Tiêu chuẩn TCVN 14434:2025 về Xác định citrinin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao - Hai lần khối phổ

• Số hiệu: TCVN14434:2025
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2025

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14434:2025
BS EN 17203:2021

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH CITRININ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO-HAI LẦN KHỐI PHỔ (HPLC-MS/MS)

Foodstuffs - Determination of citrinin in food by HPLC-MS/MS

Lời nói đầu

TCVN 14434:2025 hoàn toàn tương đương với BS EN 17203:2021;

TCVN 14434:2025 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

...

...

...

CẢNH BÁO 1: Cần thực hiện các biện pháp phòng ngừa và bảo vệ thích hợp khi thực hiện các bước làm việc với hóa chất độc hại.

CẢNH BÁO 2: Việc sử dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, hoạt động và thiết bị nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này có trách nhiệm thiết lập các biện pháp thực hành an toàn và sức khỏe phù hợp cũng như xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng.

CẢNH BÁO 3: Citrinin được biết là có đặc tính gây độc cho thận, làm hỏng các ống lượn gần của thận [6].

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH CITRININ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO-HAI LẦN KHỐI PHỔ (HPLC-MS/MS)

Foodstuffs - Determination of citrinin in food by HPLC-MS/MS

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng citrinin trong thực phẩm [ngũ cốc, gạo men đỏ (RYR)], thảo mộc và thực phẩm bổ sung bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao-hai lần khối phổ (HPLC- MS/MS).

Phương pháp này đã được xác nhận đối với citrinin trong gạo men đỏ và trong thực phẩm bổ sung theo công thức trong khoảng từ 2,5 μg/kg đến 3 000 μg/kg và trong bột mì trong khoảng từ 2,5 μg/kg đến 100 μg/kg.

...

...

...

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này không có thuật ngữ nào được định nghĩa.

4  Nguyên tắc

Phần mẫu thử được làm ẩm bằng dung dịch acid chlorhydric và được chiết bằng hỗn hợp ethyl acetat/acetonitril/acid acetic băng trong 60 min. Magnesi sulfat và natri chloride được thêm vào dịch chiết, khuấy và ly tâm để loại bỏ nước và để hỗn hợp tách pha. Thu lấy phần dịch nổi phía trên, lọc, thêm dung dịch nội chuẩn và phân tích bằng LC-MS/MS pha đào. Việc định lượng dựa trên mối liên hệ giữa tỷ lệ citrinin/citrinin^-13C và nồng độ citrinin.

5  Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước phù hợp với loại 1 của TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), trừ khi có quy định khác. Cũng có thể sử dụng các dung dịch có bán sẵn trên thị trường với các đặc tính tương đương với các dung dịch được nêu dưới đây.

...

...

...

5.2  Acetonitril, loại dùng cho LC-MS.

5.3  Acid acetic băng (CH₃COOH), loại tinh khiết phân tích hoặc cao hơn.

5.4  Acid acetic băng (CH₃COOH), loại dùng cho LC-MS.

5.5  Magnesi sulfat (MgSO₄), khan, loại tinh khiết phân tích hoặc cao hơn.

5.6  Natri chloride (NaCl), loại tinh khiết phân tích hoặc cao hơn.

5.7  Dung dịch acid chlorhydric (HCl), loại tinh khiết phân tích hoặc cao hơn, phần thể tích φ(HCl) = 37 % (độ axit).

5.8  Nước (H₂O), đã khử ion (siêu tinh khiết).

5.9  Nước (H₂O), loại dùng cho LC-MS.

5.10  Methanol (MeOH), loại dùng cho LC-MS.

...

...

...

5.12  Dung dịch chiết 1

Cho 10 mL acid acetic băng (5.3) vào 990 mL nước (5.8) và trộn (nước + acid acetic băng, 99+1, phần thể tích). Hòa tan 100 g natri chloride (5.6) trong 1 L hỗn hợp này và thêm 16 mL dung dịch acid chlorhydric (5.7). Dung dịch này có thể sử dụng trong 1 tháng nếu được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

5.13  Dung dịch chiết 2

Trộn 240 mL acetonitril (5.2) với 750 mL ethyl acetat (5.1) và 10 mL acid acetic băng (5.3). Dung dịch này (ethyl acetat + acetonitril + acid acetic băng, 75+24+1, phần thể tích) có thể sử dụng trong 1 tháng nếu được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

5.14  Dung dịch pha loãng

Trộn 80 mL methanol (5.10), 18 mL nước (5.9) và 2 mL acid acetic băng (5.4). Dung dịch này (methanol + nước + acid acetic băng, 80+18+2, phần thể tích) có thể sử dụng trong 1 tháng nếu được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

5.15  Amoni acetat/acid acetic băng trong nước

Hòa tan 9,5 g amoni acetat (5.11) trong 12,5 mL nước (5.9), sau đó thêm 12,5 mL acid acetic băng (5.4) và trộn kỹ. Dung dịch này có thể sử dụng trong 12 tháng nếu được bảo quản ở < -18 °C.

