TCVN-8685-38-2020-Quy-trinh-kiem-nghiem-vac-xin-Phan-38-phong-benh-do-Leptospira

• Số hiệu: TCVN8685-38:2020
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2020

Tất cả các dung dịch trên đều được làm cho hòa tan hoàn toàn. Sau đó lần lượt cho các dung dịch trên với số lượng như sau: 25 ml dung dịch 1; 2.5 ml dung dịch 2; 2,5 ml dung dịch 3; 15,63 ml dung dịch 4; 2,5 ml dung dịch 5; 1,25 ml dung dịch 6; 166,75 ml dung dịch 7, cho nước vừa đủ tới 250 ml. Lắc đều và đem lọc qua màng lọc millipore có kích thước lỗ lọc 0,2 μm. Môi trường sau khi pha chế sử dụng tốt nhất trong 1 tháng ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C.

C.1.3  Môi trường nuôi cấy Leptospira: Hoà tan 2,3 g môi trường EMJH cơ bản vào trong 900 ml nước cất 2 lần. Môi trường được hấp vô trùng ở 121 °C trong 15 phút. Sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, bổ sung thêm dung dịch Enrichment (900 ml môi trường EMJH cơ bản + 100 ml dung dịch Enrichment). Trộn đều, điều chỉnh pH 7,5 bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc dung dịch HCl 1 N. Môi trường sau đó được chia ra các ống nghiệm thủy tinh 12 X 120 mm, sử dụng tốt nhất trong 3 tháng ở nhiệt độ 2°C đến 8°C.

C.1.4  Dung dịch PBS 1 X, pH 7,2.

C.2  Thiết bị và dụng cụ

C.2.1  Tủ lạnh âm sâu, duy trì nhiệt độ âm 80 °C.

C.2.2  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

C.2.3  Bể ủ nhiệt, duy trì nhiệt độ 56 °C.

C.2.4  Ống nghiệm thủy tinh vô trùng kích thước 12 × 120 mm.

C.2.5  Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U.

...

...

...

C.3  Chuẩn bị

C.3.1  Canh khuẩn Leptospira

- Các chủng Leptospira được lấy ra từ tủ lạnh âm sâu (C.2.1) rồi đem giải đông ở tủ lạnh (C.2.2) sau đó khôi phục lại giống ở tủ ấm (6.1) từ 10 ngày đến 14 ngày.

- Dùng pipette đơn kênh (6.3) cấy chuyển các chùng Leptospira sang môi trường nuôi cấy Leptospira (C.1.3) nuôi cấy ở tủ ấm (6.1) từ 4 ngày đến 5 ngày.

- Kiểm tra độ tự ngưng kết của các chủng Leptospira bằng cách soi tươi trên kính hiển vi tụ quang nền đen (6.2). Chủng Leptospira được coi là đạt nếu không có các cụm ngưng kết.

C.3.2  Huyết thanh thí nghiệm

Lấy máu động vật (7.5.1), chắt lấy huyết thanh, sau đó khử bổ thể bằng cách ủ ở bể ủ nhiệt (C.2.3) trong 30 phút ở nhiệt độ 56 °C.

C.3.3  Huyết thanh tối miễn dịch

Vô hoạt canh khuẩn Leptospira (C.1.3) bằng cách ủ ở bể ủ nhiệt (C.2.3) trong 30 phút ở nhiệt độ 56 °C, sau đó canh khuẩn vô hoạt được tiêm cho thỏ (5.2) với các liều lần lượt như sau:

...

...

...

- Ngày thứ 8: tiêm 4 ml canh khuẩn Leptospira (C.1.3) cho thỏ theo đường dưới da.

- Ngày thứ 15: tiêm 1 ml canh khuẩn Leptospira (C.1.3) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 18: tiêm 4 ml canh khuẩn Leptospira (C.1.3) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 22: tiêm 6 ml canh khuẩn Leptospira (C.1.3) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Một tuần sau mũi tiêm cuối cùng tiến hành lấy máu thỏ, chắt huyết thanh kiểm tra hiệu giá kháng thể với kháng nguyên cùng chủng. Huyết thanh thỏ phải đạt hiệu giá ngưng kết ≥ 1/12.800.

C.4  Cách tiến hành

- Pha loãng huyết thanh thí nghiệm (C.3.2) với nước muối sinh lý vô trùng (5.6) theo tỷ lệ 1/10 (1 ml huyết thanh với 9 ml nước, muối sinh lý vô trùng).

- Dùng pippette đơn kênh (6.3) hút 50 μl dung dịch PBS (C.1.4) vào mỗi giếng thí nghiệm của đĩa nhựa 96 giếng (C.2.5) (từ giếng A1 đến giếng H8).

- Dùng pippette đơn kênh (6.3) hút 50 μl huyết thanh thí nghiệm đã pha loãng theo tỷ lệ 1/10 vào giếng A1 và pha loãng theo cơ số 2 bằng cách trộn đều rồi chuyển 50 μl sang giếng thứ 2, cứ như vậy đến giếng số 8 trộn đều rồi hút bỏ đi 50 μl.

...

...

...

- Ủ đĩa trong tủ ấm (6.1) ở nhiệt độ 28 °C trong 30 phút.

- Dùng pippette đơn kênh (6.3) hút 10 μl huyễn dịch ở mỗi độ pha loãng lên phiến kính sạch rồi soi dưới kính hiển vi tụ quang nền đen (6.2) và đọc kết quả.

+ Phản ứng âm tính: không có cụm ngưng kết;

+ Phản ứng dương tính: có cụm ngưng kết.

Bảng C.1 - Sơ đồ bố trí thí nghiệm phản ứng vi ngưng kết

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ASEAN, (2012). Asean Standard Requirements for Leptospira for dog, bacterin. 2nd edition, p93 -94.

...

...

...

[3] OIE Terrestrial Manual (2012). Chapter 2.4.12. Leptospirosis. Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.