Canh thang tripton đậu tương:1)
Cao men:
Nước:
|
30 g
6g
1 000ml
|
1) Thành phần của canh thang đậu tương:
Tripton (thủy phân pancratic từ casein):
Soyton (thủy phân papaic từ bột đậu tương):
Dextroza:
Natri clorua:
Dikali photphat:
|
17 g
3 g
2,5 g
5 g
2,5 g
|
5.2.1.1.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần khô hoặc môi trường cơ
bản hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.
Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng
pH là 7,3 ở nhiệt độ 25oC.
Phân phối từng lượng 225 ml vào các bình thí
nghiệm dung tích 500 ml (hoặc các bội số của 225 ml vào các bình thí nghiệm có
dung tích thích hợp). Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1.1.2) ở 121oC.
5.2.1.2. Phần bổ sung 1
5.2.1.2.1. Thành phần
Acriflavin hidroclorua:
Nước:
23 mg
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.1.2.2. Chuẩn bị
Hòa tan arciflavin hidroclorua trong nước.
Khử trùng qua lọc.
Chú thích 1 – Về chi tiết kỹ thuật khử trùng
bằng cách lọc, có thể tham khảo bất kỳ tài liệu nào thích hợp về vi sinh vật
học.
5.2.1.3. Phần bổ sung 2
5.2.1.3.1. Thành phần
Axit nalidixic (muối natri):
Natri hidroxit (0,05 mol/l):
46 mg
10 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hòa tan axit nalidixic trong dung dịch natri
hidroxit. Khử trùng qua lọc.
5.2.1.4. Phần bổ sung 3
5.2.1.4.1 Thành phần
Xicloheximid:
Etanola:
Nước:
57,5 mg
4 ml
6 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hòa tan xicloheximid trong hỗn hợp
etanola/nước. Khử trùng qua lọc.
5.2.1.5. Môi trường hoàn chỉnh
Bảo quản riêng môi trường cơ bản (5.2.1.1) và
các phần bổ sung đã chuẩn bị (từ 5.2.1.2 đến 5.2.1.4) chỗ tối ở nhiệt độ từ 2oC
đến 5oC. Chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh bằng cách thêm: 1 ml của
phần bổ sung 1; 2 ml của phần bổ sung 2 và 2 ml của phần bổ sung 3 vào 225 ml
môi trường cơ bản (5.2.1.1).
Chú thích 2 – Khi cần có thể sử dụng các bình
thí nghiệm có dung tích thích hợp khác, như các bội số tương ứng với 1 ml, 2 ml
và 225 ml.
5.2.2. Môi trường phân lập (thạch Oxford)
5.2.2.1. Môi trường thạch cơ bản
5.2.2.1.1. Thành phần
Môi trường thạch columbia cơ bản:
Aesculin:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Liti clorua:
Nước:
39 g
1 g
0,5 g
15 g
1 000 ml
5.2.2.1.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần rắn trong nước bằng
cách đun sôi.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.2.2.1. Thành phần
Xicloheximid:
Colistin sunfat:
Acriflavin:
Xefotetan:
200 mg
10 mg
2,5 mg
1 mg
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Etanola:
Nước:
5 mg
2,5 ml
2,5 ml
5.2.2.2.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần rắn trong hỗn hợp
etanola/nước. Khử trùng qua lọc.
5.2.2.3 Chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh
Lấy 500 ml môi trường thạch cơ bản (5.2.2.1).
Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1.1.2) ở nhiệt độ 121oC.
Làm nguội tới 50oC và bằng thao tác vô trùng thêm phần bổ sung (5.2.2.2).
Độ pH của môi trường cuối cùng này phải là 7,0 ở 25oC.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.3. Môi trường nuôi cấy đặc: Thạch cao men
tripon đậu tương (TSYEA)
5.2.3.1. Thành phần
Canh thang tripon đậu tương:
Cao men:
Thạch 1):
Nước:
30 g
6 g
từ 12 g đến 18 g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1) Tùy theo cường độ gel của thạch
5.2.3.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn
chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.
Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH là
7,3 ở nhiệt độ 25oC.
Phân phối các lượng khoảng 6 ml môi trường
nuôi cấy đặc vào các ống nghiệm (6.2.2).