5.16  Pha động A: amoni acetat/acid acetic băng trong nước, nồng độ mol c = 5 mmol/l

...

...

...

5.17  Pha động B: amoni acetat/acid acetic băng trong methanol, c = 5 mmol/l

Cho 1 mL amoni acetat/acid acetic băng trong nước (5.15) vào 999 mL methanol (5.10) và trộn kỹ.

5.18  Citrinin, chất chuẩn phân tích, độ tinh khiết > 99 %, ví dụ tinh thể hoặc dung dịch chuẩn đã được chứng nhận.

5.19  Dung dịch chuẩn gốc citrinin, nồng độ khối lượng ρ = 500 μg/mL

Cân 5 mg citrinin tinh thể, chính xác đến 0,1 mg cho vào bình định mức dung tích 10 mL và hòa tan với acetonitril (5.2) và thêm acetonitril đến vạch. Nồng độ khối lượng của dung dịch chuẩn gốc này phải được kiểm tra. Điều này có thể đạt được thông qua phép phân tích LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn đã được chứng nhận (5.18) hoặc bằng phương pháp đo quang xác định nồng độ sử dụng hệ số hấp thụ mol [8].

Có thể sử dụng dung dịch chuẩn đã được chứng nhận (5.18) làm dung dịch chuẩn gốc.

5.20  Dung dịch chuẩn làm việc citrinin, ρ = 100 μg/mL

Dùng pipet lấy 1 mL dung dịch chuẩn gốc (5.19) cho vào 4 mL dung dịch pha loãng (5.14) và đồng hóa hỗn hợp.

Xác định và sử dụng hệ số hiệu chính (xem 5.19) để hiệu chính nồng độ chính xác của dung dịch chuẩn làm việc (ρ = 100 μg/mL). Có thể bỏ qua bước này khi sử dụng dung dịch chuẩn đã được chứng nhận (5.18).

...

...

...

5.21  Dung dịch chuẩn trung gian citrinin, ρ = 1 μg/mL

Dùng pipet lấy 50 μL dung dịch chuẩn làm việc citrinin (5.20) cho vào 4 950 μL dung dịch pha loãng (5.14) để thu được 5 mL và đồng hóa hỗn hợp.

Sử dụng dung dịch chuẩn trung gian này làm dung dịch thêm chuẩn cho các thử nghiệm độ thu hồi. Dung dịch này có thể bền trong 3 tháng nếu được bảo quản trong bình màu nâu (6.13) ở < -18 °C.

5.22  Dung dịch chuẩn gốc citrinin^-^13C, dùng làm dung dịch chuẩn đã biết nồng độ khối lượng, ví dụ ρ = 100 μg/mL

Sau khi mở, dung dịch chuẩn gốc có thể được sử dụng trong 12 tháng nếu được bảo quản ở < -18 °C trong bình màu nâu (xem ngày hết hạn trong Giấy chứng nhận phân tích).

Nếu citrinin^-^13C ở dạng tinh thể thì hòa tan trong một lượng thích hợp acetonitril (5.2) để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khối lượng phù hợp (ví dụ: ρ = 100 μg/mL). Dung dịch chuẩn gốc này có thể sử dụng trong 12 tháng nếu được bảo quản ở < -18°C.

5.23  Dung dịch chuẩn trung gian citrinin^-^13C, ρ = 100 ng/mL

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc citrinin^-13C (5.22) với dung dịch pha loãng (5.14) và trộn đều để thu được dung dịch chuẩn trung gian citrinin^-^13C ở nồng độ ρ = 100 μg/mL. Sử dụng dung dịch này làm chất nội chuẩn (ISTD) và thêm vào từng dịch chiết mẫu, dung dịch hiệu chuẩn (5.24) và dung dịch kiểm soát citrinin (5.25).

Dung dịch này có thể sử dụng trong 6 tháng nếu được bảo quản trong bình màu nâu ở nhiệt độ < -18 °C. Kiểm tra độ ổn định của dung dịch này sau 6 tháng.

...

...

...

Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn (trong dải từ 0,25 ng/mL đến 50 ng/mL) ví dụ nêu trong Bảng 1, sử dụng dung dịch chuẩn trung gian citrinin (5.21) và dung dịch pha loãng (5.14). Đồng hóa các hỗn hợp.

Bắt đầu với dung dịch hiệu chuẩn 6, dung dịch này sau đó được sử dụng để chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn 1, 2 và 3 (xem Bảng 1).

Mỗi dung dịch hiệu chuẩn (từ 1 đến 6) lấy ra 45 μL, thêm 5 μL dung dịch chuẩn trung gian citrinin^-^13C (5.23) và trộn.

Cũng có thể tăng thể tích dung dịch hiệu chuẩn và dung dịch chuẩn trung gian theo một tỷ lệ khác.

