Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7606:2007 Thực phẩm - phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen - Tách chiết

• Số hiệu: TCVN7606:2007
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2007

Các loại chất nền đã được phân tích thành công	Vi sinh vật	Tài liệu tham khảo
Xúc xích lên men	Lactobacillus curvatus	[6]
Xúc xích mùa hè (được xử lý nhiệt)	Lactobacillus curvatus	[7]
Váng sữa	Staphylococcus aureus	[8]

A.1.2.9. Tính hiệu lực

Các số liệu xác nhận hiệu lực ở Bảng A.2 đã được xây dựng trong nghiên cứu cộng tác của nhóm công tác “Xây dựng các phương pháp để nhận biết thực phẩm được chế biến bằng kỹ thuật công nghệ gen” của Uỷ ban German Federal Health Board về ứng dụng các phương pháp theo Điều khoản 35 của Luật Thực phẩm của Đức [6].

Trong nghiên cứu cộng tác này, có hai mẫu dương tính giả, có khả năng do bao gói sai. Trong nghiên cứu này không sử dụng mutanolysin.

Bảng A.2 - Số liệu có hiệu lực

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

Số lượng mẫu xúc xích/một phòng thử nghiệm

Số lượng mẫu tổng số

Số lượng mẫu được nhận dạng đúng

15

...

...

...

150

148 (các mẫu kiểm chứng và mẫu biến đổi gen)

A.1.3. Phương pháp chiết bằng phenol/clorofom: Quy trình đối với việc cấy khởi động sữa chua

A.1.3.1. Khái quát

Phương pháp này mô tả quy trình chiết ADN từ nuôi cấy khởi động được dùng để lên men sản phẩm sữa chua. Quy trình này thực hiện thành công với sữa chua thường, sữa chua có chứa các thành phần khác nhau như thịt quả, các chất phụ gia và các chất ổn định và các sản phẩm khác có hàm lượng chất béo khác nhau (xem A.1.3.8 và [9], [10], [11]). ADN có chất lượng dùng cho phản ứng PCR cũng được chiết ra khỏi sữa chua đã được xử lý nhiệt ^[12].

A.1.3.2. Tình trạng hiệu lực

Phương pháp này đã được đánh giá hiệu lực qua một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm, xem A.1.3.9.

A.1.3.3. Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên quy trình tách chiết phenol/clorofom và được điều chỉnh cho phù hợp với các chất nền thực phẩm cụ thể. Các gốc Gram dương của sữa chua thu được sau khi hòa tan casein đông tụ ở pH kiềm. Các tế bào thu được được hòa lại vào trong dung dịch đệm và được xử lý bằng lysozym (và mutanolysin) để phá vỡ thành tế bào. Việc phân hủy tế bào được thực hiện bằng cách bổ sung chất tẩy rửa như natri dodexyl sunfat (SDS). Protein được loại ra bằng cách xử lý proteinaza-K và các bước tiếp theo là xử lý bằng phenol/clorofom và clorofom. ADN cuối cùng được kết tủa với ancol.

...

...

...

Cần có tủ hút để xử lý các chất hữu cơ.

A.1.3.5. Thuốc thử

A.1.3.5.1. Isopropanol [CH₃CH(OH)CH₃].

A.1.3.5.2. Etanol, f(C₂H₅OH) = 96 %.

Bảo quản và sử dụng ở - 20 ^0C.

A.1.3.5.3. Axit axetic băng, (CH₃COOH).

A.1.3.5.4. Natri clorua (NaCl).

A.1.3.5.5. Natri xitrat (C₆H₅Na₃O₇).

A.1.3.5.6. Axit clohydric, f(HCl) = 37 %.

...

...

...

A.1.3.5.8. Isoamyl ancol [(CH₃)₂CHCH₂CH₂OH].

A.1.3.5.9. Phenol (C₆H₅OH).

A.1.3.5.10. Clorofom (CHCl₃).

A.1.3.5.11. Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C₄H₁₁NO₃).

A.1.3.5.12. Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na₂EDTA)(C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂).

A.1.3.5.13. Natri dodexyl sunfat (SDS)(C₁₂H₂₅O₄SNa).

A.1.3.5.14. Lysozym, 50 000 U/mg protein (1 U sẽ tạo ra một ΔA₄₅₀ của 0,001/min ở pH 6,24 và 25 ^0C, sử dụng huyền phù Micrococcus lysodeikticus làm chất nền, trong 2,6 ml hỗn hợp phản ứng sử dụng 1 cm đường quang).

A.1.3.5.15. Sacaroza (C₁₂H₂₂O₁₁).

A.1.3.5.16. Proteinaza-K, khoảng 20 đơn vị/mg lyophilisat.

...

...

...

A.1.3.5.18. Dung dịch natri xitrat, r(C₆H₅Na₃O₇) = 400 g/l.

A.1.3.5.19. Dung dịch natri hydroxit r(NaOH) = 0,4 mol/l.

Hòa tan trong nước vô trùng, nhưng không hấp áp lực. Chuẩn bị mới ngay trước khi sử dụng.

A.1.3.5.20. Dung dịch natri clorua/natri xytrat (SSC, nồng độ 5 x), c(NaCl) = 0,75 mol/l, c(C₆H₅Na₃O₇) = 0,075 mol/l.

Nên chuẩn bị dung dịch SSC làm dung dịch gốc đậm đặc (ví dụ, SSC 20x), vì các dung dịch có nồng độ muối cao thường ổn định hơn. Pha loãng trước khi sử dụng.

A.1.3.5.21. Phenol đã cân bằng, được chỉnh đến pH bằng 8, đã bão hòa với dung dịch đệm Tris/HCl (pH>7,8), hoặc được chuẩn bị theo [5], hoặc theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

A.1.3.5.22. Clorofom-isoamyl ancol

Trộn 24 phần thể tích clorofom (A.1.3.5.10) với 1 phần thể tích isoamyl ancol (A.1.3.5.8).

A.1.3.5.23. Phenol-clorofom-isoamyl ancol

...

...

...

A.1.3.5.24. Dung dịch mutanolysin, chứa 500 U/ml hoặc 5 000 U/ml mutanolysin, được hòa tan trong nước vô trùng.

Không hấp áp lực. Bảo quản ở -20 ^0C, tránh lặp lại việc cấp đông và rã đông.

A.1.3.5.25. Dung dịch lysozym, chứa 10 mg/ml, được hòa tan trong nước vô trùng.

Không hấp áp lực. Bảo quản ở -20 ^0C, tránh cấp đông và rã đông.

A.1.3.5.26. Dung dịch sacaroza, r(C12H22O11) = 400 g/l.

A.1.3.5.27. Dung dịch đệm A, c(Tris) = 0,020 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,020 mol/l, c(NaCl) = 0,100 mol/l.

Dùng HCl hoặc NaOH để chỉnh pH đến 8,0.

A.1.3.5.28. Dung dịch đệm chiết/phân huỷ, chứa một phần thể tích dung dịch đệm A (A.1.3.5.27) và một phần dung dịch sacaroza (A.1.3.5.26).

A.1.3.5.29. Dung dịch SDS, r(SDS) = 250 g/l.

...

...

...

A.1.3.5.31. Dung dịch etanol, f (C₂H₅OH) = 70 %.

Bảo quản và sử dụng ở -20 ^0C.

A.1.3.5.32. Dung dịch natri axetat, c(C₂H₃O₂Na) = 3 mol/l.

Dùng axit axetic băng để chỉnh pH đến 5,2.

A.1.3.5.33. Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,010 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l.

Dùng HCl hoặc NaOH để chỉnh pH đến 8,0.

A.1.3.6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

A.1.3.6.1. Máy ly tâm, có thể tạo được lực ly tâm ở 12 000 g. Trong một số giai đoạn cần đến ly tâm lạnh.

...

...

...

A.1.3.6.3. Máy sấy chân không (tùy chọn).

A.1.3.6.4. Máy trộn, ví dụ: Vortex ^â^2).

A.1.3.7. Cách tiến hành

A.1.3.7.1. Khái quát

Khi phần mẫu thử đã được chuẩn bị thì tiến hành quy trình tách chiết/tinh sạch ADN. Cần điều chỉnh cho thích hợp giữa khối lượng và thể tích dung dịch đệm tùy theo cỡ mẫu đã chọn.

A.1.3.7.2. Chuẩn bị mẫu

Lắc kỹ sữa chua. Chuyển 250 ml sữa chua vào bình phản ứng 2 ml. Thêm 80 ml dung dịch natri xitrat (A.1.3.5.18). Thêm 150 dung dịch NaOH (A.1.3.5.19) và trộn kỹ. Ly tâm 2 min ở 12 000 g.

Đường kính của khối kết tủa không được lớn hơn 0,7 cm và khoảng 100 ml thể tích. Nếu không, cần lặp lại các bước này (cho thêm 80 ml dung dịch natri xitrat và 150 ml NaOH).

Loại bỏ lớp chất béo phía trên và phần dịch lỏng phía trên rồi hòa lại khối kết tủa này trong khoảng 500 ml dung dịch SSC 20x (A.1.3.5.20). Ly tâm ít nhất 2 min ở 12 000 g và loại bỏ phần nổi phía trên. Hòa lại khối kết tủa này trong 500 ml dung dịch SSC 5x. Ly tâm tiếp 2 phút ở 12 000 g và loại bỏ phần nổi phía trên.

...

...

...

Cho thêm 25 ml dung dịch SDS (A.1.3.5.29) và 25 ml dung dịch proteinaza-K (A.1.3.5.30). Ủ trong 10 min ở 60 ^0C. Thêm 500 ml phenol-clorofom-isoamyl ancol (A.1.3.5.23) và trộn. Ly tâm 3 min ở khoảng 12 000 g. Chuyển phần nổi phía trên sang bình phản ứng mới. Thêm 1 thể tích clorofom/isoamyl ancol (A.1.3.5.22) và trộn. Ly tâm 3 phút ở khoảng 12 000 g.

Chuyển pha nổi phía trên sang bình phản ứng mới. Thêm 0,1 thể tích dung dịch natri axetat (A.1.3.5.32) và 1 phần thể tích isopropanol (A.1.3.5.1). Giữ ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 min. Ly tâm 15 min ở khoảng 12 000 g. Loại bỏ phần nổi phía trên. Rửa các chất kết tủa cẩn thận bằng ít nhất 500 ml dung dịch etanol (A.1.3.5.31). Ly tâm trong 10 min ở khoảng 12 000 g. Bước này là cơ bản để loại bỏ các muối kết tủa có thể gây cản trở cho bước phân tích tiếp theo (ví dụ, PCR). Gạn bỏ phần nổi phía trên.

Làm khô các chất kết tủa này và hòa tan lại vào 100 ml nước hoặc dung dịch đệm thích hợp, ví dụ: dung dịch đệm TE (A.1.3.5.33). Đây là “ADN gốc chính”.

A.1.3.8. Danh mục các ví dụ

Xem Bảng A.3.

Bảng A.3 - Danh mục các loại chất nền đã áp dụng thành công phương pháp

Các chất đã được phân tích thành công

Hàm lượng, chất phụ gia…

Vi sinh vật

...

...

...

Sữa chua thường

0,3 % chất béo, 3,5 % chất béo

Steptococcus thermophilus

[9], [11]

Sữa chua hoa quả

1,5 % chất béo, tinh bột biến tính, quả phỉ, gelatin

1,5 % chất béo, 3,8 % protein, aspartam, axesulfam, dứa

3,5 % chất béo, hương liệu, gelatin, đào, dừa

10 % chất béo, tinh bột biến tính, chanh, hương liệu, quả hạnh, pectin, carotin, riboflavin

...

...

...

