Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-41:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 41

• Số hiệu: TCVN8400-41:2019
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2019

Natri clorua (NaCl)	8,0 g
Kali clorua (KCl)	0,2 g
Natri hydrophosphat (Na2HPO4)	1,15 g
Kali dihydrophosphat (KH2PO4)	0,2 g
Nước cất	1000 ml

Cách chuẩn bị

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHi CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Dung dịch đệm glycerin pH ~ 8,3

Thành phần:

Natri dihydrocacbonat (NaHCO₃)

0,0715 g

Dinatri cacbonat (Na₂CO₃)

...

...

...

Nước cất vô trùng

10 ml

Glycerin vừa đủ

100 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, dùng khi đọc huỳnh quang.

Phụ lục B

...

...

...

Quy trình chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

B.2  Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

- Hút 200 μl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

...

...

...

- Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 μl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 pl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

...

...

...

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phương pháp PCR phát hiện vi rút dịch tả lợn Châu Phi

C.1  Trình tự mồi

Bảng C.1 - Trình tự mồi xuôi và mồi ngược

Mồi

Chuỗi (5’ -3’)

...

...

...

Mồi xuôi: PPA-1

AGT-TAT-GGG-AAACCC-GAC-CC

257

Mồi ngược: PPA-2

CCC-TGA-ATC-GGA-GCATCC-T

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng PCR

Thành phần nguyên liệu

(Theo hướng dẫn của kít Hot start Taq Gold DNA polymerase)

Nồng độ
μM

...

...

...

Nước không có DNAse và RNAse

17,375

Dung dịch đệm HotStar 10X

2,5

MgCI₂ 25 nM

2

...

...

...

0,5

Mồi xuôi

20

0,25

Mồi ngược

20

0,25

Taq Gold DNA polymerase 5U

...

...

...

0,125

Mẫu chiết tách ADN

2

Tổng thể tích cho 1 phản ứng

25

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Bước

...

...

...

Thời gian

Nhiệt độ
°C

1

1

10 phút

95

2

40

15 giây

...

...

...

30 giây

62

30 giây

72

3

1

7 phút

72

Giữ ở nhiệt độ 4 °C đến khi chạy điện di

...

...

...

- Chuẩn bị thạch Agarose (4.2.6) 2 % pha trong dung dịch TBE (4.2.7) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (4.2.8) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

- Cho mẫu vào các giếng (10 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch dung dịch nạp mẫu (loading dye)).

- Sử dụng thang chuẩn ADN (100 bp) (4.2.9).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V- 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

- Đọc kết quả:

...

...

...

+ Mẫu âm tính: Không có vạch.

- Đánh giá kết quả: có vi rút dịch tả lợn Châu Phi trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả PCR dương tính. Nếu kết quả nghi ngờ cần lấy sản phẩm PCR giải trình tự gen.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp realtime PCR phát hiện vi rút Dịch tả lợn Châu Phi

Bảng D.1 -Trình tự mồi và đoạn dò

STT

Mồi và đoạn dò

...

...

...

1

Mồi xuôi ASFV

CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA

2

Mồi ngược ASFV

GATACCACAAGATCRGCCGT

3

Đoạn dò ASFV

FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA

...

...

...

STT

Thành phần nguyên liệu
(Theo hướng dẫn của kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG)

Nồng độ
μM

Thể tích cho 1 phản ứng
μl

1

Nước không có RNAse và DNAse

5,5

2

...

...

...

20

0,5

3

Mồi ngược ASFV

20

0,5

4

Đoạn dò ASFV

6 μM

...

...

...

5

Dung dịch SuperMix

12,5

6

Mẫu chiết tách (ADN)

5

Tổng thể tích cho 1 phản ứng

25

...

...

...

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

50 (*)

2 phút (*)

01

95 (*)

2 phút (*)

...

...

...

95

15 giây

45

60

45 giây

(ghi nhận tín hiệu quang)

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-017.

Phụ lục E

...

...

...

Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể ASFV

Sử dụng kít thương mại Ingezim PPA compac 11.PPA.K3

E.1  Chuẩn bị nguyên liệu

- Tất cả các nguyên liệu (ngoại trừ Conjugate) để 30 phút ở nhiệt độ phòng (20 °C đến 25 °C) trước khi tiến hành phản ứng.

- Pha loãng dung dịch nước rửa 40 X: 40 ml dung dịch nước rửa đậm đặc với 960 ml nước khử ion.

E.2  Cách tiến hành

1. Nhỏ 50 μl Dilution Buffer vào các giếng:

Nhỏ 50 μl huyết thanh đối chứng dương vào 2 giếng (ví dụ: A1 và B1)

Nhỏ 50 μl huyết thanh đối chứng âm vào 2 giếng (ví dụ: A2 và B2)

...

...

...

2. Dán đĩa lại và ủ ở nhiệt độ 36 °C (± 1 °C) trong 1 giờ ± 5 phút hoặc qua đêm (từ 16 giờ đến 20 giờ) ở nhiệt độ phòng từ 20 °C đến 25 °C.

3. Đổ bỏ dung dịch trong đĩa vào bình chất thải chứa dung dịch NaOH; rửa đĩa bằng cách thêm 300 μl dung dịch nước rửa đã pha ở 1 vào các giếng, rồi đổ bỏ. Lặp lại 4 lần.

4. Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha loãng conjugate 100 X (ví dụ: 110 μl conjugate vào 11 ml Dilution), lắc nhẹ trước khi dùng.

5. Nhỏ 100 μl dung dịch Conjugate 1 X vào tất cả các giếng.

6. Dán đĩa và ủ ở nhiệt độ 36 °C (± 1 °C) trong 30 phút.

7. Rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa như bước 3.

8. Nhỏ 100 μl dung dịch Subtrate vào các giếng. Đặt đĩa ở nhiệt độ phòng từ 20 °C đến 25 °C trong vòng 15 phút.

9. Thêm 100 μl dung dịch stop Solution vào các giếng để dừng phản ứng.

10. Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA (mục 5.3.1) ở bước sóng 450 nm trong vòng 5 phút sau khi dừng phản ứng.

...

...

...

- Điều kiện phản ứng được công nhận khi: NC/PC ≥ 4, trong đó:

NC: Mật độ quang học (OD) trung bình của đối chứng âm

PC: Mật độ quang học (OD) trung bình của đối chứng dương

- Đánh giá kết quả dựa trên X % của mẫu theo công thức sau:

X% = [(NC - Sample OD)/ (NC-PC)] x 100 %

+ Mẫu dương tính khi: X % ≥ 50 %

+ Mau âm tính khi: X % ≤ 40 %

+ Mẫu có giá trị 40 % < X % < 50 % được cho là nghi ngờ

...

...

...

[1] OIE (Office International des Epizooties), 2012. African swine fever. Chapter 2.8.1. Terrestrial Manual.

[2] AAHL (Australian Animal Health Laboratory) Regional Programme, 2011. African Swine Fever TaqMan Assay. Nucleic Acid Detection for Disease Diagnosis and Emergency Disease Investigation.

[3] Chi Cục Thú Y Vùng VI, 2017. Quy trình phát hiện vi rút dịch tả lợn Châu Phi bằng kỹ thuật realtime PCR.

1) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

2)^và3) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.