Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11131:2015 về Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi

• Số hiệu: TCVN11131:2015
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2015

Chất phản ứng	Nồng độ cuối cùng	Thể tích từng mẫu (ml)
Plasmit pSC17	10 000 bản sao ~6 pg	2,0
Nước		31,8
Dung dịch đệm PCR 10x (không có MgCI2)	1x	5,0
Dung dịch MgCI2^a, 25 mmol/l	2,5 mmol/l	5,0
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l	0,2 mmol/l	1,0
Mồi M13 (-26), 5 mmol/l	0,25 mmol/l	2,5
Mồi M13 (-20), 5 mmol/l	0,25 mmol/l	2,5
Taq-ADN-polymerase, 5 U/ml	1 đơn vị cho một phản ứng	0,2
^a Nếu dung dịch đệm PCR chứa sẵn MgCl2, thì nồng độ cuối cùng của MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng phải được điều chỉnh cho đúng 2,5 mmol/l.

A.5.1.2. Chương trình thời gian nhiệt độ

Chương trình thời gian nhiệt độ được nêu trong Bảng A.2.

Chương trình này có thể được thay đổi theo kiểu loại máy chu trình và/hoặc enzym sử dụng.

Bảng A.2 - Chương trình thời gian nhiệt độ

Biến tính ban đầu

2 min/95 ^oC

Khuếch đại

10 s/95 ^oC

...

...

...

20 s/72 ^oC

Số chu trình

40

Kéo dài cuối cùng

2 min/72 ^oC

A.5.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR và xác định kết quả

Một lượng 5 ml của sản phẩm PCR được tách bằng điện di trên gel agarose và được nhuộm với etidi bromua để hiển thị sản phẩm PCR. Số thể tích sản phẩm còn lại sẽ được tinh sạch và kết quả được xác định bằng đo quang phổ hoặc phương pháp phù hợp bất kỳ^[2].

A.5.1.4. Chuẩn bị các nồng độ khuôn mẫu

...

...

...

Các sản phẩm PCR được chuẩn bị trong nước ở 3 dung dịch có nồng độ khác nhau: 1 000 bản sao/ml, 100 bản sao/ml và 10 bản sao/ml.

Các nồng độ ADN đích được mã hóa như sau:

- a = 1 000 bản sao/ml (tương ứng với 5 000 bản sao cho một PCR);

- b = 100 bản sao/ml (tương ứng với 500 bản sao cho một PCR);

- c = 10 bản sao/ml (tương ứng với 50 bản sao cho một PCR).

A.5.2. Kiểm tra máy chu trình nhiệt

A.5.2.1. Cài đặt PCR

Phương pháp này sử dụng thể tích PCR cuối cùng là 50 ml cho một phản ứng. Chất phản ứng và nồng độ cuối được nêu trong Bảng A.3.

Sử dụng ít nhất 16 phản ứng PCR cho máy chu trình nhiệt 96 giếng.

...

...

...

- chuẩn bị hỗn hợp PCR;

- chia hỗn hợp PCR ra làm 3 phần và 1 kiểm soát âm tính;

- thêm ADN đích ở 3 nồng độ khác nhau vào 3 phần để tạo hỗn hợp đích PCR.

- chia mỗi hỗn hợp đích PCR ra làm 5 phần sao chép và đưa tất cả vào đĩa đựng mẫu trong máy chu trình nhiệt ở những vị trí xác định.

Bảng A.3 - Chất phản ứng bổ sung

Thuốc thử

Nồng độ cuối cùng

Thể tích cho một mẫu (ml)

Thể tích khuyến cáo cho 16 mẫu (ml)

...

...

...

24,78

401,48^b

Dung dịch đệm PCR 10x (không chứa MgCl₂)

1x

5,0

80,0

Dung dịch MgCI₂^a, 25 mmol/l

3 mmol/l

...

...

...