Khử trùng các ống nghiệm này 15 phút trong
nồi hấp áp lực (6.1.1.2) ở nhiệt độ 121oC.
Đặt các ống ở tư thế ngang.
Để chuẩn bị các đĩa thạch, khử trùng môi
trường nuôi cấy đặc trong các bình hoặc các chai có dung tích thích hợp. Phân
phối môi trường này khi chúng vẫn còn lỏng theo các lượng khoảng 15 ml các đĩa
Petri vô trùng và để cho đông lại.
5.2.4. Môi trường nuôi cấy lỏng: canh thang
cao men tripton đậu tương (TSYEB)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thành phần của môi trường này như quy định
trong 5.2.1.1.1. Sử dụng 6g cao men.
5.2.4.2. Chuẩn bị
Chuẩn bị môi trường này theo 5.2.1.1.2.
Phân phối theo các lượng khoảng 6 ml vào các
ống nghiệm trước khi khử trùng trong nồi hấp áp lực.
5.2.5. Thạch máu
5.2.5.1. Thành phần
Môi trường cơ bản của thạch máu No.2: 1)
Nước:
Máu ngựa hoặc máu cừu đã loại tơ huyết:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1 000 ml
70 ml
1) Thành phần của thạch máu No.2:
Pepton proteoza:
Thủy phân gan:
Cao men:
Natri clorua:
Thạch (tùy theo cường độ gel của thạch):
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2,5 g
5 g
5 g
12g-18g
5.2.5.2. Chuẩn bị
Hòa tan môi trường thạch máu khô trong nước
bằng cách đun sôi.
Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng
pH là 7,0 ở nhiệt độ 25oC. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm
hoặc các bình thí nghiệm dung tích không quá 500 ml.
Khử trùng thạch máu 15 phút trong nồi hấp áp
lực (6.1.1.2) ở 121oC.
Làm nguội môi trường này tới 45oC.
Bổ sung máu đã loại tơ huyết và lắc đều.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.6. Canh thang có hidrat cacbon
5.2.6.1. Môi trường cơ bản
5.2.6.1.1. Thành phần
Pepton proteoza:
Cao thịt bò:
Natri clorua:
10 g
1 g
5 g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước:
0,02 g
1 000 ml
5.2.6.1.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng
cách đun sôi.
Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng
pH là 6,8, ở nhiệt độ 25oC.
Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm
theo các lượng sao cho sau khi khử trùng còn lại 9 ml.
Khử trùng thạch máu 15 phút trong nồi hấp áp
lực (6.1.1.2) ở 121oC.
5.2.6.2. Các dung dịch hidrat cacbon
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hidrat cacbon 1)
Nước
5 g
1 00 ml
1) Cần có 100ml dung dịch L-rhamnoza và
100ml dung dịch D-xyloza
5.2.6.2.2. Chuẩn bị
Hòa tan riêng rừng hidrat cacbon trong 100ml
nước. Khử trùng qua lọc.
5.2.6.3. Môi trường hoàn chỉnh
Đối với mỗi loại hidrat cacbon, bằng thao tác
vô trùng thêm 1ml dung dịch (5.2.6.2) vào 9 ml môi trường cơ bản (5.2.6.1). Nếu
các thể tích môi trường cơ bản chuẩn bị nhỏ hơn, thì thêm các thể tích dung
dịch hidrat cacbon tương ứng nhỏ hơn.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.7.1. Thành phần
Pepton casein:
Pepton thịt:
20,0 g
6,1 g
Thạch:
Nước:
3,5 g
1 000 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng
cách đun sôi.
Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng
pH là 7,3, ở nhiệt độ 25oC.
Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm
theo các lượng khoảng 5 ml.
Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực
(6.1.1.2) ở 121oC.
Chú thích 3 – Có thể dùng các môi trường có
bán sẵn trên thị trường để kiểm tra tính di động.
5.2.8. Phép thử CAMP
Có thể dùng các đĩa thạch máu (5.2.5) cho thử
nghiệm này, nhưng tốt nhất dùng các đĩa thạch máu cừu lớp kép có lớp máu rất
mỏng (5.2.8.3).