Bảng 1 - Ví dụ về dung dịch hiệu chuẩn thích hợp

Dung dịch hiệu chuẩn

Nồng độ khối lượng

Tổng thể tích

Dung dịch chuẩn trung gian citrinin (5.21)

...

...

...

Dung dịch pha loãng (5.14)

ng/mL

μL

μL

μL

μL

1

0,25

...

...

...

5

995

2

0,5

1 000

10

990

...

...

...

1

1 000

20

980

4

10

1 000

10

...

...

...

990

5

20

1 000

20

980

6

50

...

...

...

50

950

5.25  Dung dịch kiểm soát citrinin, ρ = 25 ng/mL

Chuẩn bị dung dịch kiểm soát citrinin từ dung dịch chuẩn đã được chứng nhận (5.18). Ngoài ra, chuẩn bị một dung dịch kiểm soát citrinin từ dung dịch chuẩn gốc citrinin độc lập thích hợp đã được kiểm tra bằng phương pháp đo quang hoặc đã được kiểm tra bằng dung dịch chuẩn đã được chứng nhận (5.18). Chuẩn bị dung dịch kiểm soát (ρ = 25 ng/mL) bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc, sử dụng dung dịch pha loãng (5.14).

Thêm 5 μL dung dịch chuẩn trung gian citrinin^-13C (5.23) vào 45 μL dung dịch kiểm soát trước khi phân tích. Dung dịch kiểm soát này bền trong 3 tháng nếu được bảo quản trong bình màu nâu ở nhiệt độ <-18 °C.

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau đây.

Đối với dụng cụ thủy tinh, tốt nhất là sử dụng dụng cụ màu nâu để giảm tác động của ánh sáng và sự phân hủy citrinin.

...

...

...

6.2  Cân phân tích, độ chính xác 0,1 mg.

6.3  Máy lắc phòng thử nghiệm.

6.4  Máy ly tâm, thích hợp cho ống ly tâm dung tích 50 mL.

6.5  Máy ly tâm, thích hợp cho ống ly tâm dung tích 1,5 mL.

6.6  Pipet, có thể điều chỉnh, ví dụ từ 1 μL đến 1 000 μL, thích hợp cho dung môi hữu cơ, có đầu tip thích hợp.

6.7  Ống ly tâm, dung tích 50 mL.

6.8  Ống ly tâm, bằng polypropylen (ví dụ ống Eppendorf ^®1)), dung tích 1,5 mL.

6.9  Xyranh, dung tích 2 mL.

6.10  Đầu lọc xyranh, bằng polytetrafluoroethylen (PTFE), có cỡ lỗ 0,2 μm.

...

...

...

6.12  Ống lồng trong lọ nhỏ bằng thủy tinh.

6.13  Bình màu nâu.

6.14  Hệ thống LC-MS/MS, gồm các bộ phận sau:

6.14.1  Bơm LC, thích hợp cho quá trình rửa giải gradient.

6.14.2  Hệ thống bơm, có khả năng bơm một lượng dung dịch có độ chính xác thích hợp.

6.14.3  Cột LC, ví dụ cột HSST3 C18, cỡ hạt 1,8 μm, kích thước 2,1 mm x 100 mm và bộ lọc sơ bộ hoặc tiền cột tương ứng

Các cột có kích thước khác nhau cũng có thể được sử dụng khi đảm bảo phân tách đường nền nhằm phân biệt các pic của citrinin với tất cả các tín hiệu khác.

6.14.4  Bộ ổn nhiệt của cột.

6.14.5  Thiết bị đo hai làn khối phổ (MS/MS), có khả năng thực hiện ion hóa citrinin và theo dõi đa phản ứng (MRM) với dải động đủ rộng.

...

...

...

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị mẫu thử

Nghiền mịn mẫu phòng thử nghiệm, đồng hóa và bảo quản ở nơi tối trước khi lấy phần mẫu thử để phân tích.

7.2  Chiết citrinin

Cân 4,00 g mẫu phòng thử nghiệm đã đồng nhất, chính xác đến 0,02 g, cho vào ống ly tâm 50 mL (6.7).

Thêm 10 mL dung dịch chiết 1 (5.12), sau đó thêm ngay 20 mL (V_ex) dung dịch chiết 2 (5.13) và đậy nắp ống.

Sử dụng máy lắc phòng thử nghiệm (6.3), lắc hỗn hợp trong khoảng 1 h, ở nhiệt độ phòng.

Sau đó, thêm 6,0 g magnesi sulfat (5.5) và 1,5 g natri chloride (5.6) vào hỗn hợp và lắc mạnh ngay trong 30 s để tránh kết tinh muối.

CHÚ THÍCH Bước thực hiện này tỏa nhiệt và làm nóng lên vừa phải lượng chứa trong ống.

...

...

...