[9]

Sữa chua thường đã xử lý nhiệt

3,5 % chất béo

Steptococcus thermophilus

[12]

A.1.3.9. Tính hiệu lực

Các số liệu xác nhận hiệu lực ở Bảng A.4 đã được xây dựng trong nghiên cứu cộng tác của nhóm công tác “Xây dựng các phương pháp để nhận biết thực phẩm được chế biến bằng kỹ thuật công nghệ gen” của Ủy ban German Federal Health Board về ứng dụng các phương pháp theo Điều khoản 35 của Luật Thực phẩm của Đức [6].

Trong nghiên cứu cộng tác này, có hai phòng thử nghiệm không tiến hành thẩm tra bằng phép lai. Trong nghiên cứu này không sử dụng mutanolysin.

Bảng A.4 - Số liệu có hiệu lực

...

...

...

Số lượng mẫu sữa chua/một phòng thử nghiệm

Số lượng mẫu tổng số

Số lượng mẫu được nhận dạng đúng

20

10

200

200 (99 mẫu kiểm soát và 101 mẫu biến đổi gen)

A.1.4. Phương pháp chiết bằng phenol/clorofom: Quy trình đối với nấm men và/hoặc nấm sợi thu được từ thực phẩm

A.1.4.1. Khái quát

...

...

...

CHÚ THÍCH: Việc tách phần vi khuẩn ra khỏi phần mẫu thử cho các kết quả đáng tin cậy nhất, nếu điều này được thực hiện trước khi chiết ADN.

ADN tổng số từ chất nền có thể được chiết theo quy trình trong Phụ lục A. Tuy nhiên, các quy trình này không đảm bảo rằng ADN từ tất cả các vi sinh vật (đặc biệt từ nấm khó phân huỷ, hoặc vi khuẩn Gram âm) có thể được phân lập ngẫu nhiên với lượng đáng tin cậy. Mặc dù quy trình hiện hành có thể được sử dụng để chiết ADN tổng số có trong các loại chất nền như sữa chua, sữa hoặc phomat. Hiệu quả của việc tách chiết cho thấy đáng tin cậy chỉ đối với các loại chất nền dạng rắn đã nghiền hoặc đã xay nhỏ và luôn phải kiểm tra trên chất nền chính.

A.1.4.2. Tình trạng hiệu lực

Phương pháp tách chiết ADN này đã được áp dụng và đánh giá có hiệu lực [13] cho 325 loài đại diện cho 25 chi nấm (bao gồm nấm men dùng cho việc sản xuất bánh hoặc sản xuất rượu, và Penicilla spp. [16] được sử dụng cho pho mát xanh). Dưới dạng sợi nấm hoặc bào tử (trong số đó nhiều nhất là các loài không liên kết sợi hoặc khó phân huỷ như Aspergillus fumigatus và Cryptococcus neoformans. Phương pháp đã được thiết kế để tránh nhiễm giữa các mẫu kiểm tra và phòng thử nghiệm làm cho nó thích hợp cho việc tách chiết ADN thường xuyên với lượng lớn và áp dụng PCR. Không quan sát thấy có sự biến động về chất lượng làm khuôn trong PCR định tính, sau thời gian bảo quản dài đến 5 năm ở - 20 ^0C, và giữa các lần chuẩn bị ADN khác nhau từ cùng một vi sinh vật. Mặc dù chất lượng ADN là thích hợp cho PCR định tính, nhưng nó có thể không thích hợp cho một số enzym giới hạn. Đối với các mục đích như dùng cho PCR định lượng, thì ADN thu được bằng phương pháp hiện hành phải được tinh sạch tiếp bằng cách sử dụng các nguyên tắc sinh hóa khác như được mô tả trong A.4.

Phương pháp này được áp dụng cho các khối vi khuẩn hoặc sợi nấm đã được gửi đến để đánh giá bằng liên phòng thử nghiệm [17].

A.1.4.3. Nguyên tắc

Về cơ bản, các vi khuẩn, nấm men hoặc nấm sợi bị phá vỡ và ADN được tách chiết đồng thời bằng cách nghiền trong hỗn hợp Tris-phenol-clorofom-EDTA-SDS với tốc độ cao trong sự có mặt của các hạt thủy tinh, tiếp theo được kết tủa với etanol.

A.1.4.4. Yêu cầu về an toàn

Cần có tủ hút để xử lý các chất hữu cơ.

...

...

...

A.1.4.5.1. Etanol, f(C₂H₅OH) = 96 %.

Bảo quản và sử dụng ở -20 ^0C.

A.1.4.5.2. Axit axetic băng, (CH₃COOH).

A.1.4.5.3. Axit sunfuric, f(H₂SO₄) > 90 %.

A.1.4.5.4. Kali bicacbonat (KHCO₃).

A.1.4.5.5. Kali axetat (C₂H₃O₂K).

A.1.4.5.6. Axit clohydric, f(HCl) = 37 %.

A.1.4.5.7. Isoamyl ancol [(CH₃)₂CHCH₂CH₂OH].

A.1.4.5.8. Phenol (C₆H₅OH).

...

...

...

A.1.4.5.10. Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C₄H₁₁NO₃).

A.1.4.5.11. Muối dikali axit etylendiamintetraaxetic (K₂EDTA)(C₁₀H₁₄N₂O₈K₂).

A.1.4.5.12. Kali hydroxit (KOH).

A.1.4.5.13. Natri dodexyl sunfat (SDS)(C₁₂H₂₅O₄SNa).

A.1.4.5.14. RNaza-A, không chứa ADNaza từ tuyến tuỵ của bò, khoảng 50 đơn vị/mg lyophilisat.

A.1.4.5.15. Phenol cân bằng, chỉnh đến pH> 7,8.

Phenol (A.1.4.5.8) được chuẩn bị, ví dụ: xem [5] và (tùy chọn) cuối cùng được cân bằng dựa vào dung dịch đệm tách chiết (A.1.4.5.18) không có SDS, hoặc theo các khuyến cáo của nhà sản xuất.

A.1.4.5.16. Clorofom-isoamyl ancol

Trộn 24 phần thể tích clorofom (A.1.4.5.9) với 1 phần thể tích isoamyl ancol (A.1.4.5.7).

...

...

...

Trộn 1 phần thể tích phenol đã cân bằng (A.1.4.5.15) với 1 phần thể tích dung dịch phenol-clorofom- isoamyl (A.1.4.5.16).

A.1.4.5.18. Dung dịch đệm tách chiết/phân giải, c(Tris) = 0,050 mol/l, c(K2EDTA) = 0,050 mol/l, r(SDS) = 30 g/l.

Dùng HCl hoặc KOH để chỉnh pH đến 8,0.

A.1.4.5.19. Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,010 mol/l, c(K₂EDTA) = 0,001 mol/l.

Dùng HCl hoặc KOH để chỉnh pH đến 8,0.

A.1.4.5.20. Dung dịch RNaza-A, r(RNaza-A) = 10 mg/ml lyophylisat.

Bảo quản ở -20 ^0C.

A.1.4.5.21. Dung dịch etanol, r(C₂H₅OH) = 70 %.

Bảo quản và sử dụng ở -20 ^0C.

...

...

...

Dùng axit axetic băng để chỉnh pH đến 5,2. Không hấp áp lực. Lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,22 mm, nếu cần.

A.1.4.5.23. Hạt thủy tinh đã ổn định

Ủ các hạt thủy tinh có đường kính từ 0,2 mm đến 0,5 mm qua đêm trong H₂SO₄ đậm đặc (A.1.4.5.3). Rửa sạch bằng nước đã tiệt trùng, đun sôi trong dung dịch KHCO₃ (A.1.4.5.24), rửa lại bằng nước tiệt trùng, sấy khô bằng chân không ở 80 ^0C [13], [14].

A.1.4.5.24. Dung dịch kali bicacbonat, r(KHCO₃) = 50 g/l.

Chuẩn bị mới trước khi sử dụng.

A.1.4.6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

A.1.4.6.1. Dụng cụ khuấy trộn tế bào, đối với ống nghiệm micro polyetylen có nắp vặn dung tích 2 ml, có tần số khuấy trộn ít nhất 100 lần khuấy/phút [ví dụ, Mini-Beater ^TM ^4)].

A.1.4.6.2. Ống nghiệm micro, 2 ml bằng polyetylen, được xiết chặt vào vòng O, có nắp vặn.

...

...

...

A.1.4.6.4. Máy ly tâm, có thể giữ được ống nghiệm micro 2 ml ở lực ly tâm tối thiểu 10 000 g. Trong một số giai đoạn cần đến ly tâm lạnh.

A.1.4.6.5. Nồi cách thủy hoặc tủ ấm.

A.1.4.6.6. Máy sấy chân không (tùy chọn). Được khuyến cáo dùng cho A.1.4.5.23.

A.1.4.6.7. Máy trộn, ví dụ: Vortex ^â^2).

A.1.4.7. Cách tiến hành

A.1.4.7.1. Chuẩn bị mẫu thử và vi khuẩn

Các quy trình phân lập vi khuẩn, đôi khi được gắn liền với giai đoạn tăng sinh trên thạch hoặc trong môi trường lỏng để kiểm soát chất lượng vi sinh vật trong thực phẩm, có thể được sử dụng để chiết ADN ra khỏi quần thể vi sinh.

Bắt đầu từ 1 ml đến 2 ml mẫu phòng thử nghiệm là phần chuẩn, quần thể vi sinh được phân lập một cách thích hợp (xem A.1.3). Cách khác, nấm men hoặc nấm sợi được phân lập từ mẫu thử có thể sinh trưởng như một mẫu khởi động. Trong cả hai trường hợp, các vi sinh vật thu được và được xử lý tiếp theo A.1.4.7.2 hoặc được bảo quản ở -20 ^0C cho đến khi tiến hành thử nghiệm.

A.1.4.7.2. Tách chiết ADN

...

...

...

A.1.4.7.2.2. Đối với các khối tổng thể quần thể vi sinh, vi khuẩn, sợi nấm, nấm men hoặc các vi sinh vật giống nấm men, thì rửa các tế bào một lần bằng 1 ml dung dịch đệm phân huỷ (A.1.4.5.18) không chứa SDS, ly tâm ở 10 000 g đến 13 000 g trong 10 phút, lặp lại ít nhất một lần rồi hòa lại vào 600 ml dung dịch đệm phân hủy (A.1.4.5.18) và chuyển sang ống nghiệm micro có chứa các hạt thủy tinh và phenol-clorofom như trong A.1.4.7.2.1.

A.1.4.7.2.3. Sau bước A.1.4.7.2.1 hoặc A.1.4.7.2.2, khuấy trộn ống nghiệm micro ít nhất 100 lần/phút trên bộ khuấy tế bào (A.1.4.6.1) từ 1 min đến 2 min, rồi ủ ngay ở 65 ^0C từ 30 min đến 120 min. Ly tâm ở 10 000 g đến 13 000 g trong 10 min. Chuyển phần nổi phía trên sang ống nghiệm micro mới.

Tùy chọn đối với các phản ứng PCR định lượng tiếp theo, ủ 30 min rồi ly tâm ở 10 000 g đến 13 000 g trong 15 min. Chuyển phần nổi phía trên sang ống nghiệm micro, bổ sung RNaza-A (A.1.4.5.20) ở nồng độ cuối cùng là 0,001 mg/ml và ủ tiếp 30 min đến 90 min ở 65 ^0C.

Cho dung dịch kali axetat (A.1.4.5.22) ở nồng độ cuối cùng 0,3 mol/l. Trộn, bổ sung 1,2 ml etanol (A.1.4.5.1) và ủ ở -20 ^0C qua đêm hoặc ủ trong 1 h ở -80 ^0C. Ly tâm kết tủa ADN ở 10 000 g đến 13 000 g trong 15 min ở 4 ^0C.

