TIÊU
CHUẨN QUỐC GIA
TCVN
12621:2019
PHÂN
BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)
Fertilizers -
Determination of amino acids content by high performance liquid chromatography
method (HPLC)
Lời nói đầu
TCVN 12621:2019 do Viện Quy hoạch và
Thiết kế Nông nghiệp
biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn
Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
PHÂN BÓN -
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Fertilizers -
Determination of amino acids content by high performance liquid chromatography
method (HPLC)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp
xác định hàm lượng axit amin tự do (tổng hợp và tự nhiên) và axit amin ở dạng tổng số
(liên kết peptit và tự do) trong phân bón bằng thiết bị sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) có cột trao đổi ion.
Tiêu chuẩn này áp dụng cho các
axit amin sau: tổng của cystin và cystein; methionin; lysin; threonin; alanin;
arginin; axit aspartic; axit glutamic; glycin; histidin; iso leucin; leucin;
phenylalanin; prolin; serin; tyrosin; valin.
Tiêu chuẩn này không phân biệt giữa
các muối của axit amin, cũng không phân biệt các dạng đồng phân D và
L của axit amin.
Tiêu chuẩn không áp dụng để xác định tryptophan
hoặc các chất tương tự axit amin có chứa nhóm hydroxyl.
2 Thuật ngữ và định
nghĩa
Tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa
sau:
2.1
Axit amin tự do (free amino
acid)
Nhóm axit amin ưa nước, có liên kết chặt
chẽ với môi trường nước và thường tạo liên kết hydro với môi trường và giữa các
axit amin với nhau.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Axit amin ở dạng liên kết
peptit
(peptide-linked amino acids)
Nhóm axit amin kỵ nước không hoặc khó tan trong nước,
do vậy phần lớn các axit amin nằm ở phần nội của protein.
2.3
Axit amin tổng (total amino
acids)
Bao gồm axit amin tự do và axit amin ở dạng liên kết peptit.
3 Nguyên tắc
3.1 Các axit amin
tự do
Các axit amin tự do được chiết với
dung dịch axit clohydric loãng. Các chất đồng chiết xuất có phân tử lượng lớn
chứa nitơ được kết
tủa với axit
sulfosalicylic và được loại bằng cách lọc. Dịch lọc được điều chỉnh pH tới
2,20. Các axit amin được tách riêng biệt bằng cột trao đổi ion trong thiết bị
HPLC và xác định bằng phản ứng với
ninhydrin sử dụng detector quang đo ở bước sóng 570 nm.
3.2 Các axit amin
tổng số
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Quá trình oxy hóa được thực hiện ở 0 °C với hỗn
hợp axit performic và phenol. Thuốc thử oxy hóa dư được loại bỏ bằng natri
sulfit. Mẫu oxy hóa hoặc
không oxy hóa đều được thủy phân trong môi trường axit clohydric 6 mol/L. Dịch
thủy phân được điều chỉnh pH tới
2,20. Các axit amin được tách riêng biệt bằng cột trao đổi ion trong thiết bị
HPLC và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử dụng detector quang đo ở bước sóng
570 nm. (bước sóng 440 nm đối với prolin).
4 Thuốc thử
Trừ khi có quy định khác, trong quá
trình phân tích chỉ sử dụng các
hóa chất, thuốc thử có cấp độ tinh
khiết dùng cho phân
tích sắc ký.
4.1 Nước, sử dụng nước
cất hai lần hoặc nước có chất lượng
tương tự (độ dẫn điện <10 µS).
4.2 Hydro peroxit (H2O2) đậm đặc.
4.3 Axit formic (HCOOH) đậm
đặc.
4.4 Axit
clohydric
(HCl) đậm đặc, d
= 1,19 g/mL.
4.5 Natri hydroxit (NaOH) dạng
hạt.
4.6 Phenol (C6H5OH) thể rắn.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.8 Axit
5-sulfosalicylic (C7H6O2S.2H2O) thể rắn.
