Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8972-1:2011 về Thực phẩm - Xác định vitamin A – Phần 1: Xác định 13-cis-retinol

• Số hiệu: TCVN8972-1:2011
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2011

Khối lượng mẫu	Ancol	Chất chống oxi hóa	Kali hydroxit
2 g đến 5 g	50 ml metanol	0,25 g AA	5 ml dung dịch 50 g/100 ml
5 g đến 10 g	100 ml etanol	1 g AA + 0,04 g Na2S	20 m dung dịch 60 g/100 ml
10 g đến 20 g	150 ml etanol	1 g AA	50 ml dung dịch 60 g/100 ml

Thông thường, thời gian xà phòng hóa là từ 15 min đến 45 min ở nhiệt độ từ 80 °C đến 100 °C. Quá trình xà phòng hóa có thể cũng được tiến hành qua đêm ở nhiệt độ phòng (khoảng 16 h) trong các điều kiện tương đương.

Nếu sau khi xà phòng hóa và làm nguội, vẫn còn chất béo hoặc dầu thực vật trên bề mặt hỗn hợp xà phòng hóa, thì bổ sung kali hydroxit trong etanol và kéo dài thời gian xà phòng hóa.

7.3.2. Chiết

Để tránh tạo nhũ, nên bổ sung một lượng nước vào dung dịch mẫu đã xà phòng hóa sao cho tỷ lệ của ancol với nước có trong dung dịch tạo thành là 1:1.

Chiết retinol ra khỏi dung dịch mẫu đã xà phóng hóa bằng dung môi thích hợp hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp khác (4.7) và lặp lại quy trình từ 3 lần đến 4 lần với các thể tích từ 50 ml đến 150 ml. Rửa các dịch chiết hỗn hợp cho đến trung tính bằng nước (từ 2 lần đến 4 lần, mỗi lần từ 50 ml đến 150 ml). Việc chiết có thể cũng được thực hiện bằng kỹ thuật chiết lỏng/lỏng có hỗ trợ pha rắn (ví dụ Extrelut^®2)) khi hàm lượng retinol không quá thấp và hàm lượng chất béo của mẫu nhỏ hơn 10 % [1].

7.3.3. Làm bay hơi

Cho bay hơi dịch chiết bằng máy cô quay (5.2) dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 50 °C. Loại bỏ hết nước bằng cách dùng natri sulfat (4.4) hoặc bằng cách chưng cất đồng sôi với etanol tuyệt đối (4.2), hoặc dùng giấy lọc tách pha (5.5).

7.3.4. Pha loãng

Hòa tan lại cặn, tốt nhất là dùng pha động (4.8), hoặc dung môi thích hợp khác dùng cho HPLC để thu được nồng độ thích hợp để bơm lên cột HPLC (5.4). Đây là dung dịch mẫu thử.

...

...

...

Dùng các dung dịch chuẩn (4.10.3), để chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn dùng cho HPLC, sử dụng các dung môi thích hợp bao trùm dải nồng độ cần phân tích.

7.5. Nhận biết và kiểm tra độ tinh khiết

Nhận biết all-trans-retinol và 13-cis-retinol bằng cách so sánh thời gian lưu từ sắc đồ của mẫu với thời gian lưu thu được từ các chất chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký. Việc nhận biết pic có thể được thực hiện bằng cách bổ sung các chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử.

CHÚ THÍCH 1 Việc tách và định lượng cho thấy là thỏa mãn nếu tuân thủ các điều kiện sắc ký sau đây (xem thêm Hình A.1). Đối với các hệ thống HPLC thay thế, xem Bảng C.1.

Pha tĩnh: Merck LiChrosorb^®Si60,5 mm

Kích thước cột: 250 mm x 4 mm

Pha động: n-hexan + n-butanol (98 + 2) (thể tích)

Tốc độ dòng: 2ml/min

Thể tích bơm: 50 ml

...

...

...

tử ngoại (UV): bước sóng 325 nm.

Kiểm tra độ tinh khiết của các chất chuẩn của all-trans-retinol và 13-cis-retinol bằng cách bơm một thể tích thích hợp (ví dụ: 20 ml) của các dung dịch chuẩn (4.10.3) chứa khoảng 10 mg all-trans-retinol hoặc 13-cis-retinol trên mililit vào hệ thống HPLC. Tích phân diện tích pic hoặc chiều cao pic của all-trans-retinol, 13-cis-retinol và hiệu chỉnh nồng độ khối lượng của dung dịch chuẩn all-trans-retinol, nếu cần.

CHÚ THÍCH 2 Các chất chuẩn của all-trans-retinol mới được chuẩn bị (4.10.3) thường không chứa bất kỳ 13-cis-retinol hoặc các pic tạp nhiễu nào khác. Este của vitamin A (retinylpalmitat hoặc axetat) có thể chứa một lượng nhỏ 13-cis-retinol sau khi xà phòng hóa.