Rửa kỹ kết tủa ADN bằng dung dịch etanol (A.1.4.5.21). Làm ráo nước ống nghiệm úp trên giấy và làm khô ống nghiệm bằng hút chân không. Hòa tan kết tủa ADN trong 50 ml đến 100 ml nước. Cho phép bảo quản lâu dài (đến 5 năm) ở nhiệt độ -20 ^0C. Việc sử dụng nước cất thay cho dung dịch đệm TE (A.1.4.5.19) đã được xác nhận có hiệu quả [13]. Đây là dung dịch ADN gốc chính.

A.1.4.8. Danh mục các ví dụ

Số lượng các loài/chủng đã nghiên cứu được chỉ ra trong dấu ngoặc đơn:

Absidia corymbifera (1), Acremonium spp. (2), Aspergillus spp. (119), Cladosporium spp. (2), Cryptococcus spp. (6), Epidermophyton floccosum (1), Fusarium (1), Fusarium solani (1), malbranchea pulchella (1), Geotrichum spp. (2), Microsporum canis (1), paecilomyces spp. (2), Penicilium spp. (20), Pityrosporum ovale (1), Rhizopus spp. (2), Saccharomyces cerevisiae (1), Schizosaccharomyces pombe (1), Scopulariopsis brevicaulis (1), Trichoderma spp. (124), Trichosporon spp. (2), Ulocladium botrytis (1), Verticillim tenerum (1).

A.1.4.9. Xác nhận tính hiệu lực

...

...

...

A.2. Chuẩn bị ADN đạt chất lượng dùng cho phản ứng PCR sử dụng các phương pháp tách chiết ADN dựa trên polyvinyl-pyrrolidon (PVP)

A.2.1. Phương pháp dựa trên PVP A.2.1.1 Khái quát

Phương pháp này đơn giản, nhanh và rẻ [19] thích hợp đối với nhiều loại chất nền, đặc biệt là có chứa các hợp chất polyphenol với hàm lượng cao.

A.2.1.2. Tình trạng hiệu lực

Phương pháp này đã được đánh giá có hiệu lực trong nhóm và được sử dụng để chuẩn bị ADN thông thường trong nhiều phòng thử nghiệm, cho dù nó chưa được đánh giá trong các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm chính thức.

A.2.1.3. Nguyên tắc

Phương pháp này bao gồm bước phân giải (phân giải bằng nhiệt với sự có mặt của natri dodexyl sunfat và EDTA hàm lượng cao), tiếp theo là bước loại bỏ các tạp chất như các phân tử polyphenol, polysacarit, các chất trao đổi và các protein hòa tan ra khỏi pha lỏng chứa ADN bằng việc kết hợp với PVP và amoni axetat. Bước kết tủa bằng ancol cuối cùng để thu lấy ADN và loại bỏ các muối xem [19], [20], [21], [22] và [23].

A.2.1.4. Các yêu cầu về an toàn

Cần có tủ hút để xử lý các chất hữu cơ.

...

...

...

A.2.1.5.1. Etanol, f (C₂H₅OH) = 96 %.

Bảo quản và sử dụng ở -20 ^0C.

A.2.1.5.2. Isopropanol [CH₃CH(OH)CH₃].

A.2.1.5.3. Polyvinylpyrrolidon (PVP), khối lượng phân tử M = 360 000 D, độ nhớt bản chất (giá trị K) = 80 đến 100 5).

A.2.1.5.4. Axit axetic băng, (CH₃COOH).

A.2.1.5.5. Axit clohydric, f (HCl) = 37 %.

A.2.1.5.6. Natri clorua (NaCl).

A.2.1.5.7. Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C₄H₁₁NO₃).

A.2.1.5.8. Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na₂EDTA).

...

...

...

A.2.1.5.10. Amoni axetat (C₂H₃O₂NH4).

A.2.1.5.11. Dung dịch etanol, f (C₂H₅OH) = 70 %.

Bảo quản và sử dụng ở -20 ^0C.

A.2.1.5.12. Dung dịch đệm chiết, pH 8,0, c(Tris) = 0,2 mol/l, c(NaCl) = 0,250 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,025 mol/l, r(SDS) = 50 g/l.

Dùng HCl hoặc KOH để chỉnh pH đến 8,0.

A.2.1.5.13. Dung dịch amoni axetat, c(NH₄C₂H₃O₂) = 7,5 mol/l.

Hòa tan trong nước vô trùng và khử trùng bằng lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,22 mm.

A.2.1.5.14. Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,010 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l.

Dùng HCl hoặc NaOH để chỉnh pH đến 8,0.

...

...

...

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

A.1.2.6.1. Máy ly tâm, có khả năng tạo được lực ly tâm ở 10 000 g.

Trong một số giai đoạn cần đến ly tâm lạnh.

A.2.1.6.2. Nồi cách thủy hoặc tủ ấm.

A.2.1.6.3. Máy sấy chân không (tùy chọn).

A.2.1.6.4. Máy sấy đông khô, tùy chọn.

A.2.1.6.5. Máy trộn, ví dụ như Vortex ^â^2).

A.2.1.7. Cách tiến hành

A.2.1.7.1. Khái quát

...

...

...

A.2.1.7.2. Quy trình chiết

Cân 0,25 mg mẫu đã xay, nghiền thô hoặc mẫu dạng lỏng cho vào lọ. Thêm 1 ml dung dịch đệm chiết (A.2.1.5.12). Khuấy huyền phù 1 h ở 65 ^0C, làm nguội đến nhiệt độ phòng. Trộn huyền phù tiếp với 60 mg bột PVP (A.2.1.5.3) và 0,5 thể tích dung dịch amoni axetat (A.2.1.5.13). Để trên nước đá 30 min.

Ly tâm ở 10 000 g trong 10 phút và chuyển phần nổi phía trên sang ống nghiệm mới. Trộn với 1 thể tích isopropanol (A.2.1.5.2) và để 30 min ở -20 ^0C. Ly tâm ở 10 000 g và trong 10 min ở 4 ^0C và cẩn thận gạn phần nổi phía trên.

Rửa kỹ các kết tủa ADN bằng 2 thể tích dung dịch etanol (A.2.1.5.11). Bước này là cần thiết để loại bỏ các loại muối bất kỳ nào mà có thể gây cản trở phép phân tích tiếp theo (ví dụ, PCR). Loại bỏ cẩn thận phần nổi phía trên (trong trường hợp các kết tủa phân tán thì ly tâm 10 min ở 10 000 g và ở 4 ^0C). Làm khô kết tủa này và hòa lại vào 100 ml nước hoặc dung dịch đệm thích hợp, ví dụ, dung dịch đệm TE (A.2.1.5.14). Đây là ADN gốc chính.

A.2.1.8. Danh mục các ví dụ

Phương pháp đã áp dụng thành công để chiết ADN từ các loại chất nền sau đây:

Bánh dùng cho trẻ nhỏ6), sữa dành cho trẻ nhỏ ^6), patê của Bỉ, bột xay từ bánh mì (lúa mì hoặc ngô) để tẩm cá thỏi, bánh socola hạnh nhân ^6), ngô đóng hộp, ngũ cốc đóng thành thỏi ^6), khoanh phomát, gà rán bọc bột, thịt gà, bánh socola ^6), socola nhão ^6), bánh ngô ^6), bánh giòn, kem phủ bánh ^6), thức ăn dành cho trẻ nhỏ, bánh qui ngô ^6), bột ngô, thịt tươi và thịt đã nấu chín (bò, lợn, gà, và gà tây), thịt xay, món điểm tâm ^6), bỏng ngô, sữa bột, xúc xích (thái lát ^6) và cocktail ^6)), bánh cốt-lết , giá đậu tương ^6), viên xúp, protein đậu tương trong chế biến thịt ^6), lexitin đậu tương ^6), đồ uống từ đậu tương ^6), váng sữa đậu tương, nước sốt spaghetti ^6), bánh speculoos, đậu phụ, hambơgơ thực vật, bánh xốp sôcôla ^6), bánh quế, sữa chua ^6).

A.3. Chuẩn bị ADN đạt chất lượng dùng cho phản ứng PCR sử dụng các phương pháp chiết ADN dựa trên CTAB

A.3.1. Phương pháp dựa trên CTAB

...

...

...

Phương pháp này có thể dùng để chiết ADN từ thực vật và các loại chất nền có nguồn gốc từ thực vật, đặc biệt do có khả năng loại bỏ các hợp chất polysacarit và polyphenol vốn có ảnh hưởng đến chất lượng ADN. Phương pháp này cũng có thể dùng cho các loại chất nền khác (A.3.1.8).

A.3.1.2. Tình trạng hiệu lực

Phương pháp này đã được thử nghiệm vòng (xem A.3.1.9).

Phương pháp này là thông dụng trong việc chuẩn bị ADN ở nhiều phòng thử nghiệm.

A.3.1.3. Nguyên tắc

Phương pháp này bao gồm bước phân giải (phân giải bằng nhiệt với sự có mặt của CTAB), tiếp theo là các bước loại bỏ các tạp chất như các polysacarit và các protein [24].

Đối với một vài loại chất nền, cần tiến hành một số bước có sự tham gia của enzym khác nhau như trong A.3.1.7. Alpha-amylaza được cho vào dung dịch đệm phân giải để thủy phân các tinh bột khi các chất nền chứa nhiều tinh bột. Việc xử lý mẫu bằng proteinaza-K là cần thiết đối với nhiều loại chất nền khác nhau để loại trừ protein. Việc xử lý bằng RNaza cũng được khuyến cáo đối với các loại chất nền khi việc kết tủa đồng thời ARN có thể làm nhiễu phép phân tích tiếp theo.

Nồng độ muối trong suốt quá trình tách chiết là rất quan trọng trong việc loại bỏ các tạp chất, vì sự kết tủa của axit CTAB-nucleic sẽ xảy ra nếu nồng độ muối hạ xuống thấp khoảng 0,5 mol/l ở nhiệt độ phòng và/hoặc nếu nhiệt độ giảm xuống dưới 16 ^0C. Bằng cách tăng nồng độ muối (ví dụ, bổ sung natri clorua) việc loại bỏ các protein đã biến tính và polysacarit được tạo phức với CTAB sẽ được thực hiện, lúc đó các axit nucleic sẽ được hòa tan. Clorofom được dùng để tách tiếp các axit nucleic ra khỏi CTAB và các hợp chất polysacarit/protein.

Cuối cùng, các axit nucleic được tinh sạch bằng kết tủa bởi isopropanol và rửa bằng etanol.

...

...

...

Xử lý các chất hữu cơ trong tủ hút.

A.3.1.5. Thuốc thử

A.3.1.5.1. a-Amylaza (tùy chọn), kiểu loại lla từ các loài thuộc Bacillus, từ 1 500 đơn vị/mg protein đến 3 000 đơn vị/mg protein.

A.3.1.5.2. Clorofom (CHCl₃).

A.3.1.5.3. Etanol, f(C₂H₅OH) = 96 %.

A.3.1.5.4. Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na₂EDTA)(C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂).

A.3.1.5.5. Hexadexyl-trimetyl-amoni-bromua (CTAB)(C₁₉H₄₂BrN).

A.3.1.5.6. Axit clohydric, f(HCl) = 37 %.

A.3.1.5.7.Isopropanol [CH₃CH(OH)CH₃].

...

...

...

A.3.1.5.9 RNaza-A, không chứa DNaza từ tuyến tuỵ của bò, khoảng 50 đơn vị/mg lyophilisat.

A.3.1.5.10. Natri clorua (NaCl).

A.3.1.5.11. Natri hydroxit (NaOH).