Tách các pha bằng cách ly tâm (6.4) trong khoảng 5 min ở khoảng 4 000g,

Lọc 1 mL pha hữu cơ qua bộ lọc xyranh PTFE (6.9, 6.10) vào ống ly tâm dung tích 1,5 mL (6.8). Để phân tích các mẻ có mức độ ô nhiễm cao (ví dụ giới hạn tối đa = 2 000 μg/kg), pha loãng dịch chiết đến 20 lần.

VÍ DỤ Pha loãng 10 μL dịch chiết của các mẫu bị ô nhiễm cao trong 190 μL dung dịch pha loãng (5.14) và đồng hóa hỗn hợp.

Nếu dịch chiết đã pha loãng này bị đục (đặc biệt với gạo men đỏ) thì chuyển một lượng dịch chiết đã pha loãng (> 1 mL) vào ống ly tâm 1,5 mL khác (6.8) và ly tâm lại ở khoảng 4 000g (6.5).

7.3  Quy trình thêm chuẩn

Thêm 80 μL dung dịch chuẩn trung gian citrinin (5.21) vào phần mẫu thử 4 g (tương ứng với phần khối lượng citrinin 20 μg/kg mẫu) và để cân bằng ít nhất 30 min ở nhiệt độ phòng. Đối với các mức ô nhiễm khác, chỉnh nồng độ thêm chuẩn bằng cách thêm thể tích thích hợp. Ngoài ra, có thể sử dụng chất chuẩn đã được chứng nhận.

Thêm 10 mL dung dịch chiết 1 (5.12), thêm ngay 20 mL (V_ex) dung dịch chiết 2 (5.13) và đậy nắp ống. Chiết citrinin ra khỏi mẫu như mô tả trong 7.2.

7.4  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Chuyển 45 μL dịch chiết đã lọc (7.2) vào ống lồng (6.12), thêm 5 μL dung dịch chuẩn trung gian citrinin^-13C (5.23) và trộn đều.

...

...

...

Xử lý dung dịch hiệu chuẩn (5.24) và dung dịch kiểm soát (5.25) theo cách tương tự.

Bơm một lượng thích hợp các dung dịch thử này vào hệ thống LC-MS/MS (6.14) và lưu ý rằng việc phân tích LC-MS/MS phải được thực hiện trong vòng 24 h sau khi chiết, do tính không ổn định của citrinin.

7.5  Phân tích LC-MS/MS

7.5.1  Yêu cầu chung

Cột phân tích, thành phần pha động, chế độ cài đặt gradient và thể tích bơm phải được chọn và kết hợp sao cho các điều kiện này cho phép đạt được sự phân tách chấp nhận được và kết quả tin cậy ở mức yêu cầu, với độ chọn lọc đủ để thu được tỷ lệ nghi ngờ sai lệch thấp có thể chấp nhận được.

Tối ưu hóa các thông số phân tích (chọn chế độ ion hóa, chọn các mảnh khối ion mẹ và ion con, tối ưu hóa điện áp qua côn và năng lượng va chạm) bằng cách truyền và bơm từng dung dịch chuẩn phân tích citrinin và ISTD.

Để kiểm tra độ ổn định của hệ thống LC-MS/MS, bơm dung dịch kiểm soát (5.25).

7.5.2  Điều kiện vận hành LC-MS/MS

Bơm các dung dịch kiểm soát, dung dịch pha loãng và các dịch chiết theo thứ tự sau:

...

...

...

- Dung dịch pha loãng (5.14; để kiểm tra xác nhận mức độ nhiễm từ mẫu trước sang mẫu tiếp theo qua các lần bơm mẫu);

- Dung dịch hiệu chuẩn (5.24);

- Dung dịch kiểm soát (5.25; để kiểm tra xác nhận tính phù hợp của hệ thống);

- Dịch chiết mẫu (7.3, 7.2) (bao gồm dung dịch pha loãng (5.14) và dung dịch kiểm soát (5.25) sau mỗi 6 lần đến 10 lần bơm mẫu);

- Dung dịch kiểm soát (5.25);

- Dung dịch pha loãng (5.14).

Khi sử dụng cột (6.14.3), pha động A (5.16) và pha động B (5.17), tỷ lệ rửa giải quy định trong Bảng A.1, các cài đặt sau đây được chứng minh là có thể áp dụng được.

Tốc độ dòng: 0,5 mL/min;

Nhiệt độ lò cột: 40 °C;

...

...

...

Nguồn ion: phun điện;

Chế độ ion hóa: chế độ ion âm;

Kiểu phân tích: chế độ theo dõi đa phản ứng (MRM) của 3 kênh;

Cài đặt nguồn ion: nhiệt độ nguồn 150 °C, nhiệt độ khử dung môi 450 °C, dòng khí khử dung môi 1 000 L/h, dòng khí qua côn 150 L/h và điện áp mao quản 1 kV.

Các thông số cài đặt LC nêu trên có thể được coi như là giá trị hướng dẫn. Tùy thuộc vào cột được sử dụng, phải điều chỉnh tỷ lệ rửa giải và/hoặc tốc độ dòng sao cho đạt được sự phân tách tốt nhất giữa chất phân tích và các thành phần chiết khác của nền mẫu.