5.2.8.1. Môi trường cơ bản
5.2.8.1.1. Thành phần
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
40 g
Nước:
1 000 ml
5.2.8.1.2. Chuẩn bị
Hòa tan môi trường cơ bản khô trong nước bằng
cách đun sôi.
Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng
pH là 7,0, ở nhiệt độ 25oC.
Phân phối môi trường cơ bản này vào các lọ
hoặc bình với lượng khoảng 100 ml.
Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực
(6.1.1.2) ở 121oC. Làm nguội tới 45oC.
5.2.8.2 Môi trường máu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Môi trường cơ bản (5.2.8.1):
100 ml
Máu ngựa hoặc máu cừu đã loại tơ huyết:
7 ml
5.2.8.2.2. Chuẩn bị
Thêm máu đã loại tơ huyết vào môi trường cơ
bản tan chảy đã khử trùng (5.2.8.1).
5.2.8.3. Môi trường hoàn chỉnh
Phân phối môi trường cơ bản (5.2.8.1) vào các
đĩa Petri vô trùng với các lượng khoảng 10 ml và để cho đông lại. Rót vào mỗi
đĩa một lớp rất mỏng môi trường máu (5.2.8.2), không quá 3 ml.
Để yên cho đông lại. Nếu như máu rót vào đĩa
có chứa môi trường cơ bản đã chuẩn bị từ trước, thì có thể làm ấm 20 phút trong
tủ ấm, để ở 37oC trước khi rót sang lớp máu.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.8.4. Chất cấy phản ứng CAMP
Chủng Staphylococcus aureus làm tan máu yếu (thí dụ như NCTC 1803) và chủng Rhodococcus
equi (thí dụ như NCTC1621) cần phải thử CAMP. Không phải tất cả các chủng
Staphylococcus aureus đều thích hợp thử CAMP.
Bảo quản các chất cấy gốc của S. aureus,
R.equi, L.monocytogenes, L. innocua và L.ivanivii bằng cách nuôi cấy lên môi
trường TSYEA (5.2.3), nuôi ấm ở 37oC từ 24h đến 28h, hoặc cho đến
khi thấy mọc và bảo quản trong tủ lạnh (6.1.10) ở 4oC. Cấy truyền ít
nhất là một lần trong một tháng.
5.3. Thuốc thử
5.3.1. Dung dịch hidro peroxit, 3% (V/V)
6. Thiết bị và dụng
cụ thủy tinh
Chú ý – Khử trùng tất cả các thiết bị, dụng
cụ tiếp xúc với môi trường nuôi cấy, dịch pha loãng hoặc mẫu thử, trừ khi các
thiết bị, dụng cụ đã vô trùng sẵn (các dụng cụ bằng chất dẻo).
6.1. Thiết bị
Sử dụng các thiết bị thí nghiệm vi sinh thông
thường và các dụng cụ đặc biệt sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.1.1.1. Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ ở
173oC ± 3oC.
6.1.1.2. Nồi hấp áp lực, có thể duy trì nhiệt
độ ở 121oC ± 1oC.
6.1.2. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 30oC
± 1oC.
6.1.3. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 37oC
± 1oC.
6.1.4. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 25oC
± 1oC.
6.1.5. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ
ở 45oC ± 1oC hoặc ở 37oC ± 1oC.
6.1.6. Thiết bị nghiền – trộn
Có thể sử dụng một trong các thiết bị sau
đây:
a) máy trộn quay, vận hành với tốc độ từ 8
000 vòng / phút đến 45 000 vòng / phút, có cốc đựng bằng thủy tinh hoặc bằng
kim loại có nắp, chịu được các điều kiện khử trùng; hoặc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chú thích 4 – Cốc hoặc túi bằng chất dẻo phải
có đủ dung tích để trộn mẫu với lượng chất pha loãng thích hợp. Nói chung, thể
tích của vật chứa phải gấp đôi thể tích của mẫu thử cộng với chất pha loãng.
6.1.7. Que cấy bằng hợp chất platin/iridin,
niken/crom, hoặc nhựa, có đường kính vòng cấy khoảng 3mm.
6.1.8. Kim cấy bằng hợp chất platin / iridin,
niken/crom, hoặc nhựa.
6.1.9. pH mét bù nhiệt (để đo pH của môi
trường đã chuẩn bị và của thuốc thử), có thể đo chính xác tới ± 0,1 đơn vị pH ở
nhiệt độ 25oC.