96,0

Dung dịch dNTP, 10 mmol/l

0,2 mmol/l

1,0

16,0

Mồi VAL1, 5mmol/l

0,4 mmol/l

4,0

64,0

...

...

...

0,4 mmol/l

4,0

64,0

Taq-ADN-polymerase, 5 U/ml

1,1 đơn vị cho một phản ứng

0,22

3,52

^a Nếu dung dịch đệm PCR đã chứa MgCl₂, thì nồng độ cuối cùng của MgCl₂ trong hỗn hợp phản ứng phải được điều chỉnh đến 3 mmol/I.

^b Thay nước cho 16 phản ứng và 5 ml cho kiểm chứng dương (5 ml khuôn mẫu được thay thế bởi 5 ml nước).

...

...

...

Hình A.2 - Sơ đồ các ống PCR để kiểm tra máy chu trình nhiệt 96 giếng

A.5.2.2. Chương trình thời gian nhiệt độ

Chương trình thời gian nhiệt độ nêu trong Bảng A.4.

Bảng A.4 - Chương trình thời gian nhiệt độ

Biến tính ban đầu

2 min/95 ^oC

Khuếch đại

10 s/95 ^oC

...

...

...

20 s/63 ^oC

20 s/72 ^oC

Số chu trình

40

Kéo dài cuối cùng

5 min/72 ^oC

A.5.3. Phát hiện

A.5.3.1. Yêu cầu chung

...

...

...

A.5.3.2. Chuẩn bị thạch agarose, điện di và nhuộm

Cân một lượng agarose thích hợp (A.3.8) trộn với dung dịch đệm điện di (A.3.19 hoặc A.3.20) để có được nồng độ cuối cùng ρ = 20 g/l. Lớp gel không được dày quá 1cm.

Trộn 5 ml từng sản phẩm PCR với khoảng 1 ml dung dịch đệm để chạy mẫu (A.3.21) và cho vào gel.

Cho marker khối lượng phân tử vào một giếng riêng.

Tiến hành điện di ở nhiệt độ phòng. Sử dụng điện thế phù hợp để giữ điện thế ổn định tối đa là 5 V/cm giữa các điện cực.

Sau khi điện di hoàn tất, ủ gel ít nhất 30 min trong dung dịch etidi bromua (A.3.22) ở nhiệt độ phòng, ở nơi tối.

Có thể sử dụng các phương pháp nhuộm gel agarose khác nếu cho kết quả tương đương.

Chuyển thạch gel vào để soi bằng đèn cực tím (A.4.4). Bật đèn cực tím và ghi lại huỳnh quang của ADN bằng việc chụp ảnh hoặc quay phim.

A.6. Diễn giải kết quả

...

...

...

Nếu trong tất cả các mẫu thử phát hiện được sản phẩm khuếch đại là các cặp base 116, thì sai số nhiệt độ gắn mồi ở 63 ^oC là nhỏ hơn 3 ^oC. Nếu không thấy sản phẩm nào, thì hoặc là có sự vượt quá nhiệt độ hoặc biến tính không đủ. Cả hai trường hợp này là do việc kiểm soát chương trình nhiệt độ trong máy chu trình nhiệt không được tốt.

Việc diễn giải kết quả được nêu trong Bảng A.5.

Bảng A.5 - Diễn giải kết quả

Số lượng bản sao

Hiệu năng chấp nhận được: sản phẩm phát hiện thấy

Hiệu năng không chấp nhận được: sản phẩm không phát hiện

5 000

5 trên 5

< 5 trên 5

...

...

...

5 trên 5

< 5 trên 5

50

£ 5 trên 5^a

^a Các phản ứng với 50 bản sao cho 1 phản ứng có thể cho ra các dải ADN nhạt

Trong trường hợp kết quả hiệu năng không chấp nhận được (xem bảng A.5), thì cần kiểm tra lại. Nếu kết quả được xác nhận, thì hiệu năng của máy chu trình nhiệt là có vấn đề và thiết bị phải được kiểm tra hiệu năng vật lý.