A.3.1.5.12. Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C₄H₁₁NO₃).

A.3.1.5.13. Dung dịch a-Amylaza (tùy chọn), c(a-Amylaza) = 10 mg/ml.

Không hấp áp lực. Bảo quản ở -20 ^0C, tránh lặp lại việc cấp đông và rã đông.

A.3.1.5.14. Dung dịch đệm chiết CTAB, r(CTAB) = 20 g/l, c(NaCl) = 1,4 mol/l, c(Tris) = 0,1 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,02 mol/l.

Dùng HCl hoặc NaOH để chỉnh pH đến 8,0.

A.3.1.5.15. Dung dịch đệm kết tủa CTAB, r(CTAB) = 5 g/l, c(NaCl) = 0,04 mol/l.

...

...

...

A.3.1.5.17. Dung dịch etanol, f (C₂H₅OH) = 70 %.

A.3.1.5.18. Dung dịch proteinaza-K (tùy chọn), r = 20 mg/ml, hòa tan được trong nước vô trùng.

Không hấp áp lực. Bảo quản ở -20 ^0C, tránh lặp lại việc cấp đông và rã đông.

A.3.1.5.19. Dung dịch RNaza-A (tùy chọn), r(RNaza-A) = 10 mg/ml.

Bảo quản trong dung dịch lỏng ở -20 ^0C.

A.3.1.5.20. Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,01 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l.

Dùng HCl hoặc NaOH để chỉnh pH đến 8,0.

A.3.1.6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

...

...

...

A.3.1.6.2. Máy ly tâm, có khả năng tạo được lực ly tâm ở 12 000 g.

Trong một số giai đoạn cần đến ly tâm lạnh.

A.3.1.6.3. Máy trộn, ví dụ như Vortex ^â^2).

A.3.1.6.4. Máy sấy chân không (tùy chọn).

A.3.1.7. Cách tiến hành

A.3.1.7.1. Khái quát

Khi phần mẫu thử đã được chuẩn bị thì tiến hành quy trình tách chiết/tinh sạch ADN. Cần điều chỉnh cho thích hợp giữa khối lượng và thể tích dung dịch đệm tùy theo cỡ mẫu đã chọn.

A.3.1.7.2. Chiết mẫu

Cân từ 200 mg đến 300 mg mẫu thử cho vào ống nghiệm.

...

...

...

Ly tâm 15 phút ở khoảng 12 000 g. Chuyển pha phía trên (pha lỏng) sang một ống nghiệm mới.

A.3.1.7.3. Kết tủa CTAB

Cho thêm 2 thể tích dung dịch đệm kết tủa (A.3.1.5.15). Để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 15 min ở khoảng 12 000 g. Gạn bỏ phần phía trên. Hòa tan ADN kết tủa bằng cách thêm 350 ml dung dịch NaCl (A.3.1.5.16). Thêm 350 ml dung dịch clorofom (A.3.1.5.2) và trộn kỹ. Ly tâm 10 phút ở khoảng 12 000 g. Chuyển pha lỏng sang một ống nghiệm mới.

CHÚ THÍCH: Việc kết tủa CTAB là không cần thiết đối với tất cả các loại chất nền, chỉ dùng đối với các loại chất nền giàu protein và giàu polysacarit. Việc tinh sạch pha rắn ADN (ví dụ, bằng cách sử dụng các cột quay) cũng có khả năng cho các kết quả tương đương.

A.3.1.7.4. Kết tủa ADN

Cho thêm 0,6 thể tích isopropanol (A.3.1.5.7), trộn kỹ bằng cách đảo chiều ống nghiệm và giữ trong 20 min ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 15 min ở 12 000 g. Gạn bỏ phần nổi phía trên. Cho thêm 500 ml dung dịch etanol (A.3.1.5.17) vào ống nghiệm và đảo chiều ống nghiệm vài lần. Đây là bước quyết định để đảm bảo loại bỏ hết CTAB. Ly tâm 10 min ở khoảng 12 000 g. Gạn bỏ phần nổi phía trên. Làm khô các kết tủa ADN và hòa tan lại vào 100 ml nước hoặc dung dịch đệm thích hợp, ví dụ, dung dịch đệm TE (A.3.1.5.20). Đây là ADN gốc chính.

A.3.1.8. Danh mục các ví dụ

Phương pháp này đã được áp dụng thành công để tách chiết ADN 7) từ các chất nền sau:

Thức ăn dành cho trẻ nhỏ (dạng bột), thức ăn cho trẻ nhỏ, hỗn hợp làm bánh, bánh qui, viên canh thịt ^7), kẹo ngọt và kẹo chanh, ngô hộp, váng sữa caramel ^7), thức ăn cho gia súc, hạt ngũ cốc (gạo, lúa mì, yến mạch, lúa mạch đen, kiều mạch, kê), socola thanh ^7), kem socola ^7), bánh qui socola ^7), bánh qui, bia ngô ^7), bánh bột ngô, váng kem làm món tráng miệng, dextrosa ^7), chất độn của kẹo hạt dẻ, bánh ngọt pastries, cá^7), thỏi cá ^7), bánh từ đậu tương, cá rán kiểu Pháp, nước thịt ^7), giăm bông nấu chín, mật ong ^7), đồ ăn liền, râu ngô, bột ngô, phôi ngô, thức ăn từ gluten ngô, bánh ngô, lá ngô, tinh bột ngô^7), dầu ngô (nguyên chất) ^7), protein ngô ^7), hạt ngô/ngũ cốc, lõi hạt ngô, margarin ^7), thịt tươi, sữa bột, sữa, thức ăn chăn nuôi hỗn hợp, món điểm tâm ^7), hạt đậu, lá cây mù tạc, bỏng ngô, khoai tây chiên, tinh bột khoai tây (nguyên chất), củ khoai tây, lá cây cải dầu, bánh từ cải dầu, dầu cải dầu (thô/ nguyên chất) ^7), hạt cải dầu, lexithin đậu tương thô ^7), món ăn nhanh, salami (hàm lượng chất béo cao), snack mặn (ngô), xúc xích, chất điều vị ^7), tinh bột biến tính (một số loại) ^7), váng sữa chua với hành ^7), bột đậu tương, phôi đỗ tương (đã được bảo quản, đông lạnh), protein đỗ tương ^7), đồ uống từ đậu tương ^7), hạt đậu tương/ngũ cốc, đậu phụ từ đậu tương, hạt đậu tương (đã axit hoá) ^7), lá củ cải đường, hạt củ cải đường, hạt hướng dương, surimi đậu tương ^7), ngô ngọt, món taco shells, món tarama (trứng cá nhão), thuốc lá, tương cà chua ^7), cà chua cô đặc ^7), cà chua (quả), bánh ngô chiên ^7), hambơgơ thực vật, bánh quế ^7), tinh bột mỳ (nguyên chất), sữa chua ^7).

...

...

...

Các số liệu có hiệu lực trong Bảng A.5 đã được xây dựng trong nghiên cứu cộng tác của nhóm công tác “Xây dựng các phương pháp để nhận biết thực phẩm được chế biến bằng kỹ thuật công nghệ gen” của Ủy ban German Federal Health Board về ứng dụng các phương pháp theo Điều khoản 35 của Luật Thực phẩm của Đức (xem [25], [26], [27]). Các loại chất nền đã được thử nghiệm là khoai tây, đậu tương và cà chua. Các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm này đã thực hiện trên mẫu thử 100 mg. Bước kết tủa CTAB là cần thiết để phân tích hạt đậu tương và bột đậu tương. Trong các nghiên cứu này không thực hiện các bước có sự tham gia của enzym.

Đối với nghiên cứu cộng tác trên hạt đậu tương, thì hai phòng thử nghiệm tham gia đã sử dụng các quy trình được cải biến nhiều và mỗi phòng thử nghiệm đã thử nghiệm năm mẫu không liên tục. Như vậy 22 trong số 25 phòng thử nghiệm tham gia đã nhận dạng đúng tất cả 110 mẫu.

Đối với mỗi nghiên cứu cộng tác trên khoai tây, thì ba mẫu đã được nhận dạng âm tính giả và một mẫu dương tính giả. Ba mẫu này không được đánh giá vì các kết quả không rõ ràng giữa hai lần lặp lại.

Bảng A.5 - Số liệu có hiệu lực

Chất nền

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

Số lượng mẫu/một phòng thử nghiệm

Số lượng mẫu tổng số

Số lượng mẫu được nhận dạng đúng

...

...

...

25

5

125

110

Khoai tây [26]

18

10

180

173

...

...

...

18

5

90

90

A.4. Chuẩn bị ADN đạt chất lượng dùng cho phản ứng PCR sử dụng các phương pháp tách chiết ADN dựa trên silica

A.4.1. Phương pháp tách chiết dựa trên silica

A.4.1.1. Khái quát

Phương pháp này thích hợp để chiết ADN từ các loại chất nền có phạm vi rộng (xem các ví dụ trong A.4.1.8). Phương pháp này cũng có thể được dùng như một bước tinh sạch ADN thu được sau khi AND được tách chiết bằng các phương pháp khác.

Phương pháp này đã được điều chỉnh cho thích hợp từ quy trình đã công bố [28]. Phương pháp này có một số ưu điểm đối với các loại chất nền mà nó thích hợp, đặc biệt là để tránh các thuốc thử có độc tính cao. Ngoài ra, quy trình này có thể thích hợp đối với các phép phân tích bằng tay cũng như phân tích tự động khi lượng mẫu đưa vào nhiều, đặc biệt do không có các lớp phân cách không bền (như nước- clorofom) và do đó cần ly tâm với tốc độ thấp.

...

...

...

A.4.1.2. Tình trạng hiệu lực

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong phòng thử nghiệm nội bộ và được sử dụng để chuẩn bị ADN thông thường trong nhiều phòng thử nghiệm, cho dù nó chưa được đánh giá trong các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm chính thức. Nguyên tắc của phương pháp này được ứng dụng trong các loại kit khác nhau, đã được thử nghiệm thành công (xem [29], [30] và [31]).

A.4.1.3. Nguyên tắc

Phương pháp này bao gồm bước phân giải (phân giả bằng nhiệt với sự có mặt của natri dodexyl sunfat trong dung dịch đệm), tiếp theo là bước làm sạch bằng resin silica trong sự có mặt của thuốc thử guanidin hydroclorua. Nguyên tắc của phương pháp là việc liên kết các axit nucleic với silica trong điều kiện hoạt độ nước thấp do hiệu ứng entropi [32]. Các tạp chất được rửa khỏi resin bằng isopropanol, trong khi ADN vẫn được giữ lại. Bước phân giải cuối cùng bằng dung dịch đệm muối thấp cho phép thu hồi ADN.

Người sử dụng tiêu chuẩn này cần biết rằng các phương pháp dựa trên silica có thể chịu luật bản quyền [33].

A.4.1.4. Yêu cầu về an toàn

Cần có tủ hút để xử lý các chất hữu cơ.

A.4.1.5. Thuốc thử

A.4.1.5.1. Natri clorua (NaCl).

...

...

...

A.4.1.5.3. Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na₂EDTA)(C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂).

A.4.1.5.4. Axit clohydric, f(HCl) = 37 %.

A.4.1.5.5. Natri hydroxit (NaOH).

A.4.1.5.6. Natri dodexyl sunfat (SDS)(C₁₂H₂₅O₄SNa).

A.4.1.5.7. Proteinaza-K, khoảng 20 đơn vị/mg lyophilisat.

A.4.1.5.8. Guanidin hydroclorua (CH₅N₃-HCl).

A.4.1.5.9. Kali clorua (KCl).

A.4.1.5.10. Dinatri hydro phosphat (Na₂HPO₄).

A.4.1.5.11. Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄).

...