Khi sử dụng ion dương làm ion mẹ và sự thất thoát ion dương đóng vai trò chuyển khối ion định lượng, thì phải theo dõi ít nhất hai ion định tính.

Các thông số khối phổ thích hợp được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Các điều kiện khối phổ riêng của chất để phân tích citrinin

Chất phân tích

...

...

...

min

lon mẹ

[M + MeOH-H]^-

m/z

Điện áp qua cổng ion

V

Ion con m/z (năng lượng va chạm)

Ion định lượng

Ion định tính thứ 1

...

...

...

Citrinin

3,8

281,0

50

249,0

(15 eV)

205,0

(25 eV)

177,0

...

...

...

Citrinin^-13C

294,0

50

262,0

(15 eV)

na ^a

na

^a không áp dụng.

Do đó, các điều kiện đo tối ưu đối với ion định lượng và ion định tính phải được xác định phụ thuộc vào cấu hình của từng thiết bị. Quá trình chuyển khối có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu lớn nhất phải được chọn làm ion định lượng.

...

...

...

Các ví dụ về sắc ký đồ được liệt kê trong Phụ lục B.

7.6  Định danh

Xác định citrinin bằng cách so sánh thời gian lưu của dung dịch hiệu chuẩn với thời gian lưu của dung dịch mẫu thử. Xác định chất phân tích dựa trên ít nhất hai lần chuyển khối. Ngoài ra, thời gian lưu (các pic ở cả hai vết khối lượng) và tỷ lệ diện tích pic phải phù hợp với dung dịch hiệu chuẩn.

Thời gian lưu và các tỷ lệ ion phải phù hợp [3].

8  Tính kết quả

8.1  Yêu cầu chung

Tiến hành hiệu chuẩn đa điểm bằng dung dịch hiệu chuẩn (xem ví dụ trong Bảng 1).

CHÚ THÍCH Dải độ thu hồi được chấp nhận được nêu trong Tài liệu tham khảo [4] và [7].

8.2  Tính toán với chất nội chuẩn

...

...

...

Đối với đồ thị hồi quy tuyến tính, tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích so với tỷ lệ nồng độ tương ứng. Nồng độ khối lượng của citrinin trong dung dịch đã bơm được suy ra từ phương trình hồi quy tuyến tính, tính bằng nanogam trên mililit (ng/mL), xem Công thức (1):

(1)

Trong đó:

A_a

là diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch hiệu chuẩn;

A_ISTD

là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dung dịch hiệu chuẩn;

a_Cal

...

...

...

ρ_a

là nồng độ khối lượng của chất phân tích trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng nanogam trên mililit (ng/mL);

ρ_ISTD

là nồng độ khối lượng chất nội chuẩn trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng nanogam trên mililit (ng/mL);

b_Cal

là giao điểm của đường chuẩn với trục tung được xác định bởi các dung dịch hiệu chuẩn.

Tính nồng độ khối lượng của chất phân tích trong dung dịch mẫu thử , bằng nanogam trên mililit (ng/mL) theo Công thức (2):

(2)

...

...

...

là diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch mẫu thử;

b_Cal

là giao điểm trục của đường hiệu chuẩn được xác định bởi các dung dịch hiệu chuẩn;

là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dung dịch mẫu thử;

a_Cal

là độ dốc của đường chuẩn được xác định bởi các dung dịch hiệu chuẩn;

...

...

...

Tính phần khối lượng w_a của chất phân tích trong phần mẫu thử, tính bằng nanogam trên gam (ng/g) theo Công thức (3):

(3)

Trong đó:

là nồng độ khối lượng của chất phân tích trong dung dịch mẫu thử, tính bằng nanogam trên mililit (ng/mL);

V_ex

là thể tích dung dịch chiết (ở đây là: 20,0 mL);

m_s

...

...

...

D

là hệ số pha loãng (D = 5,0), bằng V_ex/m_s và khi cần thiết, áp dụng hệ số pha loãng bổ sung (20 lần) để có D = 100.

Phần mềm xử lý dữ liệu có thể được sử dụng để tự động kết hợp việc hiệu chính những ảnh hưởng lên nền mẫu (chất nội chuẩn citrinin^-13C) và hệ số pha loãng (D = 5, do bước chiết và nếu cần pha loãng bổ sung thì hệ số pha loãng bổ sung là 20).

Kết quả hiệu chính độ thu hồi được tính bằng Công thức (4).

(4)

Trong đó:

w_{a, đã hiệu chính}

là phần khối lượng đã hiệu chính của chất phân tích, tính bằng nanogam trên gam (ng/g);

...

...

...

là phần khối lượng của chất phân tích, tính bằng nanogam trên gam (ng/g);

RR

là phần trăm hiệu suất thêm chuẩn thu được từ thử nghiệm về độ thu hồi.

9  Độ chụm

9.1  Yêu cầu chung

Chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được tóm tắt trong Phụ lục C. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu trong Phụ lục C.