6.1.10. Tủ lạnh (để bảo quản môi trường đã
chuẩn bị và thuốc thử), có thể duy trì nhiệt độ từ +2oC đến +5oC.
6.1.11. Nguồn tia sáng trắng.
6.1.12. Gương phẳng hoặc gương hình lòng
chảo.
6.1.13. Giá ba chân, để chiếu sáng đĩa Petri.
6.1.14. Kính hiển vi đối pha, có vật kính soi
dầu.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tất cả các dụng cụ thủy tinh phải bền khi khử
trùng nhiều lần.
6.2.1. Bình thủy tinh, để khử trùng và bảo
quản môi trường nuôi cấy và nuôi ấm môi trường lỏng.
6.2.2. Ống nghiệm nuối cấy 1), đường
kính 16 mm và dài 125 mm.
6.2.3. Ống đong, để chuẩn bị môi trường hoàn
chỉnh.
6.2.4. Pipet chia độ, có dung tích 25 ml, 10
ml và 1 ml, được chia vạch 0,5 ml và 0,1 ml.
6.2.5. Đĩa Petri vô trùng.
6.2.6. Phiến kính soi tiêu bản.
6.2.7. Bi thủy tinh.
7. Lấy mẫu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn
này. Nên tiến hành lấy mẫu theo TCVN 6400:1998 (ISO 707).
Cần phải tuân theo các hướng dẫn về lấy mẫu
để kiểm tra vi sinh vật.
8. Chuẩn bị mẫu thử
Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261).
8.1. Sữa
Lắc kỹ mẫu sao cho các vi sinh vật phân bố
càng đều càng tốt bằng cách đảo chiều bình đựng mẫu 25 lần. Tránh không để tạo
bọt hoặc phải để cho bọt tan hết. Thời gian từ khi trộn đến khi lấy ra phần mẫu
thử không lâu quá 3 phút.
8.2. Sữa bột, bột của dịch tách ra khi sản
xuất phomát và bơ, lactoza, casein và caseinat
Trộn kỹ lượng chứa trong lọ kín bằng cách lắc
và đảo chiều liên tục. Nếu mẫu thử đựng trong lọ kín còn nguyên, quá đầy nên
khó lắc trộn, thì chuyển sang lọ chứa to hơn và trộn đều.
8.3. Bơ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
8.4. Phomát
Thông thường mẫu thí nghiệm bao gồm phần thịt
và phần cùi. Các bên liên quan thỏa thuận với nhau về các phần được coi là mẫu
thử.
Tiến hành theo qui định trong 9.1.5.
8.5. Kem lạnh thực phẩm
Tiến hành như trong trường hợp đối với bơ
(8.3) nhưng sử dụng nồi cách thủy (6.1.5) ở nhiệt độ dưới 37oC, vì
mẫu thử không được phép để quá nhiệt độ này.
8.6. Sữa lên men, sữa chua, custard và các
món tráng miệng
Trộn kỹ lượng chứa trong lọ kín bằng cách lắc
và đảo chiều liên tục, hoặc mở lọ và trộn lượng chứa bên trong bằng thìa hoặc
dao trộn vô trùng.
9. Cách tiến hành
Đối với các điểm chú ý về an toàn, xem phụ
lục A và hình 1.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chú thích 5 – Để giảm bớt khối lượng công
việc khi có nhiều phần mẫu thử 25 g lấy để kiểm tra từ 1 lô sữa hoặc các sản
phẩm sữa nhất định, và khi có cơ bản cho thấy là việc hợp nhất (gộp chung các
phần mẫu thử) sẽ không làm ảnh hưởng đến kết quả của mẫu sữa kiểm tra thì có
thể gộp chung các phần mẫu thử trên lại. Thí dụ: nếu có 10 phần x 25 g được lấy
kiểm tra, thì gộp 10 đơn vị này lại thành “1 phần mẫu thử” hợp nhất 250 g và
hòa tan hoặc khuếch tán vào 2,25 l môi trường tăng sinh.
Cho phần mẫu thử vào môi trường tăng sinh
(5.2.1) theo qui định trong 9.1.1 đến 9.1.7.