...

...

A.4.1.5.13. Silica (SiO₂), silicon dioxit có sự phân bố cỡ hạt từ 0,5 mm đến 10 mm (80 % từ 1 mm đến 5 mm)8).

A.4.1.5.14. RNaza-A, không chứa DNaza, khoảng 100 đơn vị/mg lyophilisat.

A.4.1.5.15. Dung dịch proteinaza-K, r = 20 mg/ml.

Hòa tan enzym trong nước vô trùng hoặc dung dịch đệm thích hợp như mô tả trong [34]. Không hấp áp lực dung dịch này. Bảo quản ở - 20 ^0C, tránh lặp lại việc cấp đông và rã đông.

A.4.1.5.16. Dung dịch guanidin hydroclorua I, c(CH5N3-HCl) = 5 mol/l.

Hấp áp lực tối đa 15 min ở 121 ^0C.

A.4.1.5.17. Dung dịch guanidin hydroclorua II, c(CH₅N₃-HCl) = 6 mol/l. Hấp áp lực tối đa 15 min ở 121 ^0C.

A.4.1.5.18. Dung dịch đệm PBS, c(NaCl) = 0,157 mol/l, c(KCl) = 0,0027 mol/l, c(Na₂HPO₄) = 0,010 mol/l, c(KH₂PO₄) = 0,0018 mol/l.

Chỉnh pH đến 7,5 bằng HCl.

...

...

...

Cân 5 g silica (A.4.1.5.13) cho vào ống nghiệm 50 ml và thêm 50 ml dung dịch đệm PBS (A.4.1.5.18). Trộn kỹ và để yên trong 2 giờ. Loại bỏ phần nổi phía trên bằng cách dùng pipet để hút. Thêm tiếp 50 ml dung dịch đệm PBS, trộn kỹ và để yên trong 2 h. Hút để loại bỏ phần nổi phía trên. Ly tâm 2 phút ở 2 000 g. Loại bỏ phần nổi phía trên còn lại. Hòa lại các cặn này trong dung dịch guanidin-HCl II (A.4.1.5.17) đến 50 ml. Sử dụng dung dịch này trong vòng từ 2 tháng đến 5 tháng. Lắc kỹ trước khi sử dụng.

A.4.1.5.20. Dung dịch đệm chiết TNE-SDS, c(NaCl) = 0,150 mol/l, c(Tris) = 0,002 mol/l, c(Na₂ EDTA) = 0,002 mol/l, r(SDS) = 10 g/l.

Dùng HCl hoặc NaOH để chỉnh pH đến 8,0 và hấp áp lực trước khi bổ sung SDS.

A.4.1.5.21. Isopropanol f[CH₃CH(OH)CH₃] = 80 %.

A.4.1.5.22. Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,010 mol/l và c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l.

Dùng HCl hoặc NaOH để chỉnh pH đến 8,0.

A.4.1.5.23. Dung dịch RNaza-A, r(RNaza) = 10 mg/ml.

Bảo quản trong dung dịch lỏng ở -20 ^0C, tránh lặp lại việc cấp đông và rã đông.

A.4.1.6. Thiết bị, dụng cụ

...

...

...

A.4.1.6.1. Máy ly tâm, có thể tạo được lực ly tâm nhỏ nhất là 2 000 g.

Trong một số giai đoạn cần đến ly tâm lạnh.

A.4.1.6.2. Tủ sấy hoặc tủ ấm, có nhiệt độ làm việc ở 60 ^0C.

A.4.1.6.3. Máy lắc, được đặt vào trong tủ sấy/tủ ấm.

A.4.1.6.4. Máy trộn, ví dụ: Vortex ^â^2).

A.4.1.6.5. Lọ ly tâm, 50 ml để chuẩn bị huyền phù silica.

A.4.1.7. Cách tiến hành

A.4.1.7.1. Khái quát

Khi phần mẫu thử đã được chuẩn bị thì tiến hành quy trình tách chiết/tinh sạch ADN. Cần điều chỉnh cho thích hợp giữa khối lượng và thể tích dung dịch đệm tùy theo cỡ mẫu đã chọn.

...

...

...

Cân từ 200 mg đến 500 mg mẫu đã nghiền hoặc đã xay nhỏ cho vào lọ. Thêm 2 ml dung dịch đệm chiết (A.4.1.5.20) và 20 ml dung dịch proteinaza-K (A.4.1.5.15). Để 1 h đến 5 h trong tủ sấy ở 60 0C. Trong suốt thời gian ủ, mẫu được lắc mạnh (khoảng 250 lần/min). Ly tâm 15 min ở 2 000 g. Chuyển 550 ml phần nổi phía trên vào ống nghiệm mới.

Xử lý phần vừa được chuyển sang ống nghiệm bằng 2 ml dung dịch RNaza (A.4.1.5.23) 5 min ở 37 ^0C (bước thủy phân ARN này nên được thực hiện trước khi liên kết silica, mặt khác ARN đã phân giải và các nuleotit tạo thành có thể gây cản trở các phép đo phổ UV tiếp theo). Bổ sung thêm 55 ml dung dịch guanidin-HCl I (A.4.1.5.16) và 100 ml huyền phù silica (A.4.1.5.19). Trộn thật kỹ vài lần. Để yên các ống trên bàn khoảng 1 min.

Ly tâm ống 2 phút ở khoảng 800 g. Gạn bỏ phần nổi phía trên và thêm 500 ml dung dịch isopropanol (A.4.1.5.21). Đậy nắp ống và trộn, có thể dùng máy lắc (A.4.1.6.4), để hòa đều hoàn toàn các cặn.

Ly tâm ống 2 min ở khoảng 1 500 g. Gạn bỏ phần nổi phía trên và làm khô các kết tủa. Thêm 100 ml dung dịch đệm TE (A.4.1.5.22). Trộn thật cẩn thận để hòa tan kết tủa. Ủ mẫu ở 60 ^0C trong 5 min. Ly tâm 5 min ở 2 000 g. Chuyển 80 % phần nổi phía trên sang ống nghiệm mới. Chú ý không chuyển bất kỳ một hạt silica nào bởi vì chúng sẽ gây ức chế hoạt tính của enzym (ví dụ, ADN polymeraza, các enzym endonucleaza).

Xử lý phần vừa được chuyển sang ống nghiệm bằng 2 ml dung dịch RNaza (A.4.1.5.23) 1 h ở 37 ^0C, hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Đây là dung dịch ADN gốc chính.

A.4.1.8. Danh mục các ví dụ

Phương pháp này đã được áp dụng thành công để tách chiết ADN 9) từ các loại chất nền sau:

Phôi ngô ^9), bột ngô, thức ăn gluten ngô ^9), lá ngô, tinh bột ngô biến tính ^9), tinh bột ngô nguyên chất ^9), hạt ngô, lõi ngô, protein từ hạt đậu tương ^9), hạt đậu tương, lá đậu tương, củ cải đường (củ tươi) củ cải đường (phần ruột đông lạnh), lá củ cải đường.

A.5. Chuẩn bị ADN đạt chất lượng dùng cho PCR sử dụng các phương pháp tách chiết ADN dựa trên guanidi-clorofom

...

...

...

A.5.1.1. Khái quát

Phương pháp này thích hợp để tách chiết ADN ra khỏi nhiều loại chất nền thực phẩm và thức ăn chăn nuôi khác nhau (xem A.5.1.8). Có thể cần đến bước tinh sạch tiếp theo phụ thuộc vào mẫu.

A.5.1.2. Tình trạng hiệu lực

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong phòng thử nghiệm.

A.5.1.3. Nguyên tắc

Phương pháp này bao gồm các bước phân giải bằng nhiệt và phân giải bằng enzym với sự có mặt của natri dodecyl sunfat trong dung dịch đệm guanidi gây biến tính, đôi khi được thực hiện tiếp bước tinh sạch, điều này phụ thuộc vào loại chất nền.

Các tạp chất như lipit và protein được loại trừ bằng cách chiết trong clorofom sau khi phân huỷ, AND được kết tủa bằng isopropanol trước khi tinh sạch.

A.5.1.4. Các yêu cầu về an toàn

Cần có tủ hút để xử lý các chất hữu cơ.

...

...

...

A.5.1.5.1. a-Amylaza (tùy chọn), kiểu loại lla từ các loài Bacillus, từ 1 500 đơn vị/mg lyophilisat đến 5 000 đơn vị/mg lyophilisat.

A.5.1.5.2. Axit axetic băng (CH₃COOH).

A.5.1.5.3. Clorofom (CHCl₃).

A.5.1.5.4. Etanol, f(C₂H₅OH) = 96 % .

A.5.1.5.5. Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na₂EDTA) (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂).

A.5.1.5.6. Guanidin hydroclorua (CH₅N₃-HCl).

A.5.1.5.7. Axit clohydric, f(HCl) = 37 %.

A.5.1.5.8. Isopropanol [CH₃CH(OH)CH₃].

A.5.1.5.9. Proteinaza-K, khoảng 20 đơn vị/mg lyophilisat.

...

...

...

A.5.1.5.11. Natri clorua (NaCl).

A.5.1.5.12. Natri dodexyl sunfat (SDS) (C₁₂H₂₅O₄SNa).

A.5.1.5.13. Natri hydroxit, (NaOH).

A.5.1.5.14. Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C₄H₁₁NO₃).

A.5.1.5.15. Dung dịch a-Amylaza, r = 10 mg/ml, được hòa tan trong nước vô trùng.

Không hấp áp lực. Bảo quản ở -20 ^0C, tránh lặp lại việc cấp đông và rã đông.

A.5.1.5.16. Dung dịch etanol, f(C2H5OH) = 70 %.

A.5.1.5.17. Dung dịch đệm chiết, c(Tris) = 0,1 mol/l, c(NaCl) = 0,15 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,05 mol/l, r(SDS) = 10 g/l.

Dùng HCl hoặc KOH để chỉnh pH đến 8,0.

...

...

...

Hấp áp lực sau khi đã chuẩn bị (tối đa 15 min ở 121 ^0C).

A.5.1.5.19. Dung dịch proteinaza-K, r = 20 mg/ml, được hòa tan trong nước vô trùng.

Không dùng nồi hấp. Bảo quản ở -20 ^0C, tránh lặp lại việc cấp đông và rã đông.

A.5.1.5.20. Dung dịch RNaza-A, r = 10 mg/ml.

Bảo quản ở -20 ^0C.

A.5.1.5.21. Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,01 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l.

Dùng HCl hoặc NaOH để chỉnh pH đến 8,0.

A.5.1.6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

...

...

...

A.5.1.6.2. Tủ sấy hoặc tủ ấm, tốt nhất là có trang bị một máy lắc.

A.5.1.6.3. Máy trộn, ví dụ như Vortex ^â^2).

A.5.1.7. Cách tiến hành

A.5.1.7.1. Khái quát

Khi phần mẫu thử đã được chuẩn bị thì tiến hành quy trình tách chiết/tinh sạch ADN. Cần điều chỉnh cho thích hợp giữa khối lượng và thể tích dung dịch đệm tùy theo cỡ mẫu đã chọn.

A.5.1.7.2. Quy trình tách chiết

Cân từ 200 mg đến 500 mg mẫu đã nghiền hoặc đã xay nhỏ cho vào ống nghiệm micro. Thêm 1,6 ml dung dịch đệm chiết (A.5.1.5.17) đã được ủ trước (60 ^0C).

Thêm 10 ml dung dịch RNaza-A (A.5.1.5.20) và 10 ml dung dịch a-amylaza (A.5.1.5.15), trộn nhẹ bằng cách lật đảo chiều ống nghiệm. Để 50 min ở 60 ^0C trong khi vẫn lắc nhẹ. Thêm 1/10 thể tích dung dịch guanidin-HCl (A.5.1.5.18) và trộn bằng máy trộn (A.5.1.6.3).