9.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không quả 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r trong Bảng 3.

9.3  Độ tái lập

...

...

...

Bảng 3 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng đối với citrinin

Mẫu

Mức nhiễm

Trung bình,

μg/kg

r

μg/kg

R

μg/kg

...

...

...

Thấp

38,0

8,7

16,8

Gạo men đỏ

Cao

1 913

342

544

...

...

...

Thấp

31,1

6,6

12,3

Thực phẩm bổ sung - RYR (FS-RYR)

Thấp

22,1

7,7

15,4

...

...

...

Cao

1 867

262

1 085

Lá bạch quả (GBL)

Thấp

30,2

7,8

21,0

...

...

...

Thấp

21,7

8,9

22,7

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải tuân theo TCVN ISO/IEC 17025 và phải bao gồm ít nhất các dữ liệu sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu (loại mẫu, ký hiệu);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và loại quy trình lấy mẫu (nếu biết);

...

...

...

e) ngày thử nghiệm;

f) các kết quả thử nghiệm và đơn vị biểu thị, khi cần thiết độ thu hồi phải được công bố cùng với các kết quả thử nghiệm và các kết quả thử nghiệm có được hiệu chỉnh với các độ thu hồi đó hay không;

g) mọi đặc điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

h) mọi thao tác không được quy định trong phương pháp này hoặc được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(tham khảo)

Ví dụ về các điều kiện đối với hệ thống LC-MS/MS thích hợp

A.1  Cài đặt thiết bị sắc ký WATERS Acquity H-class kết hợp Xevo^® TQ-S2)

...

...

...

Bảng A.1 - Cài đặt thiết bị sắc ký

Hệ thống UHPLC

Acquity H-class (Waters kết hợp Xevo^® TQ-S)

Thể tích bơm

1 μL

Cột

Cột Waters HSST3 C18 (cỡ hạt 1,8 μm, kích thước 2,1 mm × 100 mm) có tiền cột bảo vệ

Tốc độ dòng

0,5 mL/min

...

...

...

40 °C

Dung dịch rửa giải A

Nước + CH₃COOH 0,05 % (phần thể tích) + amoni acetat 5 mmol

Dung dịch rửa giải B

Methanol + CH₃COOH 0,05 % (phần thể tích) + amoni acetat 5 mmol

Gradient

Thời gian

min

Dung dịch rửa giải A

...

...

...

Dung dịch rửa giải B

%

0

70

30

6,5

10

90

8,0

...

...

...

100

9,0

0,0

100

10

70

30

Ví dụ về sắc ký đồ được nêu trong Phụ lục B.

A.2 Cài đặt detector khối phổ

...

...

...

- Nguồn ion: phun điện;

- Chế độ ion hóa: chế độ ion âm bằng chế độ theo dõi đa phản ứng (MRM);

- Cài đặt nguồn ion (ion hóa phun điện (ESI-));

Nhiệt độ nguồn

150 °C

Nhiệt độ khử dung môi

450 °C

Tốc độ dòng khí khử dung môi

1 000 L/h

...

...

...

150 L/h

Điện áp mao quản

100 kV

Thời gian quan sát (dwell time) cho tất cả các chuyển khối

0,038 s

Tốc độ dòng khí va chạm

0,15 mL/min

Áp suất phun

7,00 kPa

...

...

...

Bảng A.2 - Kết quả đo với dung dịch kiểm soát

Thông số

Giá trị kiểm tra

Thời gian lưu của citrinin

3,5 min đến 4,3 min

Mức độ nhiễm citrinin từ mẫu trước sang mẫu tiếp theo

< 1 %

Tín hiệu/nhiễu m/z 249

> 10

...

...

...

< 0,15 min

Áp suất tối đa gradient

< 100 MPa

Mức độ nhiễm từ mẫu trước sang mẫu tiếp theo = “diện tích pic của dung dịch pha loãng"/"diện tích pic của dung dịch kiểm soát 1 ng/mL”.

Nếu mức độ nhiễm từ mẫu trước sang mẫu tiếp theo > 1 % thì:

- rửa bơm 10 lần;

- bơm từ 10 μL đến 25 μL để rửa kim bơm mẫu;

- rửa cột 30 min bằng 95 % pha động B ở tốc độ dòng 0,5 mL/min.

...

...

...

(tham khảo)

Sắc ký đồ điển hình

Trong các hình dưới đây, TargetLynx 4.1 (Waters)3) đã được sử dụng để xử lý dữ liệu. Các kết quả được TargetLynx hiệu chính tự động về hiệu ứng nền mẫu với chất nội chuẩn citrinin^-13C và cho hệ số pha loãng D = 5,0 và tính hệ số pha loãng bổ sung (20 lần) để thu được hệ số pha loãng cuối cùng D = 100, khi cần.