4.9 Natri citrat (Na3C6H5O7.2H2O) thể rắn.
4.10 Natri clorua (NaCl) thể rắn
4.11 Natri sulfit (Na2SO3) thể rắn.
4.12 Dung môi 1-octanol (C8H18O)
4.13 Dầu nhẹ, nhiệt độ
sôi từ 40 °C đến 60 °C.
4.14 Norleucin, hay bất kỳ
chất khác phù hợp để sử dụng làm chất nội chuẩn.
4.15 Khí nitơ 5.0.
4.16 Các axit
amin.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.16.2 Axit cysteic.
4.16.3 Methionin
sulfon.
CHÚ THÍCH 1: Sử dụng các hợp chất tinh
khiết không chứa nước kết tinh. Làm khô trong chân không có chứa P2O5 hoặc H2SO4
trong 1 tuần trước khi sử dụng.
4.17 Dung dịch
natri hydroxit 7,5 mol/L:
Hòa tan 300 g natri hydroxit (4.5) trong nước và định mức đến 1000 mL.
4.18 Dung dịch natri
hydroxit
1 mol/L: Hòa tan 40 g natri hydroxit (4.5) trong nước và định mức đến 1000 mL.
4.19 Hỗn hợp chiết (axit
clohydric 0,1 mol/L chứa 2 % thiodiglycol): Hút 8,2 mL axit clohydric đậm đặc (4.4)
pha loãng với khoảng 900 mL nước. Thêm 20 mL thiodiglycol (4.7) và định mức đến
1000 ml bằng nước.
CHÚ THÍCH 2: Không trộn trực tiếp axit clohydric đậm đặc (4.4)
và thiodiglycol (4.7)
4.20 Dung dịch
axit formic-phenol: Trộn 889 g axit formic (4.3) với 111 g nước và thêm 4,73
g phenol (4.6).
4.21 Hỗn hợp thủy
phân
(axit clohydric 6 mol/L chứa 1 g phenol): Hòa tan 1 g phenol (4.6) vào 492 mL
axit clohydric đậm đặc (4.4) và định mức đến 1000 mL bằng nước.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.23 Hỗn hợp oxy
hóa
(axit
performic-phenol)
Trộn 0,5 mL hydro peroxit (4.2) với
4,5 mL hỗn hợp axit
formic-phenol (4.20) trong cốc nhỏ. Giữ
ở nhiệt độ trong khoảng
20 °C đến 30 °C trong 1 h nhằm tạo ra axit performic, sau đó làm lạnh trong bể điều nhiệt ở 0 °C (15 min)
trước khi thêm vào mẫu.
CHÚ THÍCH 3: Tránh tiếp xúc với da và
nên mặc quần áo
bảo hộ.
4.24 Đệm citrat (Na+: 0,2 mol/L),
pH = 2,20.
Hòa tan 19,61 g natri citrat (4.9), 5 mL
thiodiglycol (4.7), 1 g phenol (4.6) và 16,50 ml axit clohydric đậm đặc (4.4)
trong khoảng 800 mL nước. Điều chỉnh pH tới 2,20. Định mức đến 1000 mL
bằng nước.
4.25 Đệm rửa giải, chuẩn bị theo các
điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng.
4.26 Thuốc thử
ninhydrin,
chuẩn bị theo các
điều kiện của thiết bị phân tích được
sử dụng.
4.27 Dung dịch
chuẩn của các axit amin
4.27.1 Dung dịch
chuẩn gốc axit amin (theo Điều 1) có nồng độ là 2,5 µmol/mL trong axit HCl.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.27.2 Dung dịch chuẩn
gốc axit
cysteic và methionin sulfon, 1,25 µmol/mL.
Hòa tan 0,2115 g axit cysteic (4.16.2) và
0,2265 g methionin sulfon (4.16.3) trong đệm citrat (4.24) vào bình định mức
dung tích 1000 mL và
định mức đến vạch bằng đệm citrat.
CHÚ THÍCH 4: Các dung dịch chuẩn được bảo quản
dưới 5 °C không quá 12 tháng. Dung dịch này không nên dùng nếu dung dịch chuẩn gốc (4.27.1)
có chứa axit
cysteic và methionin
suIfon.