Thêm 20 ml dung dịch proteinaza-K (A.5.1.5.19), trộn kỹ bằng cách đảo chiều ống nghiệm và ủ ít nhất 2 h ở 60 ^0C trong khi ủ vẫn lắc trộn nhẹ. Để ống nghiệm trên giá đỡ 15 min rồi ly tâm 15 min ở lực ly tâm tối thiểu là 8 000 g.

...

...

...

Ly tâm 20 min ở tối thiểu là 8 000 g. Rửa các chất kết tủa bằng ít nhất là 2 ml dung dịch etanol (A.5.1.5.16) và ly tâm 10 min ở tối thiểu là 8 000 g. Bước này là cần thiết để loại bỏ hết các muối vốn có thể gây cản trở cho việc phân tích tiếp theo (ví dụ, PCR). Gạn bỏ phần nổi phía trên. Làm khô các kết tủa này và hòa lại vào 100 ml nước hoặc dung dịch đệm thích hợp, ví dụ: dung dịch đệm TE (A.5.1.5.21). Đây là dung dịch ADN gốc chính. Nếu cần phải có bước tinh sạch tiếp theo thì phải được tiến hành trên ADN gốc này.

A.5.1.8. Danh mục các ví dụ

Phương pháp này đã được áp dụng thành công để chiết ADN 10) ra khỏi các các loại chất nền sau:

Đậu tương đã axit hoá, ngô hộp, thức ăn cho gia súc, thanh sôcola^10), sôcola thanh^10), váng sữa làm món điểm tâm^10), bánh từ đậu tương, râu ngô, bột ngô, phôi ngô^10), thức ăn từ gluten của ngô^10), hạt ngô, tinh bột ngô biến tính^10), protein ngô^10), hạt ngô, lõi ngô, tinh bột ngô nguyên chất^10), hạt cải dầu, xúc xích^10), bột đậu tương, đậu phụ từ đậu tương, lexitin đậu tương (màu nâu thô^10) và màu vàng xác định^10)), protein đậu tương, hạt đậu tương, tonyu đậu tương, bánh chip ngô^10).

Phương pháp đã không áp dụng thành công trên cỡ mẫu thử 1 g của dầu, maltodextrin, D-glucoza, maltitol, mannitol hoặc xylitol.

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Phương pháp định lượng ADN đà tách chiết được

...

...

...

B.1.1. Khái quát

Phụ lục này mô tả phương pháp thông dụng để xác định nồng độ ADN trong các dung dịch.

B.1.2. Tình trạng hiệu lực

Phương pháp này đã được thử nghiệm một cách rộng rãi và các kết quả đã được công bố [35]. Ví dụ như phương pháp này đã được áp dụng thành công trong liên phòng thử nghiệm về việc phát hiện sinh vật biến đổi gen, do Federal Office of Public Health, Bern và Cantonal Laboratories of Basel and Zurich, Switzerland tổ chức.

B.1.3. Nguyên tắc

Các axit nucleic trong dung dịch sẽ hấp thụ ánh sáng tia cực tím (UV) trong dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại ở 260 nm. Vì các ADN, ARN và các nucleotit cùng có độ hấp thụ cực đại ở 260 nm, nên ADN không thể xác định được bằng máy đo quang trong vùng cực tím (UV) khi dung dịch bị nhiễm ARN và nucleotit. Với lý do này, nên ARN cần được loại ra bằng phương pháp enzym trong quá trình chiết ADN trước khi xác định ADN. Cũng tương tự, các oligonucleotit và các nucleotit thu được từ thủy phân ARN cần được loại bỏ (ví dụ, xử lý bằng silica, như trong A.4.1.7.2). Các oligonucleotit và các nucleotit sinh ra khi xử lý bằng RNaza, nếu không được loại bỏ (ví dụ như xử lý bằng silica) thì có thể dẫn đến việc đánh giá thừa hàm lượng ADN của mẫu thử. Ngoài ra, ADN xoắn kép hấp thụ ánh sáng UV ít hơn so với ADN xoắn đơn. Vì tỷ lệ ADN xoắn đơn có trong dung dịch là chưa biết, nên để tránh đánh giá thừa hàm lượng ADN, thì tất cả các ADN có trong mẫu thử cần được chuyển về dạng xoắn đơn bằng cách sử dụng natri hydroxit. Do các axit nucleic không hấp thụ ở bước sóng 320 nm, nên việc đọc ở 320 nm là thông tin để xác định việc hấp thụ mẫu do phân tán ánh sáng và các hợp chất hoạt hóa UV.

Không cần thiết phải xây dựng đường chuẩn, khi hệ số tắt phân tử được chọn như một hàm số của loại axit nucleic đang được nghiên cứu và/hoặc tình trạng nguyên vẹn của chúng.

Tuy nhiên, việc hiệu chuẩn quang phổ kế cần được kiểm tra định kỳ bằng cách đo nồng độ của các dung dịch ADN đối chứng.

B.1.4. Phạm vi áp dụng

...

...

...

CHÚ THÍCH: Đôi khi các hợp chất còn dƯ (ví dụ, CTAB từ quy trình chiết ADN) có thể gây cản trở cho việc phát hiện sắc phổ UV ở 260 nm, vì chúng hấp thụ ở bước sóng này.

B.1.5. Thuốc thử

B.1.5.1. Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C₄H₁₁NO₃).

B.1.5.2. Natri hydroxit (NaOH).

B.1.5.3. Axit clohydric, f(HCl) = 37 %.

B.1.5.4. Chất mang ADN, ví dụ, Herring Sperm ADN 11) hoặc Calf Thymus ADN ^11).

B.1.5.5. Dung dịch chuẩn ADN

Chuẩn bị 10 mg/ml dung dịch gốc ADN bằng cách hòa tan 100 mg chất mang ADN (B.1.5.4) trong 10 ml dung dịch đệm (B.1.5.7). ADN hòa tan ở nồng độ này rất chậm và tạo thành dung dịch rất sánh. Sau đó pha loãng dung dịch ADN chuẩn gốc này với dung dịch đệm đến nồng độ mong muốn (ví dụ: 25 mg/ml).

B.1.5.6. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 2 mol/l.

...

...

...

Dùng HCl để chỉnh pH đến 9,0.

B.1.6. Thiết bị, dụng cụ

B.1.6.1. Máy đo phổ UV, chùm đơn, hai chùm tia hoặc mảng photo diot là thích hợp.

B.1.6.2. Máy trộn/máy lắc,ví dụ Vortex^â^2).

B.1.6.3. Bình đo, ví dụ: các cuvet/ngăn nhỏ bằng thạch anh hoặc bằng chất dẻo thích hợp cho việc phát hiện UV ở bước sóng 260 nm.

Cỡ của bình đo được dùng xác định thể tích đo: các half-micro cuvet (1 000 ml), micro cuvet (400 ml), ultra- micro cuvet (100 ml) và các ống mao dẫn (3 ml đến 5 ml). Đường quang của cuvet chuẩn thường là 1 cm.

B.1.7. Cách tiến hành

B.1.7.1. Đo các dung dịch chuẩn ADN

Việc hiệu chuẩn chính xác của máy quang phổ có thể được kiểm chứng bằng cách sử dụng dung dịch ADN đối chứng, như sau:

...

...

...

- bình đo được đổ đầy bằng dung dịch chuẩn ADN (B.1.5.5).

Đo độ hấp thụ đối với dung dịch mẫu trắng và cả dung dịch chuẩn ADN ở bước sóng 260 nm và bước sóng 320 nm.

B.1.7.2 Đo dung dịch ADN thử nghiệm có nồng độ chưa biết

Đối với dung dịch mẫu trắng, trộn dung dịch đệm (B.1.5.7) và dung dịch natri hydroxit (B.5.1.1.5.13), sao cho nồng độ chất của NaOH cuối cùng là 0,2 mol/l. Hỗn hợp này được sử dụng để đổ đầy bình đo.

Trộn dung dịch ADN thử nghiệm với dung dịch natri hydroxit và nếu cần thì trộn với dung dịch đệm để thu được nồng độ chất của NaOH cuối cùng là 0,2 mol/l. Hỗn hợp này được sử dụng để đổ đầy bình đo.

Đo độ hấp thụ đối với dung dịch mẫu trắng và cả dung dịch chuẩn ADN gốc ở bước sóng 260 nm và bước sóng 320 nm sau khi ủ 1 phút. Đọc kết quả ổn định sau ít nhất 1 h.

VÍ DỤ 1: Đối với dung dịch mẫu trắng, trộn 90 ml dung dịch đệm và 10 ml dung dịch natri hydroxit và chuyển sang bình đo 100 ml.

VÍ DỤ 2: Đối với dung dịch ADN thử nghiệm, trộn 80 ml dung dịch đệm hoặc nước, 10 ml dung dịch natri hydroxit và 10 ml dung dịch ADN chưa biết nồng độ rồi chuyển sang bình đo 100 ml.

B.1.8. Đánh giá

...

...

...

Nếu độ hấp thụ đã chỉnh ở 260 nm bằng 1, thì nồng độ ADN được ước tính tương ứng là 50 mg/ml đối với ADN xoắn kép hoặc 37 mg/ml đối với ADN xoắn đơn (tức là bị biến tính bởi natri hydroxit).

Các phép đo tin cậy đòi hỏi các giá trị hấp thụ ở bước sóng 260 nm phải lớn hơn 0,05.

Cuối cùng, tính nồng độ khối lượng, r, của dung dịch ADN xoắn kép thử nghiệm, có tính đến sự biến tính và hệ số pha loãng được áp dụng theo công thức (1):

r_AND = F x (OD₂₆₀ - OD₃₂₀) x 37                            (1)

trong đó:

F là hệ số pha loãng;

OD₂₆₀ là độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm;

OD₃₂₀ là độ hấp thụ ở bước sóng 320 nm;

37 là hệ số chuyển đổi, tính bằng miligam trên mililit.

...

...

...

r_ADN = 10 x (0,658 - 0,040) x 37 mg/ml = 229 mg/ml.

B.2. Phương pháp nhuộm ethidi bromua và điện di gel agaroza

B.2.1. Khái quát

Phụ lục này mô tả phương pháp thông dụng để xác định nồng độ ADN trong các dung dịch. Điện di gel agaroza của ADN và nhuộm màu ethidi bromua (EtBr) đưa ra cách ước tính số lượng ADN và phân tích tại cùng một thời điểm trạng thái tự nhiên của chúng (ví dụ: độ phân huỷ, sự có mặt của ARN còn dư và một số tạp chất). Phương pháp này cũng có thể áp dụng nếu lượng ADN sẵn có không đủ để phát hiện bằng đo phổ, hoặc ADN chưa đủ sạch và có thể còn chứa các chất hấp thụ tia UV ^[36]. Điện di gel thường không được khuyến cáo để định lượng ADN nếu nó đã bị biến tính. Trong trường hợp này, có thể áp dụng các phương pháp khác.

B.2.2. Tình trạng hiệu lực

Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trong nhiều năm qua, nhưng chưa bao giờ được đánh giá trong các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để phát hiện sinh vật biến đổi gen trong thực phẩm.

B.2.3. Nguyên tắc

ADN tách bằng điện di, trên cơ sở điện tích và phân tử lượng của nó, khi nạp lên rây phân tử (gel agaroza) và chịu tác động của điện trường trong sự có mặt của dung dịch đệm [37].