9.1.1. Sữa
Cho 25 ml mẫu thử vào 225 ml môi trường tăng
sinh (5.2.1) và lắc đều.
9.1.2. Sữa bột, bột của dịch tách ra khi sản
xuất phomát, bột bơ loãng và caseinat
Cân 25 g mẫu thử một cách vô trùng cho vào
bình thí nghiệm có nút, chứa 225 ml môi trường tăng sinh (5.2.1). Lắc để hòa
tan.
9.1.3. Casein
Cân 25 g mẫu thử một cách vô trùng cho vào
cốc đựng của máy trộn (6.1.6), và thêm 225 ml môi trường tăng sinh (5.2.1) ở 45oC.
Trộn từ 1 đến 3 phút để hòa tan kỹ phần mẫu thử.
9.1.4. Bơ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.1.5. Phomát
Cân 25 g mẫu thử một cách vô trùng cho vào
cốc đựng của máy trộn (6.1.6). Thêm 225 ml môi trường tăng sinh (5.2.1) đã được
làm ấm trước đến 37oC. Trộn kỹ phần mẫu thử bằng máy trộn.
9.1.6. Sản phẩm sữa đông lạnh (kể cả kem thực
phẩm)
Dùng pipet lấy 25 g mẫu thử đã tan chảy cho
vào bình thí nghiệm chứa 225 ml môi trường tăng sinh (5.2.1) và lắc đều.
9.1.7. Sữa lên men, sữa chua, custard và món
tráng miệng
Cân 25 g mẫu thử một cách vô trùng cho vào
bình thí nghiệm có đậy nút, có chứa bi thủy tinh (6.2.7) và 225 ml môi trường
tăng sinh (5.2.1). Lắc để hòa tan.
Khi kiểm tra mẫu thử có độ pH thấp, cần kiểm
tra một cách vô trùng độ pH của huyền phù bằng giấy chỉ thị và nếu thấy cần thì
chỉnh pH tới 7,0 ± 0,5, ở 25oC.
9.2. Nuôi ấm
Nuôi ấm môi trường tăng sinh đã được cấy mẫu
trong tủ ấm (6.1.2) ở 30oC trong 48h.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.3.1. Dùng que cấy vòng (6.1.7), ria cấy mẫu
đã nuôi ở trên lên bề mặt đĩa thạch Oxford (5.2.2) để thu được các khuẩn lạc
tách biệt rõ ràng.
9.3.2. Lật sấp đĩa và đặt vào tủ ấm (6.1.3)
để ở 37oC trong 48h.
9.3.3. Kiểm tra đĩa cấy sự có mặt các khuẩn
lạc Listeria spp. đặc trưng (Các khuẩn lạc được bao quanh bởi quầng màu nâu thẫm
hoặc đen).
9.4. Khẳng định
9.4.1. Chọn các khuẩn lạc để khẳng định
Từ mỗi đĩa môi trường phân lập (thạch Oxford,
5.2.2) chọn năm khuẩn lạc điển hình hoặc có nghi ngờ, hoặc, nếu có ít hơn năm
khuẩn lạc như trên thì tất cả để thử khẳng định.
9.4.2. Nuôi ấm
Ria cấy các khuẩn lạc đã chọn lên bề mặt đĩa
thạch TSYEA (5.2.3) sao cho các khuẩn lạc mọc phân tách rõ. Đặt các đĩa này
trong tủ ấm (6.1.3) ở 37oC trong 24h, hoặc cho đến khi có các khuẩn
lạc mọc. Độ dày của lớp môi trường thạch (15ml/1 đĩa) là quan trọng với độ rọi
Henry tốt (xem phần dưới).
Dùng chùm tia sáng trắng (6.1.11) đủ sáng rõ
để kiểm tra các đĩa, rọi tới đáy của đĩa tạo góc 45o (xem hình 2).
Khi kiểm tra các khuẩn lạc dưới ánh sáng truyền qua này (độ rọi Henry) thẳng từ
bên trên đĩa, các khuẩn lạc Listeria ssp. có màu xanh lam và bề mặt có dạng
hạt.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hình 2 – Kiểm tra các
đĩa có các khuẩn lạc nghi ngờ
9.4.3. Phản ứng catalaza
Lấy một khuẩn lạc điển hình và hòa vào một
giọt dung dịch hidro peroxit 3% (5.3.1) trên phiến kính. Khi thấy có tạo bọt
khí chứng tỏ là Listeria ssp. catalaza dương tính.