7.6. Xác định

Bơm các thể tích thích hợp (ví dụ 20 ml) của dung dịch chuẩn (4.10.3) và dung dịch thử (7.3.4) vào hệ thống HPLC (5.3). Tiến hành xác định bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic thu được đối với các dung dịch thử và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng đối với chất chuẩn có thời gian lưu tương tự, hoặc dựng đường chuẩn.

Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và các dung dịch chuẩn đã được chuẩn bị phù hợp với hệ thống HPLC, hoặc bù bằng hệ số tương ứng trong phép tính các kết quả (Điều 8). Kiểm tra độ tuyến tính của đường chuẩn.

CHÚ THÍCH Có thể sử dụng các quy trình nội chuẩn nếu các phép thử về độ thu hồi tương ứng được chứng minh phù hợp. Ngoài ra các hợp chất thích hợp khác có thể được bổ sung vào dung dịch thử trước khi bơm lên cột HPLC để định lượng [6]

7.7. Số lần xác định

Tiến hành ít nhất hai lần xác định độc lập.

...

...

...

Dựa vào phép tính theo đường chuẩn trên dải tuyến tính hoặc theo quy trình đã đơn giản hóa.

Tính nồng độ khối lượng của all-trans-retinol, r_all-trans, bằng miligam trên 100 g (mg/100 g), theo Công thức (4):

Trong đó:

A_s là diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với all-trans-retinol thu được trong dung dịch mẫu thử (7.3.4), tính bằng đơn vị diện tích hoặc đơn vị chiều cao;

C_all-T là nồng độ của all-trans-retinol đo được bằng detector UV (4.10.4) trong dung dịch chuẩn (7.4), tính bằng microgam trên mililit (ng/ml);

V_s là tổng thể tích của dung dịch mẫu thử (7.3.4), tính bằng mililit (ml);

V_st là thể tích bơm của dung dịch chuẩn (7.4), tính bằng microlit (ml);

100 là hệ số để tính nồng độ khối lượng trên 100 g;

...

...

...

m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V_is là thể tích bơm của dung dịch mẫu thử, tính bằng microlit (ml);

1 000 là hệ số chuyển đổi từ microgam sang miligam.

Tính nồng độ khối lượng của 13 cis-retinol, r_13-cis, bằng miligam trên 100 g (mg/100 g), theo Công thức (5):

Trong đó:

A_13-s là diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với 13-cis-retinol thu được bằng dung dịch mẫu thử (7.3.4), tính bằng các đơn vị diện tích hoặc chiều cao;

C_all-T là nồng độ của all-trans-retinol đo được bằng detector UV (4.10.4) trong dung dịch chuẩn (7.4), tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

V_s là tổng thể tích của dung dịch thử (7.3.4), tính bằng mililit (ml);

...

...

...

100 là hệ số để tính nồng độ khối lượng trên 100 g;

A_all-T là diện tích hoặc chiều cao pic đối với tất cả các đồng phân trans-retinol thu được bằng dung dịch chuẩn (7.4), tính bằng đơn vị diện tích hoặc đơn vị chiều cao;

m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V_is là thể tích bơm của dung dịch mẫu thử (7.3.4), tính bằng microlit (ml);

1 000 là hệ số chuyển đổi từ microgam sang miligam;

F_R là hệ số đáp ứng của 13-cis-retinol đến all-trans-retinol được đánh giá bằng HPLC, dùng dung dịch chuẩn đã biết nồng độ, sử dụng Công thức 6:

Trong đó:

B_13cis là diện tích pic hoặc chiều cao pic thu được đối với dung dịch chuẩn 13-cis-retinol;

...

...

...

C_13cis là nồng độ khối lượng của dung dịch chuẩn 13-cis-retinol;

C_all-T là nồng độ khối lượng của dung dịch chuẩn all-trans-retinol.

9. Độ chụm

9.1. Yêu cầu chung

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu trong Phụ lục B.

9.2.Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

Các giá trị là:

Margarin

...

...

...

=729

mg/100g

r = 78,4

mg/100g

13-cis-retinol

= 39

mg/100g

r =8,4

...

...

...

Sữa bột

all-trans-retinol

=653

mg/100g

r =39,2

mg/100g

13-cis-retinol

= 30

...

...

...

r =4,2

mg/100g

9.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống nhau, do hai phòng thử nghiệm thực hiện, không quá 5% các trường hợp lớn giới hạn tái lập R.

Các giá trị là:

...

...

...

Margarin

all-trans-retinol

=729

mg/100g

R = 204,4

mg/100g

13-cis-retinol

= 39

...

...

...

R = 33,6

mg/100g

Sữa bột

all-trans-retinol

=653

mg/100g

R = 61,6

mg/100g

...

...

...

= 30

mg/100g

R =20,2

mg/100g

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử đã sử dụng;

- các kết quả và các đơn vị biểu thị kết quả;

...

...

...

- ngày nhận mẫu:

- ngày thử nghiệm;

- các điểm đặc biệt quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

- mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

PHỤ LỤC A

(tham khảo)

CÁC VÍ DỤ VỀ SẮC ĐỒ HPLC

...