Hình B.1 đến Hình B.5 thu được bằng cách cài đặt thiết bị theo Phụ lục A. Các hình cho thấy MRM chuẩn hóa đối với citrinin và citrinin^-13C được phát hiện trong dung dịch kiểm soát và các dịch chiết mẫu được thêm chuẩn, FD-RYR, bột mì, GBL và FS-GBL. Chuyển khối định lượng và chuyển khối khẳng định được đưa ra.

CHÚ DẪN

X  thời gian, tính bằng min

Y  độ đáp ứng của MS, %

1  MRM định lượng citrinin 281,0 → 249,0

...

...

...

3  MRM định lượng citrinin có gắn ^13C 294,0 → 262,0

4  MRM định tính citrinin 281,0 → 177,0

Hình B.1 - Ví dụ về sắc ký đồ MRM của dung dịch kiểm soát (25 ng/mL)

CHÚ DẪN

X  thời gian, tính bằng min Y độ đáp ứng của MS, %

1  MRM định lượng citrinin 281,0 → 249,0

2  MRM định tính citrinin 281,0 → 205,0

3  MRM định lượng citrinin có gắn ^13C 294,0 → 262,0

...

...

...

Hình B.2 - Ví dụ về sắc ký đồ MRM đối với citrinin trong mẫu trắng gạo men đỏ FS được thêm chuẩn ở mức 50 μg/kg

CHÚ DẪN

X  thời gian, tính bằng min

Y  độ đáp ứng của MS, %

1  MRM định lượng citrinin 281,0 → 249,0

2  MRM định tính citrinin 281,0 → 205,0

3  MRM định lượng citrinin có gắn ^13C 294,0 → 262,0

4  MRM định tính citrinin 281,0 → 177,0

...

...

...

CHÚ DẪN

X  thời gian, tính bằng min

Y  độ đáp ứng của MS, %

1  MRM định lượng citrinin 281,0 → 249,0

2  MRM định tính citrinin 281,0 → 205,0

3  MRM định lượng citrinin có gắn ^13C 294,0 → 262,0

4  chất định tính citrinin MRM 281,0 → 177,0

Hình B.4 - Ví dụ về sắc ký đồ MRM đối với citrinin trong mẫu trắng lá bạch quả (GBL) được thêm chuẩn ở mức 20 μg/kg

...

...

...

CHÚ DẪN

X  thời gian, tính bằng min

Y  độ đáp ứng của MS, %

1  MRM định lượng citrinin 281,0 → 249,0

2  MRM định tính citrinin 281,0 → 205,0

3  MRM định lượng citrinin có gắn ^13C 294,0 → 262,0

4  MRM định tính citrinin 281,0 → 177,0

Hình B.5 - Ví dụ về sắc ký đồ MRM đối với citrinin trong mẫu trắng FS-ginkgo biloba được thêm chuẩn ở mức 20 μg/kg

...

...

...

(tham khảo)

Dữ liệu độ chụm

Phương pháp này được xây dựng bởi phòng thử nghiệm “Chất độc và các chất tự nhiên” tại Viện Sciensano (Tervuren, Bỉ) trong khuôn khổ quy định Điều 11, CEN M/520 và được thử nghiệm trong thử nghiệm cộng tác vào năm 2016 với 18 phòng thử nghiệm sử dụng mẫu gạo men đỏ (RYR), bột mì, bột lá bạch quả (GBL), thực phẩm bổ sung gạo men đỏ và bột lá bạch quả bị ô nhiễm tự nhiên và được thêm chuẩn.

Dữ liệu nêu trong Bảng C.1, Bảng C.2 và Bảng C.3 thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm sử dụng LC-MS/MS. Các kết quả độ thu hồi thu được với các mẫu RYR, bột mì, GBL, thực phẩm bổ sung RYR hoặc GBL được thêm chuẩn.

Bảng C.1 - Dữ liệu độ chụm đối với gạo men đỏ và bột mì

Gạo men đỏ

Bột mì

Mẫu trắng^3

...

...

...

RYR-mức cao

Mẫu trắng^3

Bột mì- mức thấp

Số kết quả báo cáo

17

18

17

17

18

...

...

...

14

14

14

14

14

Số ngoại lệ (phòng thử nghiệm)

0

1

1

...

...

...

1

Số kết quả được chấp nhận

14

13

13

14

13

Giá trị trung bình,  , μg/kg

0,1

...

...

...

1 913

1,4

31,1

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, μg/kg

-

3,1

122

-

2,4

...

...

...

-

8,1

6,4

-

7,6

Giới hạn lặp lại, r, gg/kg

-

8,7

342

...

...

...

6,6

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, μg/kg

-

6,0

194

-

4,4

Độ lệch chuẩn tái lập tương đối RSD_R, %

-

...

...

...

10

-

14,1

Giới hạn tái lập, R, μg/kg

-

16,8

544

-

12,3

...

...

...

-

80,8

-

-

89,8

Giá trị Horwitz-Thompson, μg/kg

-

8,4

278

...

...

...