4.27.3 Dung dịch chuẩn
gốc và chất nội chuẩn, ví dụ như norleucin 20 µmol/mL.
Hòa tan 0,6560 g norleucin (4.14)
trong đệm citrat (4.24) vào bình định mức dung tích 250 mL và định mức đến vạch bằng đệm
citrat. Bảo quản dưới 5 0°C không quá 6 tháng.
4.27.4 Dung dịch chuẩn
làm việc của các chất chuẩn axit amin, sử dụng cho các dịch
thủy phân, axit cysteic và methionin sulfon có nồng độ 0,1 µmol/mL và các
axit amin khác là 0,2 µmol/mL.
Hòa tan 2,2 g natri
clorua (4.10) trong cốc dung tích 100 mL với 30 mL đệm citrat (4.24). Thêm 4,00
mL dung dịch chuẩn gốc axit
amin (4.27.1), 4,00 mL dung dịch chuẩn gốc axit cysteic và methionin
sulfon (4.27.2), và 0,50 mL chuẩn gốc của dung dịch nội chuẩn (4.27.3) nếu cần sử dụng. Điều
chỉnh pH tới
2,20 bằng dung dịch natri hydroxit 1 mol/L (4.18). Chuyển định lượng vào bình định mức
dung tích 50 mL và định mức bằng đệm citrat (4.24), trộn đều. Bảo quản dưới 5 °C
không quá 3 tháng.
4.27.5 Dung dịch hiệu
chuẩn của các chất chuẩn axit amin
Đối với đường chuẩn của các axit amin (Điều
1) sử dụng các dịch chiết được chuẩn bị theo (6.2) và với dịch thủy phân được chuẩn
bị theo 6.3.2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5 Thiết bị và dụng cụ
Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường
trong phòng thí nghiệm và các dụng cụ, thiết bị sau:
5.1 Bình cầu đáy
tròn,
dung tích 100 mL hoặc 250 mL có sinh hàn hồi lưu.
5.2 Bình thủy tinh
bosilicat,
dung tích 100 mL với nắp bằng cao su/teflon (ví dụ: Duran, Schott)
chịu nhiệt.
5.3 Tủ sấy, có điều khiển
nhiệt độ.
5.4 Thiết bị đo
pH,
đọc được đến ba số thập phân.
5.5 Màng lọc, 0,2 µm.
5.6 Máy ly tâm.
5.7 Bộ cất quay
chân không.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.9 Rây 0,25 mm.
5.10 Bể điều nhiệt.
5.11 Thiết bị HPLC có cột trao
đổi ion, thiết bị dẫn suất sau cột cho ninhydrin và detector quang.
Cột được nhồi với các hạt nhựa
polystyren đã được sulfonat hóa có khả năng tách axit amin ra khỏi nhau và khỏi
các chất khác dương tính với ninhydrin. Tốc độ dòng của dung dịch đệm và
ninhydrin được điều chỉnh bằng bơm để có tốc độ dòng ổn định ± 0,5 % trong suốt
quá trình chạy đường chuẩn và phân tích mẫu.
Đối với một số thiết bị, quá trình thủy phân có
thể được sử dụng mà trong đó dịch
thủy phân có nồng độ natri
0,8 mol/L và chứa tất cả lượng axit formic dư từ bước oxy hóa. Một số thiết bị khác sẽ
không tách tốt một số axit amin nhất định nếu dung dịch thủy phân chứa nồng độ axit
formic quá dư và/hoặc nồng độ ion
natri cao. Trong trường hợp này, giảm thể tích axit bằng cách làm bay hơi tới xấp xỉ 5 mL sau khi
thủy phân và trước khi điều chỉnh pH. Quá trình bay hơi nên thực hiện
trong điều kiện chân không ở nhiệt độ không vượt quá 40 °C.
