Mẫu thử cho kết quả như thế nào sau khi tiến hành phương pháp RT nested PCR thì kết luật mẫu thử dương tính với bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép?

Nội dung chính

• Trong khi thực hiện phương pháp RT nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép cần sử dụng thiết bị dụng cụ nào?
• Cách tiến hành phương pháp RT nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép như thế nào?
• Mẫu thử cho kết quả như thế nào sau khi tiến hành phương pháp RT nested PCR thì kết luật mẫu thử dương tính với bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép?

Trong khi thực hiện phương pháp RT nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép cần sử dụng thiết bị dụng cụ nào?

Theo Mục 4 TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về thiết bị dụng cụ như sau:

"4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng chung

4.1.1 Tủ lạnh

4.1.2 Tủ âm sâu

4.1.3 Cân phân tích có thể cân chính xác 0,1 mg

4.1.4 Pipet đơn kênh các loại

4.1.5 Ống đong, dung tích 100ml; 500ml; 1000ml

4.1.6 Máy ly tâm

4.1.7 Lò vi sóng

4.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT- nested PCR và realtime RT- PCR

4.2.1 Máy nhân gen PCR

4.2.2 Máy nhân gen Realtime PCR

4.2.3 Máy lắc trộn vortex

4.2.4 Máy spindown

4.2.5 Khay đựng đá lạnh

4.2.6 Bộ khuôn và lược đổ thạch

4.2.7 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

4.2.8 Máy đọc gel

4.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên môi trường tế bào

4.3.1 Đĩa nuôi cấy 24 giếng (hoặc dĩa nuôi cấy 96 giếng)

4.3.2 Chai nuôi cấy

4.3.3 Màng lọc

4.3.4 Tủ ấm lạnh

4.3.5 Kính hiển vi soi ngược"

Theo đó, trong khi chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép thì cần sử dụng các dụng cụ thiết bị theo Tiêu chuẩn nêu trên.

Mẫu thử cho kết quả như thế nào sau khi tiến hành phương pháp RT nested PCR thì kết luật mẫu thử dương tính với bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép?

Cách tiến hành phương pháp RT nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép như thế nào?

Theo tiết 6.2.3 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về cách tiến hành như sau:

"6.2.3 Cách tiến hành

6.2.3.1 Tách chiết RNA

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.9) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ Dụ: Sử dụng kít chiết tách InviMAG®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96 Cat hoặc Taco RNA/DNAkit hoặc Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA (Phụ lục B).

6.2.3.2 Chuẩn bị mồi

Phương pháp RT- nested PCR sử dụng cặp mồi SVC F1/SVC R2 ở bước 1 và cặp mồi SVC F1/ SVC R4 ở bước 2 để phát hiện vi rút SVC, (xem phụ lục E, Bảng E.1).

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 pmol/µL làm gốc.

Mồi (3.2.1) được sử dụng ở nồng độ 20 µmol/pL: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (20 µl mồi gốc và 80 µl nước).

6.2.3.3 Tiến hành phản ứng RT-nPCR

Bước 1: Thực hiện phản ứng RT- PCR sử dụng cặp mồi SVC F1 /SVC R2, (xem phụ lục E).

Bước 2: Thực hiện phản ứng nested PCR sử dụng cặp mồi SVC F1/ SVC R4, (xem phụ lục E).

6.2.2.3 Chạy điện di

6.2.2.3.1 Chuẩn bị bản gel

Pha thạch nồng độ từ 1,5 % đến 2 % agarose (3.2.2) bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) trong bình thủy tinh, lắc đều rồi đun sôi.

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.4) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khuôn (4.2.6) đã được cài lược, không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm. Khi bản thạch đông, gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.2.7) đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (3.2.3) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain[1]) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.2.2.3.3 Điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.5) vào 8 µl sản phẩm RT - nested PCR (bước 2) trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder) vào một giếng trên bản gel.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.2.7), ở hiệu điện thể 100 V trong thời gian 20 đến 30 min.

..."

Như vậy, để tiến hành phương pháp RT nested PCR thì phải tiến hành theo các bước tách chiết RNA - chuẩn bị mồi - tiến hành phản ứng RT-nPCR - chạy điện di.

Sau khi thực hiện chạy điện di người tiến hành sẽ độc kết quả trên máy gel để xác định mẫu bệnh có dương tính với bệnh xuất huyết mùa xuân hay không.

Mẫu thử cho kết quả như thế nào sau khi tiến hành phương pháp RT nested PCR thì kết luật mẫu thử dương tính với bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép?

Theo tiết 6.2.2.3.4 tiểu mục 6.2 Mục 6 TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về kết quả sau phản ứng như sau:

"6.2.2.3.4 Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.2.8).

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Đối chứng âm có kết quả âm tính (không có sản phẩm khuếch đại);

- Đối chứng dương có kết quả dương tính được thể hiện bằng vệt sáng rõ có kích thước 714 bp và 606 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 606 bp.

Với điều kiện phản ứng trên

Mẫu xét nghiệm âm tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

Mẫu xét nghiệm dương tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử có sản phẩm khuếch đại có kích thước 714 bp và 606 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 606 bp;

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

CHÚ THÍCH: Trong trường hợp mẫu dương tính yếu, có thể chỉ phát hiện được sản phẩm của bước hai 606 bp."

Như vậy, mẫu xét nghiệm dương tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử có sản phẩm khuếch đại có kích thước 714 bp và 606 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 606 bp;

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

CHÚ THÍCH: Trong trường hợp mẫu dương tính yếu, có thể chỉ phát hiện được sản phẩm của bước hai 606 bp.