Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7905-1:2008 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

• Số hiệu: TCVN7905-1:2008
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2008

Các phép thử (môi trường chứa 1 % NaCl)	V. cholerae^a	V. parahaemolyticus^a
Oxidaza	+	+
Sinh khí (glucoza)	-	-
Lactoza	-	-
Sacaroza	+	-
ODC	+	+
LDC	+	+
ADH	-	-
Thủy phân ONPG	+
Sinh indol	+	+
Phát triển trong nước pepton với
0 % NaCl	+	-
2 % NaCl	+	+
6 % NaCl	-	+
8 % NaCl	-	+
10 % NaCl	-	-
^a Dấu + nghĩa là từ 76 % đến 89 % dương tính

CHÚ THÍCH: Các phản ứng nêu trong Bảng 1 là để hướng dẫn nhận dạng các loài đã liệt kê. Các phép thử kiểu hình bổ sung là cần thiết để phân biệt đầy đủ giữa loài này với loài khác và giữa các loài của Vibrio không gây bệnh với các sinh vật âm tính Gram lên men khác như Aeromonas spp. Vibrio minicus, các loại gây bệnh nêu trong TCVN 7905-2 (ISO/TS 21872-2), cho phản ứng với V. cholerae trong dãy các phép thử này, trừ phép thử âm tính sacaroza.

9.5.4.10. Khẳng định từng bước (nếu cần)

Thực hiện các phép thử để kiểm tra sự phát triển trong dung dịch nước muối pepton 10 % (5.11) và argin dihydrolaza (5.8), sử dụng các dung dịch cấy đã chọn trong 9.5.3.3. Tiếp tục bằng các phép thử khẳng định khác trên bất kỳ khuẩn lạc nào cho thấy không phát triển trong dung dịch nước muối pepton 10 % và cho phản ứng âm tính arginin dihydrolaza.

CHÚ THÍCH: Nên cấy truyền vào dung dịch nước muối pepton 2 % hoặc cấy truyền vào thạch muối dinh dưỡng tạo cùng một thời điểm để chắc chắn rằng “không phát triển” trong dung dịch nước muối pepton 10 % không phải vì cấy dịch cấy đã hỏng.

9.5.5. Khẳng định việc nhận dạng bằng sinh hóa và xác định các yếu tố gây bệnh

Việc nhận dạng sinh hóa của Vibrio là rất khó, tốt nhất để khẳng định chính xác các chủng V. choleae hoặc V. parahaemolyticus bằng cách gửi đến phòng thử nghiệm chuẩn/chuyên dùng.

Để vận chuyển chúng, cấy vào bề mặt nghiêng của thạch dinh dưỡng muối (5.3).

Ngoài ra, không phải tất cả các chủng V. choleae hoặc V. parahaemolyticus đều là loài gây bệnh. Để xác nhận các đặc trưng gây bệnh của các chủng, tốt nhất là thử huyết thanh đối với V. cholerae (ít nhất là để xác định xem chúng thuộc nhóm huyết thanh O1 hay O139) và để phát hiện xem có sản sinh độc tố hay không hoặc gen mang tính độc của V. cholerae và haemolyzin hoàn toàn bền nhiệt (TDH) hoặc gen haemolyzin liên quan đến TDH đối với V. parahaemolyticus. Các phép thử này cần được phòng thử nghiệm chuyên dụng thực hiện. Cần lưu ý rằng tỷ lệ các chủng gây bệnh trong môi trường và trong các mẫu thực phẩm thường thấp (đối với V. parahaemolyticus chúng thường chiếm khoảng 1 % tổng V. parahaemolyticus có trong mẫu) và do đó khả năng phát hiện các chủng gây bệnh bằng cách cấy truyền một lượng nhỏ các khuẩn lạc để nhận dạng và khẳng định là rất thấp.

10. Biểu thị kết quả

...

...

...

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- mọi sai lệch liên quan đến môi trường tăng sinh hoặc điều kiện ủ đã sử dụng;

- mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- các kết quả thử nghiệm thu được, đặc biệt là khả năng gây bệnh của các chủng phân lập đã khẳng định;

Báo cáo thử nghiệm cũng phải nêu rõ dương tính có thu được hay không khi sử dụng chỉ một môi trường phân lập (5.2) không được quy định trong tiêu chuẩn này.