9.4.4. Đặc tính hình thái và bắt màu
9.4.4.1. Chuẩn bị mẫu cấy từ môi trường TSYEB
(5.2.4) giống như khuẩn lạc điển hình sử dụng để thử phản ứng tính phân giải
máu (9.4.6). Chọn một khuẩn lạc điển hình và hòa vào một ống nghiệm chứa môi
trường TSYEB. Nuôi trong tủ ấm (6.1.4) ở nhiệt độ 200C đến
25oC cho tới khi thấy màu đục rõ (từ 8h đến 24h).
Chuẩn bị một tiêu bản ướt bằng cách dùng một
vòng đầy chất cấy đã được nuôi ấm và đem kiểm tra dưới kính hiển vi (6.1.4). Vi
khuẩn Listeria ssp. xuất hiện thưa, dạng que ngắn có chuyển động quay nhẹ hoặc
hỗn loạn.
Các chủng vi khuẩn mọc ở nhiệt độ trên 25oC
có thể không cho thấy chuyển động này. Phải luôn luôn so sánh với một chủng vi
khuẩn đã biết trước. Các dạng cầu, trực khuẩn lớn, hoặc các trực khuẩn chuyển
động nhanh, dạng bơi thì không phải Listeria ssp.
Một phép tử bổ sung về tính chuyển động bằng
cách dùng kim cấy (6.1.8) cấy sâu vào môi trường di động (5.2.7) bằng cách lấy
từ một khuẩn lạc điển hình trên TSYEA (9.4.2) và nuôi trong tủ ấm (6.1.4) ở 25oC
trong 48h.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.4.4.2. Tiến hành thử về phản ứng Gram từ
một khuẩn lạc điển hình trên môi trường TSYEA (9.4.2). Listeria ssp. là loại
trực khuẩn Gram dương.
9.4.5. Đặc tính phân giải máu
Nếu các đặc tính hình thái, sinh lý học và
phản ứng catalaza cho thấy có khả năng có Listeria ssp., thì cấy lên các đĩa
thạch máu (5.2.5) để xác định phản ứng haemolytic.
Làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng. Vạch
các ô hình lưới trên đáy đĩa Petri từ 20 đến 25 ô trên một đĩa. Lấy một khuẩn
lạc điển hình trên đĩa TSYEA và dùng kim cấy (6.1.8) chấm vào mỗi ô một khuẩn
lạc. Đồng thời chấm các chủng kiểm tra dương tính và âm tính (L.monocytogenes,
L.ivanivii và L.innocua).
Sau khi nuôi ấm (6.1.3) ở 37oC
trong 48h, kiểm tra các chủng từ mẫu thử và chuẩn so sánh. L.monocytogenes cho
các vùng sáng, trong và hẹp (kiểm tan máu );
L.innocua có thể cho vùng không trong xung quanh vết chấm. L.ivanovii thường
cho các vùng vạch trong, rộng, của kiểm tan máu .
Đặt các đĩa vào vùng rọi sáng để so sánh các chủng xét nghiệm với chuẩn so
sánh.
9.4.6. Các phép thử khẳng định sinh hóa tiếp
theo
Sử dụng chất cấy trong TSYEB (9.4.4.1).
9.4.6.1. Sử dụng hidrat cacbon
Cấy vào mỗi ống canh thang lên men hidrat
cacbon (5.2.6) một vòng que cấy đầy, hoặc 0,1ml từ chủng nuôi ở TSYEB (9.4.6).
Nuôi ấm (6.1.3) ở 37oC trong 7 ngày. Các phản ứng dương tính (sinh
axit) cho màu vàng và phần lớn xẩy ra trong vòng từ 24g đến 48h.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Ria cấy các chủng S.aureus và R. equi thành
những vạch đơn ngang đĩa thạch máu (5.2.5 hoặc 5.2.8) sao cho hai vệt cấy này
song song và cân đối nhau trên đĩa (xem hình 3). Vết cấy cần phải mảnh, và đều
đặn được thực hiện bằng cách giữ kim cấy (6.1.8) hoặc vòng cấy (6.1.7) ở các độ
vuông góc so với mặt thạch.