EtBr đan xen vào ADN và khi được kích thích bằng ánh sáng UV sẽ phát huỳnh quang da cam. Do lượng huỳnh quang tỷ lệ với khối lượng ADN tổng số, nên số lượng ADN có trong mẫu có thể được ước tính bằng cách so sánh huỳnh quang được tạo ra bởi mẫu chưa biết với một dãy định lượng chuẩn. Khối lượng phân tử của các chất chuẩn cần phải giống với khối lượng phân tử của ADN cần định lượng, vì EtBr cũng nhuộm màu ADN xoắn đơn và ARN. Để định lượng chính xác hơn về hàm lượng ADN, thì ARN phải được loại bỏ bằng phương pháp enzym.

...

...

...

Phương pháp này có thể áp dụng cho các nồng độ ADN trong khoảng từ 5 ng đến 500 ng khi sử dụng các hệ thống thu nhận ảnh. Các hệ thống sử dụng CCD để ghi hình có thể nhạy hơn.

B.2.5. Các yêu cầu về an toàn

EtBr là một chất gây đột biến mạnh và là chất gây ung thư và phải được xử lý hết sức thận trọng. Sử dụng găng tay là bắt buộc. Tất cả các dung dịch và các gel chứa EtBr phải được khử nhiễm trước khi loại bỏ, xem [36].

Ánh sáng UV (UV-C) rất nguy hiểm, đặc biệt là đối với võng mạc mắt. Luôn luôn phải đeo dụng cụ bảo vệ UV (mặt nạ) khi sử dụng.

B.2.6. Thuốc thử

Điện di gel agaroza có thể được thực hiện theo dung dịch đệm điện di TAE hoặc theo dung dịch đệm điện di TBE.

Thông thường, ở mức sinh học phân tử thì không cần các loại thuốc thử mô tả trong phương pháp này. Các dung dịch mô tả trong phương pháp này không phải lúc nào cũng cần phải khử trùng bằng hấp áp lực.

B.2.6.1. Agaroza, thích hợp cho việc điện di ADN và cho việc tách cỡ phân tử ADN.

B.2.6.2. Axit boric (H₃BO₃), chỉ dùng cho hệ thống dung dịch đệm TBE.

...

...

...

B.2.6.4. Chất chuẩn định lượng ADN, có phân tử lượng thích hợp (ví dụ, linearized Lambda Phage ADN đối với ADN phân tử lượng cao và Lambda Phage ADN phân giải giới hạn đối với ADN phân tử lượng thấp).

B.2.6.5. Axit axetic băng (CH₃COOH), chỉ dùng cho hệ thống dung dịch đệm TAE.

B.2.6.7. Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na₂-EDTA) (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂).

B.2.6.8. Ethidi bromua (EtBr) (C₂₁H₂₀N₃Br).

B.2.6.9. Glyxerol (C₃H₈O₃).

B.2.6.10. Natri axetat (C₂H₃O₂Na), chỉ dùng cho hệ thống dung dịch đệm TAE.

B.2.6.11. Axit clohydric, f(HCl) = 37 %.

B.2.6.12. Natri hydroxit (NaOH).

B.2.6.13. Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris) (C₄H₁₁NO₃).

...

...

...

Dùng NaOH hoặc axit axetic băng để chỉnh pH đến 8,0. Tốt nhất là chuẩn bị dung dịch đệm TAE theo dung dịch gốc đậm đặc (đậm đặc tối đa gấp 50 lần). Nếu thấy có kết tủa thì loại bỏ. Ngay trước khi sử dụng, có thể pha loãng dung dịch đệm điện di đậm đặc bằng nước đã khử ion hoặc nước chưng cất một lần, chưa khử trùng.

B.2.6.15. Dung dịch đệm Tris/borat (TBE) (0,5x), c(Tris) = 0,055 mol/l, c(axit boric) = 0,055 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l,

Dùng NaOH hoặc HCl để chỉnh pH đến 8,0. Tốt nhất là chuẩn bị dung dịch đệm TBE theo dung dịch gốc đậm đặc (đậm đặc tối đa gấp 10 lần). Nếu thấy có kết tủa thì loại bỏ. Ngay trước khi sử dụng, có thể pha loãng dung dịch đệm điện di đậm đặc bằng nước đã khử ion hoặc nước chưng cất một lần, chưa khử trùng.

B.2.6.16. Dung dịch đệm nạp mẫu (5x), f(glyxerol) = 50 %, r(xanh bromophenol) = 2,5 g/l và/hoặc r(xylen xyanol) = 2,5 g/l, hòa tan trong dung dịch đệm điện di (B.2.6.14 hoặc B.2.6.15).

B.2.6.17. Dung dịch ethidi bromua, c(EtBr) = 0,5 mg/l.

Tốt nhất là bảo quản dung dịch ethidi bromua ở dạng đậm đặc (ví dụ, 10 mg/ml) ở 5 ^0C nơi tối (EtBr rất nhạy với ánh sáng). Cũng không nên cân EtBr. Dung dịch gốc cần được chuẩn bị bằng cách hòa một lượng nước thích hợp vào bình đã chứa sẵn bột EtBr, hoặc chứa một số viên EtBr đã được cân trước. Khi hòa tan EtBr cần phải tránh ánh sáng, trong khi vẫn khuấy, ở nhiệt độ phòng. Chuẩn bị dung dịch này thường mất khoảng 1 h.

B.2.7. Thiết bị, dụng cụ

B.2.7.1. Lò vi sóng hoặc nồi cách thủy

B.2.7.2. Dụng cụ để điện di gel agaroza, kèm theo phụ tùng và nguồn năng lượng.

...

...

...

Cách khác, có thể sử dụng thiết bị sắc ký cột axit nucleic và tùy theo hệ thống phát hiện hoặc các hệ thống thích hợp tương tự.

B.2.7.4. Dụng cụ đọc, ví dụ: hệ thống chụp ảnh có các phim 3 000 ASA và bộ lọc UV đủ cho huỳnh quang được phát ra bởi EtBr.

Cách khác, có thể sử dụng hệ thống máy quay video có camera CCD, có bộ lọc UV và (tùy chọn) phần mềm phân tích định lượng.

B.2.8. Cách tiến hành

B.2.8.1. Khái quát

Điện di gel agaroza có thể được thực hiện theo dung dịch đệm điện di TAE hoặc theo dung dịch đệm điện di TBE. Sử dụng cùng một loại dung dịch đệm để hòa tan agaroza và để đổ vào bể điện di.

B.2.8.2. Chuẩn bị gel agaroza

Gel không được dày quá 1 cm.

Nồng độ và chất lượng của agaroza xác định khả năng phân giải của gel. Để định lượng ADN phân tử lượng cao, thì sử dụng các nồng độ agaroza từ 8 g/l đến 10 g/l. Để định lượng ADN phân tử lượng thấp (ví dụ, đã bị phân giải hoặc cắt bởi enzym giới hạn), thì sử dụng các nồng độ agaroza cao hơn (đến 40 g/l) [38].

...

...

...

B.2.8.3. Chuẩn bị mẫu ADN

Trộn các dung dịch mẫu ADN (ví dụ, 5 ml đến 10 ml) với khoảng 20 % (đối với thể tích mẫu cuối cùng) của dung dịch đệm (B.2.6.16) (ví dụ, cho 2,5 ml dung dịch đệm vào 10 ml mẫu ADN), trộn và dùng micro pipet đưa hỗn hợp vào giếng. Nếu nghi ngờ rằng các mẫu quá đậm đặc, thì cũng nên cho thêm một số dung dịch mẫu pha loãng vào gel điện di.

Để xác định kích thước của các đoạn ADN đã chiết được, thì cho dung dịch đệm mẫu (B.2.6.16) theo tỷ lệ (20 % thể tích mẫu) vào một lượng thích hợp của chất chuẩn khối lượng phân tử ADN (B.2.6.5) và tiến hành điện di song song.

Để ước tính nồng độ của mẫu chưa biết, cho chạy song song với các mẫu chuẩn ADN. Các mẫu như thế có chứa các lượng đã biết của ADN chuẩn (B.2.6.4) (nằm trong dải áp dụng của phương pháp: từ 5 ng đến 500 ng) được hòa tan trong nước hoặc dung dịch đệm điện di (B.2.6.14 hoặc B.2.6.15). Khuyến cáo sử dụng các chất chuẩn định lượng chứa ít nhất 5 điểm hiệu chuẩn (nghĩa là các lượng ADN khác nhau).

B.2.8.4. Điện di mẫu

Cẩn thận lấy “lược” ra khỏi gel. Chuyển gel (cùng với đĩa gel) vào bể điện di, sao cho các giếng nằm gần với cực âm. Đổ dung dịch đệm điện di (B.2.6.14 hoặc B.2.6.15) vào đầy bể. Phủ một lớp dày khoảng 2 mm cùng loại dung dịch đệm lên lớp gel và dùng micro pipet để nạp mẫu vào giếng.

Tiến hành điện di ở nhiệt độ phòng ở điện áp và cường độ thích hợp (thông thường nên dùng điện áp ổn định tối đa 5 V/cm đối với khoảng cách giữa các điện cực). Dưới các điều kiện được mô tả, thì ADN tích điện âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Thời gian điện di phụ thuộc vào khoảng cách di chuyển cần thiết, dòng điện cung cấp, dung dịch đệm được sử dụng, thẩm thấu điện và nồng độ của agaroza trong gel.

B.2.8.5. Nhuộm

Sau khi kết thúc điện di, nhuộm gel từ 15 min đến 50 min trong dung dịch ethidi bromua (B.2.6.17) ở nhiệt độ phòng, nên để nơi tối (và/hoặc để trong bể bằng thép không gỉ có nắp đậy kín) và lắc nhẹ.

...

...

...

Cách khác, để nhuộm màu sau điện di, có thể bổ sung EtBr vào gel trước khi rót. Trong trường hợp này, EtBr được bổ sung vào gel đến nồng độ cuối cùng của gel đã được làm nguội đến 60 0C là 0,01 mg/ml.

Nếu gel được đúc với ethidi bromua, thì nạp mẫu chưa biết và chất chuẩn ADN (B.2.6.4) vào các giếng riêng biệt được tạo ra bởi cùng một “lược” trên cùng loại gel. Mặt khác, lượng ethidi bromua khác nhau, sinh ra các kết quả định lượng sai. Để giảm thiểu các vẫn đề di chuyển EtBr trong gel, có thể bổ sung một số EtBr vào dung dịch đệm điện di (bể điện di). Sau khi điện di, thường phải rửa gel.

B.2.8.6. Ghi lại gel

Chuyển gel lên bề mặt đèn UV và ghi lại huỳnh quang ADN bằng chụp ảnh hoặc quay video.

B.2.9. Đánh giá/diễn giải

Hàm lượng ADN của mẫu được ước tính bằng cách so sánh các mẫu chưa biết với các mẫu chuẩn AND đưa vào điện di song song. Việc đánh giá này có thể được thực hiện bằng trực giác hoặc tốt nhất là có sự hỗ trợ của phần mềm định lượng để có thể dựng đường chuẩn.

B.3. Phương pháp PCR tức thời (real time PCR) hoặc định lượng ADN

Khi các chất nền chiết được ít ADN, thì không phải khi nào cũng có thể định lượng ADN bằng phương pháp vật lý (ví dụ, các phương pháp mô tả trong Phụ lục này), vì độ nhạy của chúng không đủ. Trong trường hợp này khi cần định lượng nên sử dụng phương pháp PCR tức thời (real time PCR). Phương pháp này cũng cung cấp thông tin về sự khuếch đại PCR các phân tử ADN đã tách mà các phép đo nồng độ ADN bằng vật lý không thể cung cấp được. Về chi tiết, xem ISO 21570.

...

...

...