6 Cách tiến hành
6.1 Chuẩn bị
mẫu thử
6.1.1 Phân bón dạng rắn
Nghiền mẫu cho đến khi lọt qua lỗ sàng
0,25 mm. Các mẫu
có độ ẩm cao sẽ được sấy khô bằng
không khí ở nhiệt độ
không quá 50 °C hoặc đông khô trước khi
nghiền. Các mẫu có hàm lượng chất
béo cao sẽ được chiết với dầu nhẹ (4.13) trước khi nghiền.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dạng dung dịch: Mẫu lấy ban đầu không
ít hơn 50 mL, trước khi lấy
mẫu để tiến hành phép thử mẫu phải
được lắc đều.
Dạng lỏng sền sệt: Mẫu lấy ban đầu không ít
hơn 200 g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được trộn
đều.
6.2 Xác định
các axit amin tự do
Cân một lượng mẫu phân bón phù hợp (1
g đến 5 g) chính xác đến
0,0001 g đã được chuẩn bị theo (6.1) vào bình tam giác và thêm 100 mL của hỗn hợp dịch chiết (4.19).
Lắc đều trong 60 min, sử dụng máy lắc hoặc máy khuấy từ. Để cho lắng cặn
rồi dùng pipet hút 10 mL dung dịch phía trên cho vào cốc có mỏ dung tích 100 mL.
CHÚ THÍCH 5: Lượng mẫu cân nên chứa lượng nitơ
khoảng 10 mg và lượng nước không vượt quá 100 mg; Lượng mẫu cần chuẩn bị được tính
toán như sau:

trong đó:
Ns là lượng
nitơ trong mẫu thử, tính bằng phần
trăm (%);
Ws là khối lượng của phần
mẫu thử tương đương
với lượng nitơ khoảng 10 mg, tính bằng miligam (mg).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nếu sử dụng chất nội chuẩn,
thêm 1,00 mL dung dịch nội chuẩn (4.27.3) cho mỗi 100 mL dịch cuối và
định mức đến vạch bằng dung dịch đệm citrat (4.24).
Chạy sắc ký tiếp theo 6.4
Nếu dịch chiết không được sử dụng cùng
ngày thì
phải bảo quản ở nhiệt độ dưới
5 °C.
6.3 Xác định
các axit amin tổng số
6.3.1 Quá trình oxy hóa
Cân một lượng mẫu phân bón phù hợp (1 g đến 5 g) chính xác đến 0,0001 g đã được
chuẩn bị theo (6.1)
cho vào
- Bình tam giác dung tích 100 mL để thủy phân hở (6.3.2.3),
hoặc
- Bình tam giác dung tích 250 mL nếu yêu cầu nồng độ natri
thấp (6.3.3.2) hoặc
- Bình dung tích 100 mL có nút nhám đậy để thủy phân
kín (6.3.2 4).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Quy trình tiếp tục theo
6.3.2.1.
6.3.2 Quá trình thủy
phân
6.3.2.1 Thủy phân mẫu
đã được oxy hóa
Đối với mẫu đã oxy hóa được chuẩn bị như
6.3.1, thêm 25 mL hỗn hợp thủy phân (4.21), tráng cẩn thận bình mẫu để lấy
hết lượng mẫu còn bám trên thành bình và que khuấy. Tùy thuộc vào quá trình thủy
phân được sử dụng,
quy trình được thực
hiện theo các bước nêu tại 6.3.2.3 hoặc 6.3.2.4.
6.3.2.2 Thủy phân
các mẫu chưa được oxy hóa
Cân một lượng mẫu phân bón phù hợp
(1 g đến 5 g) chính xác đến 0,0001g đã được chuẩn bị theo (6.1) cho vào bình
tam giác dung tích 100 mL hoặc 250 mL hoặc vào bình có nắp đậy dung
tích 100 mL. Phần mẫu thử được cân nên
chứa khoảng 10 mg nitơ (theo CHÚ THÍCH 5). Thêm cẩn
thận vào bình 25 mL hỗn
hợp thủy phân (4.21) và
trộn đều mẫu. Quy trình được tiếp
tục thực hiện theo các bước 6.3.2.3 hoặc 6.3.2.4.