Ria cấy chủng xét nghiệm theo cách tương tự,
vuông góc với các vệt cấy trên sao cho chủng xét nghiệm và các chủng cho phản
ứng không chạm nhau nhưng phải rất gần nhau, cách nhau từ 1 mm đến 2mm. Một vài
chủng xét nghiệm có thể được ria cấy trên cùng một đĩa thạch.
Đồng thời, ria cấy các chủng đối chứng từ
L.monocytogenes, L.innocua và L.ivanivii. Nếu dùng thạch máu (5.2.5), thì nuôi
ấm các đĩa (6.1.3) ở 37oC từ 18 đến 24h. Nếu dùng đĩa lớp kép thì
nuôi ấm các đĩa từ 12h đến 18h.
Vùng phân giải máu ở
điểm giao nhau của chủng xét nghiệm và S.aureus tăng lên thì được coi là phản
ứng dương tính.
Phản ứng dương tính với R.equi cho thấy 1
quầng tan máu rộng (5mm đến 10 mm) “hình đầu mũi tên”. Nó được thấy như một
vùng tròn nhỏ từ quầng tan máu lan rộng hơn chỉ khoảng 2 mm so với chủng xét nghiệm
và nằm trong vùng tan máu yếu do sự phát triển của chủng S. aureus. Một phản ứng
tương tự có thể được thấy ở điểm giao nhau của chủng xét nghiệm với R.equi,
nhưng được coi là âm tính. Các vùng tan máu rộng không xuất hiện xung quanh vệt
cấy của chủng S. aureus.
Hình. 3 – Cấy các đĩa
thử CAMP
Chú thích
1) Cấy các đĩa thạch máu lớp mỏng như sơ đồ
trên. Các vạch thẳng đứng biểu thị các vệt cấy của các chủng S.aureus (S) và
R.equi (R). Các đường ngang biểu thị các vệt cấy của chủng xét nghiệm. Các vùng
gạch chéo cho thấy các vị trí quầng tan máu tăng lên.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.5. Diễn giải các đặc tính hình thái và sinh
lý, và phản ứng sinh hóa (xem bảng 1)
Tất cả các chủng Listeria spp. đều là các
trực khuẩn nhỏ, Gram dương (chỉ với các mẫu cấy 24h tuổi) có tính chuyển động
trong tiêu bản ướt và trong môi trường di động. Chúng là các chủng Listeria
spp. catalaza dương tính. L.monocytogens chuyển hóa ramnoza nhưng không chuyển
hóa xyloza. L.monocytogens, L.ivanovii và L.seeligeri (phản ứng yếu) tạo tan
máu khi cấy trong thạch máu. Lấy khuẩn
lạc này để kiểm tra tính tan máu ở mặt dưới khuẩn lạc. Trong ba chủng Listeria
spp. làm tan máu. chỉ có L.monocytogens không chuyển hóa xyloza và dương tính
với ramnoza.
Bảng 1 – Các phản ứng
nhận biết Listeria ssp.
Các loài
Sinh axit
Thử CAMP
Ramnoza
Xyloza
S. aureus
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
L.monocytogens
+
-
+
-
L.innocua
v
-
-
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
L.ivanovii
-
+
-
+
L.seeligeri
-
+
(+)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
L.welshimeri
v
+
-
-
L.grayi
-
-
-
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
L.murrayi
v
-
-
-
v = phản ứng có thể thay đổi
(+) = phản ứng yếu
+ = Phản ứng dương tính
- = không phản ứng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
L.ivanovii phản ứng với R.equi nhưng không
phản ứng với S. aureus. Các chủng Listeria ssp. khác cho phản ứng CAMP âm tính
với cả hai chủng phản ứng trên.
9.6. Khẳng định cuối cùng
Các chủng được coi là Listeria ssp. (9.5) có
thể gửi tới phòng thí nghiệm chứng nhận Listeria để định danh.
Mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải kèm theo
tất cả các thông tin có liên quan đến các chủng này.
Chú thích
6) Đối với sữa nguyên liệu đôi khi cho thấy
việc cấy truyền vào canh thang tăng sinh sau khi nuôi ấm 24h và 48h có thể tăng
độ nhạy của phương pháp.
