Quá trình tách chiết ARN khi thực hiện phương pháp RT- nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép ra sao?

Nội dung chính

• Thuốc thử và vật liệu thử cần dùng trong phương pháp RT nested PCR gồm những loại nào?
• Quá trình bảo quản mẫu thử nghiệm đối với phương pháp RT nested PCR như thế nào?
• Quy trình tách chiết ARN khi thực hiện phương pháp RT- nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép ra sao?

Thuốc thử và vật liệu thử cần dùng trong phương pháp RT nested PCR gồm những loại nào?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về thuốc thử và vật liện thử như sau:

"3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung )

3.1.1 Etanol, từ 70 % đến 100 % (C2H6O)

3.1.2 Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS) (xem A.2)

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT- nested PCR (Reverse Transcription nested Polymerase Chain Reaction) và realtime RT-PCR (realtime Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

3.2.1 Mồi (primers) RT - nested PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.2.2 Agarose

3.2.3 Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate - EDTA) hoặc TBE (Tris-brorate - EDTA) (xem A.1)

3.2.4 Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe

3.2.5 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

3.2.6 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic)

3.2.7 Kít nhân gen RT-PCR

3.2.8 Nước tinh khiết, không có nuclease

3.2.9 Kít tách chiết ARN

3.2.10 Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit)

3.2.11 Kít nhân gen (Realtime RT-PCR)

3.2.12 Cặp mồi (primers) realtime RT-PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.2.13 Đoạn Dò (Probe)

3.2.14 Thang chuẩn ADN (Ladder)

3.3 Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào

3.3.1 Thuốc khử trùng: Virkon 1%

3.3.2 PBS 1X (Phosphate Buffered Saline)

3.3.3 Kháng sinh Penicillin

3.3.4 Kháng sinh streptomycin

3.3.5 Môi trường L-15 (L-15 Leibovitz medium)

3.3.6 FBS (Fetal bovine serum)

3.3.7 Glutamine

3.3.8 Dòng tế bào EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini)."

Theo đó thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương RT nested PCR gồm:

- Etanol, từ 70 % đến 100 % (C2H6O)

- Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS) (xem A.2)

- Mồi (primers) RT - nested PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

- Agarose.

Quá trình tách chiết ARN khi thực hiện phương pháp RT- nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép ra sao? (hình từ Internet)

Quá trình bảo quản mẫu thử nghiệm đối với phương pháp RT nested PCR như thế nào?

Theo tiết 6.2.1 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về lấy mẫu và bảo quản mẫu như sau:

"6.2 Phương pháp RT- nested PCR

6.2.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu (Theo 6.1)"

Theo đó dẫn chiếu tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về lấy mẫu chẩn đoán như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

- Cá ≤ 4 cm: Lấy cả con từ 5 đến 10 con;

- Cá từ 4 đến 6 cm: Lấy não và toàn bộ phủ tạng từ 5 con đến 10 con;

- Cá lớn: Lấy gan, thận, lách và não từ 5 con.

Mẫu bệnh phẩm để phân lập vi rút trên môi trường tế bào phải được lấy vô trùng, các bộ phận phải để riêng biệt trong từng túi hay lọ vô trùng, bảo ở nhiệt độ 2 đến 8 °C và gửi về phòng thí nghiệm trong vòng 24 h sau khi lấy mẫu. Nên sử dụng môi trường vận chuyển mẫu vi rút hay môi trường nuôi cấy tế bào có bổ sung kháng sinh để bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển.

Mẫu bệnh phẩm để làm phản ứng RT- nested PCR và real time RT PCR có thể sử dụng cố định trong cồn 90% theo tỉ lệ mẫu : cồn (1:10) hoặc mẫu tươi, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và chuyển đến phòng thí nghiệm trong 48 h sau khi lấy mẫu. Mẫu tươi chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong cồn etanol từ 96 % đến 100 % theo tỷ lệ mẫu : cồn (1:10) (3.1.1)."

Như vậy, mẫu bệnh để làm phản ứng RT nested PCR và real time RT PCR có thể sử dụng cố định trong cồn 90% theo tỉ lệ mẫu : cồn (1:10) hoặc mẫu tươi, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và chuyển đến phòng thí nghiệm trong 48 h sau khi lấy mẫu.

Mẫu tươi chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong cồn etanol từ 96 % đến 100 % theo tỷ lệ mẫu : cồn (1:10) (3.1.1).

Quy trình tách chiết ARN khi thực hiện phương pháp RT- nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép ra sao?

Theo Mục B.2 Phục lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về cách tiến hành tách chiết ARN như sau:

"B.2 Tiến hành

1. Cho 25 µL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml.

2. Cho 200 µL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K.

(Nếu thể tích mẫu <200 µL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 µL bằng dung dịch đệm phosphat PBS hoặc 0.9% NaCl).

3. Cho hỗn hợp dung dịch Lysis Buffer và Carrier ARN vào ống chứa mẫu, đóng nắp ống và vortex 15 s.

4. Ủ mẫu ở 56°C trong 15 min.

5. Cho thêm 250 µL cồn 96 - 100 % vào ống mẫu, đóng nắp và vortex 15s.

6. Để ở nhiệt độ phòng 5 min.

(Mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên).

7. Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc.

8. Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 2 đến 3 min, chuyển cột lọc sang ống thu mới.

9. Cho 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) vào cột lọc, ly tâm 12.000 vòng trong 2 đến 3 min, chuyển cột lọc sang ống thu mới.

10. Lặp lại bước 9 với 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) một lần nữa.

11. Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới.

12. Ly tâm khô 12000v trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5.

13. Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 µL.

14. Cho 10 đến 50 µL nước ARNse-free (E3) (có sẵn) vào cột lọc.

15. Để ở nhiệt độ phòng 1 min, ly tâm cột lọc ở 12000 vòng trong 1 đến 2 min.

16. Lấy sản phẩm dưới cột lọc, Bảo quản ARN ở nhiệt độ âm 80 °C.

CHÚ THÍCH: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây bệnh SCV."

Theo đó, việc tách chiết ARN khi áp dụng phương pháp RT nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép được thực hiện theo quy định nêu trên.