6.3.2.3 Thủy phân hở
Thêm ba viên thủy tinh trợ sôi vào bình đựng mẫu (đã
được chuẩn bị ở 6.3.2.1 hoặc
6.3.2.2) và đun hồi lưu liên tục
trong 23 h. Khi quá trình thủy phân kết thúc, rửa sinh hàn từ trên xuống bằng 5 mL
dung dịch đệm citrat (6.24). Tháo bình mẫu và làm lạnh trong bể điều nhiệt ở 0 °C. Quá
trình tiếp tục thực hiện theo 6.3.3.
6.3.2.4 Thủy phân kín
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tùy thuộc vào quá trình điều chỉnh
pH (6.3.3), chuyển định lượng mẫu trong bình sang bình tam giác dung tích 250 mL hoặc
bình cầu đáy
tròn dung tích 250 mL sử dụng dung dịch đệm citrat (4.24).
Tiến hành tiếp tục theo 6.3.3.
6.3.3 Điều chỉnh pH
6.3.3.1 Tùy thuộc vào
mức độ dung nạp natri của thiết bị sử dụng để phân tích axit amin, quá trình tiếp tục được
thực hiện theo 6.3.3.2 hoặc 6.3.3.3 để điều chỉnh pH.
6.3.3.2 Khi thiết bị phân
tích axit amin đòi hỏi nồng độ natri
thấp (thì thể tích axit phải
giảm xuống) và đối với hệ thống cột trao đổi
ion cũng yêu cầu độ natri thấp, thì nên sử dụng dung dịch chuẩn gốc của chất nội
chuẩn (4.27.3).
Trong trường hợp này, thêm 2,00 mL
dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (4.27.3) để thủy phân trước khi làm bay
hơi. Thêm 2 giọt dung dịch 1-octanol (4.12) vào dung dịch thủy phân thu được từ
6.3.2.3 hoặc 6.3.2.4.
Sử dụng thiết bị cất quay chân không để
làm giảm thể
tích xuống 5 mL đến 10 mL dưới điều kiện chân không ở 40 °C. Nếu thể tích dung dịch còn dưới 5 mL,
mẫu thủy phân phải bỏ đi và thực hiện lại
quá trình phân tích từ đầu.
Điều chỉnh pH đến 2,20 bằng
dung dịch natri hydroxit 1 mol/L (4.18) và thực hiện theo 6.3.2.4.
6.3.3.3 Đối với hệ
thống cột trao đổi
ion không yêu cầu nồng độ natri
thấp, lấy mẫu thủy phân thu được theo 6.3.2.3 và 6.3.2.4 và trung hòa từ từ, cẩn thận bằng
cách thêm 17 mL dung dịch natri hydroxit 7,5 mol/L (4.17), sử dụng máy khuấy từ,
trong suốt quá trình này nhiệt độ phải luôn được giữ ở mức dưới 40 °C.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.3.3.4 Dung dịch mẫu
thử cho chạy sắc ký
Chuyển toàn bộ lượng dịch thủy phân đã điều chỉnh
pH (6.3.3.2 hoặc 6.3.3.3) cùng dung dịch đệm citrat (4.24) vào bình
định mức dung tích 200 mL và định mức đến vạch
mức bằng dung dịch đệm.
Nếu chất nội chuẩn không có sẵn, thêm
2 mL dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (4.27.3) và định mức đến vạch mức bằng dung dịch
đệm citrat (4.24). Trộn đều cẩn thận.
Thực hiện bước chạy sắc ký (6.4)
Nếu dung dịch mẫu không được thực hiện
trong cùng ngày, mẫu phải được bảo quản dưới 5 °C.
6.4 Chạy sắc
ký
Trước khi thực hiện chạy sắc ký, đưa dịch
chiết (6.2) hoặc
dịch thủy phân (6.3.3.4) về nhiệt độ phòng. Lắc đều hỗn hợp và lọc một lượng
phù hợp qua màng lọc cỡ 0,2
µm. Đưa dịch lọc
sạch vào cột trao đổi ion, sử dụng
thiết bị HPLC.