PHỤ LỤC B

...

...

...

KIỂM TRA HIỆU NĂNG VẬT LÝ

B.1. Yêu cầu chung

Đây là phương pháp để kiểm tra chính xác nhiệt độ máy chu trình nhiệt trong các điều kiện hoạt động. Việc kiểm tra này ghi lại nhiệt độ chất lỏng trong ống mẫu.

B.2. Nguyên tắc

Nhiệt độ được đo bằng cặp nhiệt điện hay thiết bị khác có khả năng đo được nhiệt độ ở trong lọ có chứa nước.

Quy trình kiểm tra vật lý được tiến hành trong các điều kiện đang chạy PCR. Theo đó thì quá trình kiểm tra sẽ bao gồm loạt 3 cấp độ nhiệt độ được sử dụng để biến tính, gắn mồi và kéo dài mồi.

Nếu như máy chu trình nhiệt có nắp đậy, thì việc đo phải tiến hành khi nắp được đậy.

B.3. Chất phản ứng

B.3.1. Nước

...

...

...

B.4.1. Máy chu trình nhiệt

B.4.2. Thiết bị ghi nhiệt độ: đầu dò ghi nhiệt độ, dây dẫn và các thiết bị đo nhiệt độ.

Định kỳ hiệu chuẩn bộ phận đo nhiệt độ đối với dải nhiệt độ sử dụng.

B.5. Cách tiến hành

B.5.1. Bố trí phép thử

Đặt đầu dò nhiệt độ tại các vị trí đại diện cho dải kiểm soát nhiệt độ. Việc chọn vị trí tới hạn phải được cân nhắc cẩn thận. Khi không xác định được vị trí tới hạn thì đặt ngẫu nhiên các cảm biến trong các giếng.

Ví dụ : Đối với máy chu trình 96 giếng, chia số giếng thành 6 vùng bằng nhau. Đặt ít nhất 2 đầu dò nhiệt độ tại mỗi vùng. Do đó có ít nhất 12 điểm nhiệt độ được ghi^[^1^].

B.6. Ghi các giá trị nhiệt độ

Cần cài đặt tần suất ghi nhiệt độ sao cho ít nhất 1 giá trị nhiệt độ được ghi lại cho một vị trí trong một giây ^[1].

...

...

...

Cho mỗi vị trí kiểm tra, tính trung bình giữa điểm nhiệt độ cao nhất và thấp nhất ở điểm thời gian t_o (điểm thời gian khi chương trình nhiệt độ bắt đầu) và t_x (điểm thời gian lúc chương trình nhiệt độ kết thúc) cho các bước biến tính, gắn mồi và kéo dài ^[^1^].

B.7. Giải thích kết quả

Khảo sát nghiên cứu nhiệt độ ở vị trí cao nhất và thấp nhất. Cả 2 nhiệt độ này phải hoặc nằm trong dải nhiệt độ ghi của máy hoặc nếu không có quy định về độ chính xác của nhiệt độ, thì không được sai lệch lớn hơn 0,5 ^oC so với nhiệt độ chương trình. Nhiệt độ phải nằm trong dải quy định đối với mỗi bước trong chu trình và trong quá trình chạy.

Không sử dụng các máy chu trình nhiệt không đảm bảo được các điều kiện trên.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] SCHODER D., SCHMALWIESER A., SCHAUBERGER G., KUHN M., HOORFAR J. and WAGNER M. Physical characteristics of six new thermocyclers. Clin. Chem., 49, 6, 2003, pp. 960-963

[2] HEATON P.A. Quantification of total DNA by spectroscopy. In: Analytical Molecular Biology: Quality and Validation, ed. Sauders G. S and Parker H.C., RCS publications, 1999, UK

1) Đây là ví dụ về sản phẩm thich hợp có bán sẵn. Thông tin này được đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn mà không ấn định sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương đương.