[1] AUSUBEL, F.M., BRENT, R., KINGSTON, R.E., MOORE, D.D., SEIDMAN, JG., SMITH, JA., STRUHL, K.: CufTent Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons (1988) (ISBN 0-471-50338-X)

[2] SAMBROOK, J., RUSSEL D "Molecular Cloning, a Laboratory Manual" 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001) (ISBN 0-87969-576-5)

[3] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T. Molecular Cloning, a Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) ISBN 0-87969-309-6

[4] PROKISCH, J. ZELENY, R., TRAPMANN, S., LE GUERN, L., SCHIMMEL, H., KRAMER, G.N, PAUWELS, J. Estimation of the minimum uncertainty of DNA concentration in a genetically modified maize sample candidate certified reference material. Fresenuis J. Analy. Chem. (2001) 370(7) pp. 935-9

[5] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F and MANIATIS, T. In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Vol. 3, Appendix E.3, Purification of nucleic acids. (1987) (ISBN 0-87969-309-6)

[6] Detection of a genetic modification of Lactobacillus curvatus in uncooked-meat sausage by amplification of the modified DNA sequence using the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe. L 08.00-44 In: Collection of official methods under article 35 of the Gennan Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods. Federal Health Office, September 1998, revised version: state OS/2001; Berlin, Koln, Beuth Verlag GmbH

[7] STRAUB, J. A., HERTEL, C. and HAMMES, W.P. The fate of recombinant DNA in thermally treated fermented sausages. Eur. Food Res. Technol. (1999) 210, pp. 62-67

[8] STRAUB, J. A., HERTEL, C. and HAMMES, W. P. A 23S rDNA-targeted polymerase chain reaction-based system for detection of Staphyloccus aureus in meat starter cultures and dairy products. J. Food Protect. (1999) 62, pp. 1150-1156

[9] LICK, S., KELLER, M., BOCKELMANN, W., HELLER, K.J. Optimized DNA extraction method for starter cultures from yoghurt. Milk Sci. Int. (1998) 51, pp. 183-186

...

...

...

[11] Detection of a genetic modification of Streptococcus thermophilus in yoghurt by amplification of the modified DNA sequence by means of the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe. L 02.02-4 In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods. Federal Health Office, September 1998, revised version: state OS/2001; Berlin, Koln, Beuth Verlag GmbH

[12] LICK, S., KELLER, M., KRUSCH, U., HELLER, K.J. Identification of starter cultures in thermally treated plain yoghurt using geneprobes and PCR. J. Dairy Res. (1998) 63, pp. 607-613

[13] VAN VAERENBERGH, B., GROOTAERT, B., MOENS, W. Validation of a method for the preparation of fungal genomic DNA for Polymerase chain reaction (PCR) and Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD). J. Mycol. Med. (1995) 5, pp. 133-139

[14] HAYNES, K.A., WESTERNENG, T.J., FELL J.W., MOENS, W. Rapid detection and identification of pathogenic fungi by polymerase chain amplification of large subunit ribosomal DNA. J. Med.& Vet. Mycology (1995) 33, pp. 319-325

[15] GUILLAUME, G.: VERBRUGGE, D., CHASSEUR-LIBOnE, M-L., MOENS, W., COLLARD, J-M.: PCR typing of tetracycline determinants (Tet A-E) in Salmonella enterica Hadar and in the microbial community of activated sludges from hospital and urban wastewater treatment facilities in Belgium. In: FEMS Microbiology Ecology, 2000, 32, pp. 77-85

[16] PEDERSEN, LH., SKOUBOE, P., BOYSEN, M., SOULE, J., ROSSEN, L: Detection of Penicillium species in complex food samples using the polymerase chain reaction. Int J Food Microbiol, 1997, 35(2), pp.169-77

[17] MOENS, W., Methodology for the fast design of fungal DNA probes and PCR primers. In: A.Vassaroti and U. Kircheim (Ed.) Biotechnology Research for Innovation, Development and Growth in Europe, ECSC-EC-EAEC Brussels, 1992, pp. 421-426

[18] HAUGLAND, R.A., HECKMAN, J.L., WYMER, L.J. Evaluation of differents methods for the extraction of fungal conidia by quantitative competitive PCR analysis. In: J.Microbiol. Methods, 1999, 37(2), pp. 165-176

[19] KIM, C.S., LEE, C. H., SHIN, J.S., CHUNG, Y.S., and HYUNG, N.I. A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP. Nucleic Acids Research, 1997, 25, No.5, pp. 1085-1086

...

...

...

[21] PETIT, F., CRAQUELlN, S., GUESPIN-MICHEL, J., and BUFFET-JANVRESSE, C. Nucleic acid extraction from polluted estuarine water for detection of viruses and bacteria by PCR and RT -PCR analysis. Res. Microbiol., 1999, 150, pp. 143-151

[22] WATSON, R.J., and BLACKWELL, B.: Purification and characterization of a common soil component which inhibits the polymerase chain reaction. Can J. Microbiol., 2000, 46, pp. 633-642

[23] GRIFFITHS, R. J., WHITELEY, A.S., O'DONNELL, A.G., and BAILEY, M.J.: Rapid Method for Coextraction of DNA and RNA from Natural Environments for Analysis of Ribosomal DNA- and rRNA- Based Microbial Community Composition. Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66, No. 12, pp. 5488-5491

[24] ROGERS, S.O. and BENDICH, A.J.. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual A6 (1988) pp. 1-10

[25] Analysis of foodstuffs: Detection of a genetic modification of soya beans by amplification of the modified DNA sequence using the polymerase chain reaction (PCR) and hybridisation of the PCR product with a DNA probe. L 23.01.22-1, March 1998. In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Đ 35 LMBG; Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstandenl BgVV (In: Official Collection of methods under article 35 of the German Federal Food Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/BgVV). March 1998 Bd. 1 1999-03 Vol. 1) Berlin, K61n: Beuth Verlag GmbH

[26] Analysis of foodstuffs: Detection of a genetic modification of potatoes by amplification of the modified DNA sequence using the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe. L 24.01-01, February 1996, revised in January 1997. In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Đ 35 LMBG; Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstandenl BgVV (In: Official Collection of methods under article 35 of the German Federal Food Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/BgW). Jan 1997 Bd. 1 (1997-01 Vol. 1) Berlin, K61n: Beuth Verlag GmbH

[27] Analysis of foodstuffs: Detection of a genetic modification of tomatoes bean by amplification of the modified DNA sequence by means of the polymerase chain reaction (PCR) and hybridisation of the PCR product with a DNA probe. L 25.03.01-1, November 1999. In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Đ 35 LMBG; Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstandenl BgVV (In: Official Collection of methods under article 35 of the German Federal Food Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/BgW). Nov 1999 Bd. 1 (1999-11 Vol. 1) Berlin, Koln: Beuth Verlag GmbH

[28] BOYLE, J.S., and LEW, A.M. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purification, Trends in Genetics, Vol. 11(1), p. 8, 1995

[29] BRODMANN, P., EUGSTER, A., HUBNER, Ph., MEYER, R., PAULI, U., V6GELI, U. and LUTHY, J. Nachweis gentechnisch veranderter Roundup ReadyTM Sojabohnen mittels der Polymerase - Kettenreaktion (PCR). Methodenvorpriifung im Rahmen der Subkommission 29a des Schweizerischen Lebensmittelbuches. Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg. 1997,88, pp. 722-731

...

...

...

[31] HUBNER, P., STUDER, E., and LuTHY, J. Quantitation of genetically modified organisms in food. Nat Biotechnol. 1999,17, pp. 1137-1138

[32] MELZAK, K.A., SHERWOOD, C.S., TURNER, R.F.B. and HAYNES, C.A. Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions. J. Colloid and Interface Science, 1996, 181, pp. 635-644

[33] Patents: EP 0389063, USP5,234,809

[34] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F, and MANIATIS, T. In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed, Vol. 5, Appendix B 16,1989 Proteinase-K. (ISBN 0-87969-509-6)

[35] Swiss Food Manual, Chapter 52B, Section 1 to 5.(2000) Eidgenossische Drucksachen und Materialzentrale, CH-5005 Bern, available on CD.

[36] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F and MANIATIS, T. In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed., Vol. 5, Appendix 5, (1989) Quantitation of DNA and RNA (ISBN 0-88989-509-8)

[37] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F and MANIATIS, T. In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed., Vol. 1, Chapter 6, (1989) Gel electrophoresis of DNA (ISBN 0-88989-509-8,)

[38] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F and MANIATIS, T. In: "Molecular Cloning: a Laboratory Manuaf' 2nd ed., Vol. 1, Section 6.5, table 8.1 (1989) (ISBN 0-88989-509-8)

[39] ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. [40] ISO 21569, Foodstuffs -Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products -Qualitative nucleic acid based methods

...

...

...

[42] ISO Guide 30, Terms and definitions used in connection with reference materials.

MỤC LỤC

Lời giới thiệu

1. Phạm vi áp dụng

2. Tài liệu viện dẫn

3. Nguyên tắc

3.1. Khái quát

3.2. Tách chiết AND

...

...

...

4. Yêu cầu chung đối với phòng thử nghiệm

5. Cách tiến hành

5.1. Chuẩn bị phần mẫu thử

5.2. Tách chiết/tinh sạch AND

5.3. Định lượng ADN tách chiết được

5.4. Tính ổn định của ADN tách chiết được

6. Diễn giải

7. Báo cáo thử nghiệm

Phụ lục A Phương pháp tách chiết AND

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

1) Tại thời điểm ban hành ISO 21569 : 2005 này, tiêu chuẩn ISO 24276 chưa được ban hành. Đến nay tiêu chuẩn ISO 24276 đã được ban hành.

^2) Máy Vortex là một ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương tự.

3) Độ lặp lại có thể phụ thuộc vào mẻ mẫu và/hoặc công nghệ sản xuất chúng. Trong một số trường hợp, ADN có thể không tìm thấy hoặc bị biến chất làm cho các kết quả PCR ở mức dưới giới hạn phát hiện của phương pháp, bất kể mỗi/quy trình PCR đã được sử dụng. Điều này có thể là nguyên nhân của độ tái lập thấp giữa các phòng thử nghiệm.

^5) SIGMA P-5288 là một ví dụ thích hợp về sản phẩm có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu chúng cho kết quả tương tự.

^6) Độ lặp lại phụ thuộc vào các mẻ mẫu và/hoặc công nghệ sản xuất chúng. Trong một số trường hợp, ADN có thể không tìm thấy hoặc bị biến chất làm cho các kết quả PCR ở mức dưới giới hạn phát hiện của phương pháp, bất kể quy trình/ái lực PCR đã được sử dụng. Điều này có thể là nguyên nhân của độ tái lập thấp giữa các phòng thử nghiệm.

7) Độ lặp lại phụ thuộc vào các mẻ mẫu và/hoặc công nghệ sản xuất chúng. Trong một số trường hợp, ADN có thể không tìm thấy hoặc bị biến chất làm cho các kết quả PCR ở mức dưới giới hạn phát hiện của phương pháp, bất kể mỗi/quá trình PCR đã được sử dụng. Điều này có thể là nguyên nhân của độ tái lập thấp giữa các phòng thử nghiệm.

^8) SIGMA S-5631 là một ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương tự.

9) Độ lặp lại phụ thuộc vào các mẻ mẫu và/hoặc công nghệ sản xuất chúng. Trong một số trường hợp, ADN có thể không tìm thấy hoặc bị biến chất mà như thế các kết quả PCR sẽ thấp hơn giới hạn phát hiện của phương pháp, bất kể quy trình/ái lực PCR đã được sử dụng. Điều này có thể là nguyên nhân của độ tái lập thấp giữa các phòng thử nghiệm.

...

...

...

^11) Các sản phẩm này có sẵn từ hãng Sigma tương ứng là D-7290 và D-1501. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương tự.