Bơm mẫu có thể thực hiện
bằng tay hoặc tự động. Điều quan trọng là đưa lên cột phân tích cùng một lượng
dung dịch chất chuẩn
và mẫu thử
không sai khác quá 0,5 % trừ khi chất nội chuẩn được sử dụng, tỷ lệ giữa lượng
natri:axit amin trong chất chuẩn và dung dịch mẫu là tương tự nhau thì mới có thể
thực hiện được.
Nói chung, tần suất chạy dung dịch chuẩn
phụ thuộc độ ổn định của thuốc thử ninhydrin và hệ thống phân tích. Pha loãng
chất chuẩn hoặc mẫu với dung dịch đệm
citrat (4.24) để có được diện tích pic của chất chuẩn vào khoảng 30 % đến 200 %
diện tích pic mẫu axit amin.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trong suốt quá trình chạy sắc ký, tỷ số
giữa chiều cao lõm:pic đề cập ở dưới đây được áp dụng khi dung dịch có cùng nồng độ mol (của
các axit đang xác định) được phân tích. Dung dịch axit amin cùng nồng độ mol này chứa ít nhất 30 % của
lượng axit amin tải tối đa của mỗi axit amin mà có thể đo được chính xác.
Để tách threonin và serin, tỷ số giữa chiều
cao lõm:pic của pic thấp hơn trong hai axit amin chồng lên nhau
trong sắc ký đồ không vượt quá 2:10 (nếu chỉ cystein, methionin và lysin được
xác định, sự tách không rõ ràng giữa các pic liền kề sẽ gây sai số đến phép đo).
Đối với tất cả các axit amin tỷ số tách tốt hơn nên là 1:10.
Hệ thống nên đảm bảo rằng lysin được
tách khỏi "lysin nhân tạo" và ornithin.
7 Biểu thị kết quả
Diện tích pic của mẫu và chất chuẩn được
đo cho mỗi axit amin và lượng mẫu được tính theo gam axit amin /kilogam mẫu, được
tính theo công
thức (1):
(1)
Nếu chất nội chuẩn được sử dụng, thì nhân với 
trong đó
Ae là diện tích pic của
chất trong dịch thủy phân;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Aie là diện tích
pic của chất nội chuẩn trong dịch thủy phân;
Aic là diện tích
pic của chất nội chuẩn trong dung
dịch chuẩn hiệu chuẩn;
M là khối lượng phân tử của axit
amin được xác định;
C là nồng độ của chất chuẩn,
µmol/mL;
m là khối lượng mẫu, tính bằng g (tính về khối lượng
ban đầu nếu mẫu được làm khô hoặc loại chất béo);
Ve là tổng thể tích của dịch
thủy phân (6.3.3.4) hoặc tổng thể tích pha loãng của dịch chiết (6.2),
tính bằng mililit.
Cả cystin và cystein được xác định giống
như axit cysteic trong thủy phân mẫu đã oxy hóa, nhưng được tính
theo tổng của cystein và cystin sử dụng M = 120,15 g (= 0,5 x 240,30) (C6H12N2O4S2,
M = 240,30 g).
Methionin được xác định như
methionin sulfon trong thủy phân mẫu đã được oxy hóa, nhưng tính toán bằng cách
sử dụng M của methionin = 149,21 g.
Methionin tự do thêm vào được xác định
sau khi chiết tách như methionin; tính toán tương tự sử dụng cùng chung M.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(2)
trong đó
Vef là thể tích
chiết cuối cùng, tính bằng mililit.
Các kết quả có thể chuyển đổi sang phần
trăm (%):
Kết quả tính theo % =
0,1 x kết quả tính theo gam
trên kilogam.
8 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm bao gồm ít nhất những
thông tin sau:
a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;
b) Đặc điểm nhận dạng mẫu;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
d) Mọi thao tác không quy
định trong tiêu chuẩn này, hoặc dược coi là tùy chọn và các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;
e) Ngày thử nghiệm.