7) Phương pháp này cho thấy kém nhạy hơn đối
với một vài phomat vệt đỏ và phomat xanh so với các sản phẩm khác (thí dụ, độ
nhạy của phương pháp này đối với phomat Limburger kém đi ở mật độ
L.monocytogens nhỏ hơn 2/g). Đối với vài loại phomat nhất định, việc nuôi ấm
canh thang tăng sinh nên kéo dài tới 7 ngày. Nên cấy các đĩa môi trường phân
lập khi canh thang tăng sinh đã được nuôi ấm 48h và cả sau 7 ngày.
8) Thạch palcam (xem tiêu chuẩn trích dẫn) có
thể dùng để làm môi trường phân lập bổ sung cho môi trường Oxford. Nên chuẩn bị
các đĩa theo hướng dẫn của các nhà sản xuất và nuôi ấm ở 37oC trong
48h trong tủ ấm (6.1.3). Các khuẩn lạc thuộc chủng Listeria ssp. có đường kính
khoảng 2 mm và được bao quanh bởi 1 quầng đen trên nền môi trường đỏ.
9) Phương pháp này cũng có thể dùng để phát
hiện L.monocytogens trong các mẫu lấy tại nơi sản xuất. Tuy nhiên, chưa có sự
phối hợp nào để đánh giá khả năng xuất hiện vi sinh vật này trong các mẫu thử
như vậy.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Để kiểm tra tính năng của môi trường tăng
sinh và môi trường nhận biết, nhằm đảm bảo cho việc phát triển L.monocytogens,
một dung dịch pha loãng mẫu chuẩn từ chủng mới phân lập cần được cấy vào một
bình kiểm tra có chứa môi trường tăng sinh (xem 9.2). Thêm từ 10 tế bào đến 100
tế bào L.monocytogens / một bình.
Tiến hành với các bình kiểm tra giống như đối
với mẫu cấy xét nghiệm để chứng minh rằng chủng kiểm tra dương tính mọc được.
10. Biểu thị kết quả
Theo diễn giải về đọc kết quả, báo cáo sự có
mặt hay không Listeria monocytogens trong phần mẫu thử, ghi rõ mẫu thử theo
khối lượng bằng gam, hoặc theo thể tích bằng mililít.
11. Báo cáo kết quả
Báo cáo kết quả phải ghi rõ
- Phương pháp lấy mẫu, nếu biết,
- Phương pháp sử dụng,
- Kết quả thử nghiệm thu được, và,
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Cũng cần phải đề cập đến tất cả các chi tiết
thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với
mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.
Báo cáo kết quả cũng bao gồm các thông tin
cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử.
PHỤ
LỤC A
(qui định)
Lưu ý về an toàn
A.1. Các qui trình được nêu trong tiêu chuẩn
này chỉ được thực hiện trong các phòng thí nghiệm có các điều kiện thích hợp và
dưới sự kiểm tra của nhà vi sinh vật học có chuyên môn.
A.2. Các qui trình này không được tiến hành
trong các phòng thí nghiệm kiểm tra chất lượng, hay tại các cơ sở sản xuất hay
chế biến thực phẩm, nơi có nguy cơ nhiễm bẩn từ môi trường.
A.3. Phải luôn thực hiện đầy đủ các lưu ý về
vi khuẩn học trong suốt quá trình tiến hành qui trình qui định trong tiêu chuẩn
này. Phải đặc biệt chú ý tới việc khử trùng các thiết bị đã sử dụng và môi
trường sau khi kiểm tra mẫu có nghi ngờ và trước khi loại bỏ hay tái sử dụng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
PHỤ
LỤC B
(thm khảo)
[1] TCVN 6400 : 1998 (ISO 707 : 1998) Sữa và
sản phẩm sữa – Phương pháp lấy mẫu.
[2] VANNETTEN, P., PERALES, l.,CURTIS, G.D.W.
và MOSSEI, D.A.A. Môi trường lỏng và môi trường phân lập chọn lọc để phát hiện
và định lượng Listeria monocytogens. Tạp chí quốc tế về vi sinh vật học thực
phẩm, 8,1989, trang 299-316.
1) Có thể dùng ống nhiệm có nắp đậy làm
bằng thủy tinh