6,9

Giá trị Horwitz-Thompson, %^b

-

22,0

14,5

-

22,0

Giá trị HorRat

-

...

...

...

0,70

-

0,64

^a Trường hợp không có dữ liệu được đưa ra thì không thể tính toán thống kê.

^b Được tính bằng cách sử dụng độ lệch chuẩn dự đoán từ phương trình Horwitz-Thompson.

Bảng C.2 - Dữ liệu độ chụm đối với thực phẩm bổ sung gạo men đỏ

Thực phẩm bổ sung RYR (FS-RYR)

Mẫu trắng^a

...

...

...

FS-RYR-mức cao

Số kết quả báo cáo

17

17

17

Số phòng thử nghiệm cung cấp kết quả định lượng

14

14

14

...

...

...

0

1

0

Số kết quả được chấp nhận

14

13

14

Giá trị trung bình,  , μg/kg

0,0

...

...

...

1 867

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, μg/kg

-

2,8

94

Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối RSD_r, %

-

12,5

5

...

...

...

-

7,7

262

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, μg/kg

-

5,4

388

Độ lệch chuẩn tái lập tương đối RSD_R, %

-

...

...

...

21

Giới hạn tái lập, R, μg/kg

-

15,4

1 085

Độ thu hồi, %

-

78,8

-

...

...

...

-

4,9

272

Giá trị Horwitz-Thompson, %^b

-

22,0

14,6

Giá trị HorRat

-

...

...

...

1,43

^a Trường hợp không có dữ liệu được đưa ra thi không thể tính toán thống kê.

^b Được tính bằng cách sử dụng độ lệch chuẩn dự đoán từ phương trình Horwitz-Thompson.

Bảng C.3 - Dữ liệu độ chụm đối với bạch quả và thực phẩm bổ sung từ lá bạch quả

Lá bạch quả (GBL)

Thực phẩm bổ sung-GBL

Mẫu trắng^3

GBL_{-mức thấp}

...

...

...

FS-GBL_{-mức cao}

Số kết quả báo cáo

17

18

17

15

Số phòng thử nghiệm cung cấp kết quả định lượng

14

14

...

...

...

12

Số ngoại lệ (phòng thử nghiệm)

3

3

1

2

Số kết quả được chấp nhận

11

11

...

...

...

10

Giá trị trung bình, , μg/kg

0,1

30,2

0,0

21,7

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, μg/kg

-

2,8

...

...

...

3,2

Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối RSD_r, %

-

9,2

-

14,6

Giới hạn lặp lại, r, μg/kg

-

7,8

...

...

...

8,9

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, μg/kg

-

7,5

-

8,1

Độ lệch chuẩn tái lập tương đối RSD_R, %

-

24,9

...

...

...

37,3

Giới hạn tái lập, R, μg/kg

-

21,0

-

22,7

Độ thu hồi, %

-

74,9

...

...

...

69,2

Giá trị Horwitz-Thompson, μg/kg

-

6,6

-

4,8

Giá trị Horwitz-Thompson, %^b

-

22,0

...

...

...

22,0

Giá trị HorRat

-

1,18

-

1,70

^a Trường hợp không có dữ liệu được đưa ra thì không thể tính toán thống kê.

^b Được tính bằng cách sử dụng độ lệch chuẩn dự đoán từ phương trình Horwitz-Thompson,

...

...

...

[1] TCVN ISO/IEC 17025:2017, Yêu cầu về năng lực của các phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn

[2] TCVN 6910 (ISO 5725) (tất cả các phần), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo

[3] SANTE/12089/2016 Guidance document on identification of mycotoxlns in food and feed implemented by 001/01/2017. Avalaible at:

(https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/safety/docs/cs_contaminants_sampling_quid-doc-ident-mycotoxins.pdf)

[4] Commission regulation (EC) No 401/2006, of 23 February 2006 laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs. Official Journal of the European Union, L 70,12-34

[5] Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council, Official Journal of the European Union Corrigendum in L 136/3 of 29 May 2007 in its current version

[6] Commission regulation (EU) No. 212/2014 amending regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of the contaminant citrinin in food supplements based rice fermented with red yeast Monoscus purpureus. OfficialJournal of the European Union, L 67, 3-4

[7] Commission Regulation (EU) No. 519/2014 of 16 May 2014 in its latest version amending Regulation (EC) No 401 /2006 as regards methods of sampling of large lots, spices and food supplements, performance criteria for T-2, HT-2 toxin and citrinin and screening methods or analysis. Official Journal of the European Union, L 147, 29-43

[8] Reinhard H., Zimmerli B. Reversed-phase liquid chromatographic behavior of the mycotoxins citrinin and ochratoxin A. J. Chromatogr. A. 1999, 862 (2) pp. 147-159

...

...

...

2) Waters Acquity H-class kết hợp với Xevo TQ-S là ví dụ về sản phẩm được sử dụng và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

3) TargetLynx 4.1 (Waters) là ví dụ về sản phẩm được sử dụng và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.