dịch rửa 2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 3 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 7: chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml hoặc 2 ml sạch Dnase/Rnase;

...

...

...

- Bước 9: bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml hoặc 2 ml có chứa DNA;

Bảo quản DNA trong tủ lạnh (4.1.2) nếu thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1) nếu thực hiện phản ứng PCR sau 24 h.

Phụ lục E

(Tham khảo)

Trình tự cặp mồi, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phương pháp PCR phát hiện Tritrichomonas foetus ở bò ^[3]

E.1  Trình tự cặp mồi

Gen đích

Cặp mồi

...

...

...

Tritrichomonas foetus

Kích thước sản phẩm

5.8S-ITS

Mồi xuôi (forward primer) TFR3

CGGGTCTTCCTATATGAGACAGAACC

347 bp

Mồi ngược (reverse primer) TFR4

CCTGCCGTTGGATCAGTTTCGTTAA

E.2  Thành phần phản ứng, chu trình nhiệt

...

...

...

Thành phần

Thể tích (µl)

Taq PCR Master Mix kít

12,5

Mồi xuôi, 20 µM

0,25

Mồi ngược, 20 µM

0,25

Nước tinh khiết không có nuclease

...

...

...

Tổng thể tích

23

Chuyển 23 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: cho 2 µl mẫu DNA có kích cỡ sản phẩm đã biết vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: cho 2 µl nước vào ống phản ứng;

Mẫu bệnh phẩm: cho 2 µl mẫu DNA bệnh phẩm vào ống phản ứng.

CHÚ Ý: phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kit nhân gen. Khi sử dụng bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chu trình nhiệt cài đặt cho máy nhân gen (4.3.1) được trình bày trong Bảng dưới đây:

Bảng - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

...

...

...

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

95 °C

2 min

1

94 °C

30 s

40

67 °C

...

...

...

72 °C

90 s

72 °C

15 min

1

Phụ lục F

(Tham khảo)

Trình tự cặp mồi, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phương pháp Realtime PCR phát hiện Tritrichomonas foetus ở bò ^[3]

...

...

...

Cặp mồi, mẫu dò

Trình tự 5’-3’

Mồi xuôi (forward primer) TFF2

GCG GCT GGA TTA GCT TTC TTT

Mồi ngược (reverse primer) TFR2

GGC GCG CAA TGT GCA T

Mẫu dò (TrichP2)

6 FAM ACA AGT TCG ATC TTT G MGB

F 2. Thành phần phản ứng, chu trình nhiệt

...

...

...

Chu trình nhiệt cài đặt cho máy nhân gen Realtime PCR được trình bày trong Bảng dưới đây:

Bảng - Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

50 °C

2 min

1

95 °C

...

...

...

1

95 °C

20 s

40

60 °C

45 s

CHÚ Ý: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kit nhân gen. Khi sử dụng bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...

[2] Phan Lục, nhà xuất bản Nông nghiệp, 1997. Giáo trình ký sinh trùng và Bệnh ký sinh trùng thú y

[3] BONDURANT R.H., CAMPERO C.M. ANDERSON M.L. & HOOSEAR K.A. (2003). Detection of Tritrichomonas foetus by polymerase chain reaction in culture isolates, cervicovaginal mucus, and formalin-fixed tissues from infected heifers and fetuses. J. Vet. Diagn. Invest., 15, 579-584.

1) Tham khảo từ nguồn tài liệu Trichomonosis OIE. Chapter 2.4.16

2) Tham khảo từ nguồn tài liệu Trichomonosis OIE. Chapter 2.4.16

3) Sản phẩm do hãng Qiagen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2^) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. Tuy nhiên, thành phần và thể tích của phản ứng PCR có thể thay đổi phù hợp với từng phòng thí nghiệm.

4) Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

5) Sản phẩm do hãng Qiagen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.