...

...

Thời gian;

Cột:

Merck LiChrosorb^®Si 60 (5 mm);

Kích thước cột:

250 mm X 4 mm;

Pha động

n-hexan + n-butanol (98 + 2) (thể tích);

Tốc độ dòng:

2 ml/min;

...

...

...

Huỳnh quang, bước sóng kích thích: 325 nm, bước sóng phát xạ: 475 nm.

Hình A.1 - Sắc đồ HPLC của các chất chuẩn vitamin A (a), vitamin A trong margarin (b) và sữa bột (c)

PHỤ LỤC B

(tham khảo)

DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

Hướng dẫn phù hợp với các nghiên cứu chứng nhận EU MAT, các thông số cho trong Bảng B.1 đã được xác định trong một phép thử liên phòng thử nghiệm [3]. Nghiên cứu này do Viện nghiên cứu thực phẩm, Norwich, Vương quốc Anh tổ chức.

Bảng B.1 - Kết quả thử liên phòng thử nghiệm

Mẫu

...

...

...

(CRM 122)*

Bột sữa

(CRM 421)*

All-trans-retinol

13-cis-retinol

All-trans-retinol

13-cis-retinol

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1994

...

...

...

1994

1994

Số lượng phòng thử nghiệm

9

5

8

5

Số lượng mẫu

2

...

...

...

2

2

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

9

5

6

5

Số lượng các phòng thử nghiệm ngoại lệ

0

...

...

...

2

0

Số lượng các kết quả được chấp nhận

45

25

40

21

Giá trị trung bình, , mg/100 g

729

...

...

...

653

30

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r mg/100 g

28

3

14

1,5

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r %

3,8

...

...

...

2,1

5.0

Giới hạn lặp lại, r, mg /100 g

78,4

8,4

39,2

4,2

Độ lệch chuẩn tái lập. s_R, mg /100 g

73

...

...

...

22

7,2

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

10,0

30,8

3,4

24,0

Giới hạn tái lập, R, mg /100 g

204,4

...

...

...

61,6

20,2

* CRM= chất chuẩn đã được chứng nhận.

PHỤ LỤC C

(tham khảo)

HỆ THỐNG HPLC THAY THẾ

Việc tách, định lượng all-trans-retinol và 13-cis-retinol cho thấy thỏa mãn nếu sử dụng [3] các điều kiện sắc ký trong Bảng C.1 dưới đây:

Bảng C.1 - Các điều kiện sắc ký

...

...

...

Kích thước

(dài X đường kính)

Pha động (V+V)

Phát hiện (l/nm)

LiChrospher^®Si 60 (5 mm)

250 mm X 4 mm

n-hexan + 2propanol (98 + 2)

F (325/480)

LiChrospher^®Si 60 (5 mm)

...

...

...

n-hexan + n-butanol (98 + 2)

F (325/475)

LiChrosorb^®Si 60 (5 mm)

250 mm X 4 mm

lso-propanol: n-heptan, gradient: từ (0,5 + 99,5) đến (8,5 + 91,5) trong 12 min

UV 325

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bourgeois, C.F. and Ciba, N., 1988. Disposal cartridge extraction of retinol and alpha-tocopherol from fatty samples. J.A.0.A.C 71 (I), 12-15.

...

...

...

[3] Finglas, P.M., van den Berg, H. & de Froidmont-Gortz, I., 1997. The certification of the mass fractions of vitamins in three reference materials: margarine (CRM 122), milk powder (CRM 421), and lyophilized Brussels sprouts (CRM 431). EUR-Report 18039, Commission of the European Union, Luxembourg.

[4] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Vitamin A in diätetischen Lebensmitteln L 49.00-3, Mai 1985 (Food Analysis: Determination of vitamin A in dietetic foodstuffs L 49.00-3, 1985-05) in: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Q 35 LMBG: Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen/Bundesgesundheitsamt

(In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco Products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office) Loseblattausgabe, Stand Februar 1996 Bd. I (Loose leaf edition, as of 1996-02 Vol. i.) Berlin, Köln: Beuth Verlag GmbH.

[5] Takashima, Y. et al., 1979. Stability of retinol analogs. Chern. Pharm. Bull. 27,1553.

[6] Bolliger, M.R. et al., 1977. The monograph of vitamin A in the European Pharmacopoeia. Pharm. Acta. Helv. 52 (8), 161-174.

[7] Arens, M. and Gertz, Chr., 1996. Gehaltsbestimmung von Vitamin A-Standardsubstanzen - Deutsche Einheitsmethoden zur Untersuchung von Fetten, Fettprodukten, Tensiden und verwandten Stoffen, 124. Mitt.; (Determination of vitamin A content in Standard substances - German methods for analysis of fats, fat products, tensids and related products, 124. ann) Fett/Lipid, VCH Verlag. Weinheim, 98, Nr. 5, S. 185-187.

1) LiChrospher^® Si 60, LiChrosorb^® Si 60 và Extrelut^® là các ví dụ về các sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng.