Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6686-1:2000 sữa - định lượng tế bào xôma

CHÚ THÍCH – Bằng cách khác, có thể thay tetracloetan bằng một lượng tricloetan tương tự. Có thể dùng ethidi bromua thay cho xanh metylen [Xem TCVN 6686-3:2000 (ISO 13366-3)].

4.1.2. Chuẩn bị

Trộn etanol và tetracloetan trong lọ. Làm nóng trong nồi cách thủy (5.1) ở 65^oC. Thêm xanh metylen vào và trộn kỹ. Làm lạnh trong tủ lạnh đến 4^oC và sau đó cho thêm axit axetic băng. Rót dung dịch này vào một lọ kín qua phễu lọc thích hợp (5.3) và bảo quản trong lọ nút kín này. Nếu cần, trước khi sử dụng lọc lại dung dịch.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị phòng thí nghiệm thông thường và đặc biệt như sau:

5.1. Nồi cách thủy, có thể duy trì ở 65^oC ± 5^oC.

5.2. Nồi cách thủy, có thể duy trì ở 35^oC ± 5^oC.

5.3. Phễu lọc, bền với các dung môi sử dụng, có kích thước lỗ từ 10 mm đến 12 mm hoặc nhỏ hơn.

5.4. Kính hiển vi, có độ khuyếch đại từ 500 đến 1 000 lần.

...

...

...

5.5. Microxilanh, dung tích 0,01 ml, có dung sai tối đa là 2%.

5.6. Phiến kính, được đánh dấu bằng đường viền theo hình màng phim có kích thước 20 mm x 5 mm, hoặc một phiến kính chuẩn và một bản mẫu có kích thước 20 mm x 5 mm.

5.7. Bếp điện, có thể duy trì ở 40^oC ± 10^oC.

5.8. Quạt gió, loại máy sấy tóc.

6. Lấy mẫu

6.1. Điều quan trọng là phòng thí nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 : 1998 (ISO 707).

6.2. Nếu sử dụng bộ lấy mẫu tự động, thì chúng phải được kiểm tra một cách chính xác.

6.3. Trước khi thử nghiệm hoặc lưu giữ, phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2^oC đến 6^oC.

6.4. Nếu các mẫu không được thử ngay trong vòng 6 h kể từ khi lấy mẫu, thì bảo quản bằng cách bổ sung axit boric. Nồng độ cuối cùng của axit này có trong mẫu thử không được lớn hơn 0,6 g trong 100 ml mẫu. Bảo quản các mẫu đó ở nhiệt độ từ 2^oC đến 6^oC không quá 24 h.

...

...

...

Làm nóng mẫu tử trong nồi cách thủy (5.2) ở nhiệt độ 35^oC. Trộn kỹ mẫu thử và làm nguội đến nhiệt độ của microxilanh đã được hiệu chuẩn, thí dụ ở 20^oC.

8. Cách tiến hành

Chuẩn bị và đếm từ mỗi mẫu ít nhất hai màng phim. Làm sạch các phiến kính (5.6), thí dụ như rửa bằng etanol. Dùng giấy sạch thấm khô phiến kính, hơ trên lửa và để nguội.

8.1. Phần mẫu thử và chuẩn bị lớp màng phim

Dùng microxilanh (5.5) lấy 0,01 ml mẫu thử đã chuẩn bị (điều 7). Khi microxilanh đã tiếp tục với mẫu thì cẩn thận làm sạch mặt ngoài của xilanh. Cho phần mẫu thử lên một phiến kính sạch có đường viền 20 mm x 5 mm (5.6). Sau đó dàn càng đều mẫu càng tốt. Hơ khô màng này trên bếp điện (5.7) cho đến khô hoàn toàn. Có thể thu được kết quả tốt hơn, nếu để chúng khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.

Nhúng màng phim đã khô trên phiến kính vào dung dịch nhuộm màu (4.1) trong 10 phút. Nếu cần, dùng quạt gió (5.8) để làm khô. Sau đó nhúng màng vào nước cho đến khi thôi hết thuốc nhuộm sót lại. Hơ khô lại và bảo quản tránh bụi.

8.2. Tiến hành xác định

Đếm các tế bào có nhân (ít nhất 400) trên màng phim qua kính hiển vi (5.4)). Các tế bào này có thể được quan sát rõ và ít nhất phải thấy được một nửa trong hiển vi trường. Đếm các nhân có trong các dải thẳng đứng ở phần thứ ba nằm giữa màng. Tránh đếm nhầm các dải tập trung ở khu vực ngoại biên của màng.

9. Tính và biểu thị kết quả

...

...

...

Trong đó

d là đường kính của hiển vi trường, tính bằng milimet;

b là số dải đếm được.

9.2. Số lượng tế bào xôma nhân với hệ số làm việc, w_f, để có được số lượng tế bào trong một mililit mẫu.

10. Độ chính xác

10.1. Độ lặp lại và độ tái lập

Phụ lục B của TCVN 6686-3:2000 (ISO 13366-3) đưa ra các khuyến cáo về quy trình kiểm tra chất lượng và thử nghiệm của liên phòng thí nghiệm.

10.2. Số lượng tế bào tối thiểu cần đếm

...

...

...

Để thỏa mãn yêu cầu này, số lượng tế bào xôma cần đếm trong từng mẫu ít nhất phải là 400. Phân bố Poisson giả định là

M = V = S_d²

Trong đó

M là giá trị trung bình;

V là độ biến thiên;

s_d là độ lệch chuẩn.

Hệ số biến thiên (CV) là

 hoặc

 hoặc

...

...

...

Trong đó M là giá trị trung bình, trong trường hợp đếm số tế bào xôma là số lượng các hạt (tế bào) đếm được.

11. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả phải chỉ rõ:

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp sử dụng;

- hệ số làm việc của kính hiển vi;

- kết quả thử nghiệm thu được, và

- nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Cũng phải đề cập đến tất cả các các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

...

...

...

PHỤ LỤC A

(tham khảo)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 : 1998 (ISO 707 : 1997) Sữa và sản phẩm sữa – Các phương pháp lấy mẫu.

[2] TCVN 6686 - 2 : 2000 (ISO 13366-2) Sữa – Định lượng tế bào xôma. Phần 2 – Phương pháp đếm hạt điện tử.

[3] TCVN 6686 - 3 : 2000 (ISO 13366-3) Sữa – Định lượng tế bào xôma. Phần 3 – Phương pháp huỳnh quang điện tử.