...

...

...

(quy định)

SƠ ĐỒ CÁCH TIẾN HÀNH

PHỤ LỤC B

(quy định)

Thành phần và chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử

B.1. Dung dịch pepton muối kiềm (ASPW)

B.1.1. Thành phần

Pepton

...

...

...

Natri clorua (NaCl)

20,0 g

Nước

1 000 ml

B.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25 ^0C, nếu cần.

Phân phối môi trường với các lượng cần thiết cho phép thử vào các bình cầu hoặc ống có dung tích thích hợp (9.1 và 9.3.1). Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ^0C.

B.2. Thạch sacaroza, mật, xitrat thiosulfat (TCBS)

B.2.1. Thành phần

...

...

...

10,0 g

Dịch chiết nấm men

5,0 g

Natri xitrat

10,0 g

Natri thiosulfat

10,0 g

Sắt (III) xitrat

1,0 g

...

...

...

10,0 g

Mật bò khô

8,0 g

Sacaroza

20,0 g

Bromothymol xanh

0,04 g

Thymol xanh

0,04 g

...

...

...

Từ 8,0 đến 18 g ^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun đến sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25 ^0C, nếu cần. Không hấp áp lực.

B.2.3. Chuẩn bị các đĩa thạch

Phân phối các lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường vừa mới chuẩn bị, làm nguội đến khoảng 50 ^0C, vào các đĩa Petri và để yên cho đông đặc.

...

...

...

B.2.4. Kiểm chứng môi trường

Xem ISO/TS 11133 về các hướng dẫn.

Thực hiện ước tính hiệu quả của thạch đổ đĩa đối với mỗi mẻ TCBS sử dụng thạch dinh dưỡng muối (SNA) làm môi trường so sánh và các chủng sau đây:

- V. parahaemolyticus:               NCTS 10885;

- V. furnissit:                             NCTC 11218;

- Escherichia coli:                      ATCC 25922, 8739 hoặc 11775.

Hiệu quả thạch đổ đĩa được tính bằng công thức sau đây:

Trong đó N là số lượng khuẩn lạc đếm được.

...

...

...

B.3. Thạch dinh dưỡng muối (SNA)

B.3.1. Thành phần

Dịch chiết thịt

5,0 g

Pepton

3,0 g

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Thạch

...

...

...

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khó trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25 ^0C, nếu cần.

Chuyển môi trường này vào các vật chứa có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ^0C.

B.3.3. Chuẩn bị các đĩa môi trường thạch dinh dưỡng muối

Phân phối các lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường và làm nguội đến khoảng 50 ^0C, vào các đĩa Petri và để yên cho đông đặc.

Ngay trước khi sử dụng, làm khô cẩn thận các đĩa thạch (tốt nhất là mở nắp và lật úp đĩa) cho đến khi mặt thạch khô.

...

...

...

Phân phối khoảng 10 ml môi trường đã làm nguội đến khoảng 50 ^0C vào các ống có dung tích thích hợp.

Để nghiêng ống cho đông đặc.

B.4. Thuốc thử phát hiện oxidaza

B.4.1. Thành phần

N, N, N’N’ - Tetrametyl-r-phenylendiamin dihydroclorua

1,0 g

Nước

100 ml

B.4.2. Chuẩn bị

...

...

...

B.5. Thạch, sắt, ba đường và muối (TSI)

B.5.1. Thành phần

Pepton

20,0 g

Dịch chiết thịt

3,0 g

Dịch chiết nấm men

3,0 g

Natri clorua (NaCl)

...

...

...

Lactoza

10,0 g

Sacaroza

10,0 g

Glucoza

1,0 g

Sắt (III) xitrat

0,3 g

Đỏ phenol

...

...

...

Thạch

Từ 8 g đến 18 g ^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 ^0C, nếu cần.

Phân phối môi trường này với các lượng 10 ml cho vào ống có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ^0C.

Để yên ở tư thế nghiêng cho đông đặc, sao để thu được khoảng 2,5 cm chiều sâu ống.

...

...

...

B.6. Môi trường muối để phát hiện Ornithin decarboxylaza (ODC)

B.6.1. Thành phần

L-Ornithin monohydroclorua

5,0 g

Dịch chiết nấm men

3,0 g

Glucoza

1,0 g

Bromocresol tía

...

...

...

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Nước

1 000 ml

B.6.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 ^0C, nếu cần.

Phân phối môi trường này với các lượng từ 2 ml đến 5 ml vào các ống nhỏ. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ^0C.

B.7. Môi trường muối để phát hiện lysin decarboxylaza (LDC)

B.7.1. Thành phần

...

...

...

5,0 g

Dịch chiết nấm men

3,0 g

Glucoza

1,0 g

Bromocresol tía

0,015 g

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

...

...

...

1 000 ml

B.7.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH 6,8 ± 0,2 ở 25 ^0C, nếu cần.

Phân phối môi trường này với các lượng từ 2 ml đến 5 ml vào các ống hẹp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ^0C.

B.8. Môi trường để phát hiện arginin dihydroxylaza (ADH)

B.8.1. Thành phần

L-Arginin monohydro clorua

5,0 g

Dịch chiết nấm men

...

...

...

Glucoza

1,0 g

Bromocresol tía

0,015 g

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Nước

1 000 ml

B.8.2. Chuẩn bị

...

...

...

Phân phối môi trường này với các lượng từ 2 ml đến 5 ml vào các ống hẹp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ^0C.

B.9. Thuốc thử phát hiện b-galactoxidaza

B.9.1. Dung dịch ONPG

B.9.1.1. Thành phần

2-orto-nitrophenyl-b-D-galactopyranosid (ONPG)

0,08 g

Nước

15 ml

B.9.1.2. Chuẩn bị

...

...

...

B.9.2. Dung dịch đệm

B.9.2.1. Thành phần

Natri dihydro phosphat (NaH₂PO₄)

6,9 g

Natri hydro (NaOH) (dung dịch 0,1 mol/l)

Xấp xỉ 3 ml

Nước, lượng đủ cho thể tích cuối cùng

50 ml

B.9.2.2. Chuẩn bị

...

...

...

Chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25 ^0C bằng dung dịch natri hydroxit. Thêm nước đến 50 ml.

B.9.3. Thuốc thử hoàn chỉnh

B.9.3.1. Thành phần

Dung dịch đệm (B.9.2)

5 ml

Dung dịch ONPG (B.9.1)

15 ml

B.9.3.2. Chuẩn bị

Cho dung dịch đệm vào dung dịch ONPG. Bảo quản dung dịch này ở nhiệt độ từ 0 ^0C đến 5 ^0C.

...

...

...

B.10.1. Môi trường muối tryptophan

B.10.1.1. Thành phần

Sản phẩm thủy ngân casein hàng enzym

10,0 g

DL-Tryptophan

1,0 g

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Nước

...

...

...

B.10.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần và lọc. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 ^0C, nếu cần.

Phân phối môi trường này với các lượng 5 ml môi trường này vào các ống có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ^0C.

B.10.2. Thuốc thử Kovacs

B.10.2.1. Thành phần

4-Dimetylaminobenzenzaldehyt

5 g

Axit clohydric, r = 1,18 g/ml đến 1,19 g/ml

25 ml

...

...

...

75 ml

B.10.2.2. Chuẩn bị

Trộn các thành phần trên

B.11. Dung dịch của nước pepton muối

B.11.1. Thành phần

Pepton

10 g

Natri clorua (NaCl)

0 g, 20 g, 60 g, 80 g hoặc 100 g

...

...

...

1000 ml

B.11.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,5 ± 0,2 ở 25 ^0C, nếu cần.

Phân phối môi trường này vào các ống có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ^0C.

B.12. Dung dịch natri clorua

B.12.1. Thành phần

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Nước

...

...

...

B.12.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,5 ± 0,2 ở 25 ^0C.

Phân phối môi trường này vào các ống có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ^0C.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory

[2] ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media.