Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8973:2011 về Thực phẩm - Xác định vitamin D

• Số hiệu: TCVN8973:2011
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2011

Mẫu	Etanol	Pyrogallol	Axit ascorbic/ Natri ascorbat	Kali hydroxit
từ 10 g đến 30 g	100 ml	từ 0,5 g đến 1 g	từ 1,0 g đến 2,5 g	50 ml dung dịch 50 g/100 ml

Khoảng thời gian thông thường của quá trình xà phòng hóa là từ 20 min đến 45 min có nhiệt độ từ 70 °C đến 100 °C. Quá trình xà phòng hóa cũng có thể được thực hiện qua đêm ở nhiệt độ phòng (khoảng 16 h).

Nếu sau khi xà phòng hóa và làm nguội, có chất béo hoặc dầu thực vật nổi trên bề mặt hỗn hợp xà phòng hóa thì cần bổ sung kali hydroxit trong etanol và kéo dài thời gian xà phòng hóa.

CHÚ THÍCH Các điều kiện phù hợp để xà phòng hóa margarin và bột sữa được nêu trong Phụ lục B.

6.3.2. Chiết

Để tránh tạo nhũ, cần bổ sung một lượng nước vào dung dịch mẫu đã xà phòng hóa sao cho tỷ lệ của ancol với nước trong dung dịch là 1:1.

Chiết vitamin D₂ và D₃ ra khỏi hỗn hợp xà phòng hóa đã nguội bằng dung môi thích hợp, hoặc bằng hỗn hợp dung môi (4.8) và lặp lại quy trình này từ hai đến bốn lần, mỗi lần dùng từ 100 ml đến 200 ml. Rửa hỗn hợp của các dịch chiết được bằng nước (thông thường 5 lần, mỗi lần từ 50 ml đến 100 ml) cho đến khi pH trung tính.

CHÚ THÍCH Một số phương pháp quy định rửa đến trung tính bằng kali hydroxit 3 % hoặc 5 % trong dung dịch đệm natri clorua 0,9 % trong natri axetat 2,6 mol/l (pH = 7), hoặc các hỗn hợp tương tự. Phụ lục B đưa ra các điều kiện chiết thích hợp đối với margarin và sữa bột.

6.3.3. Cô đặc

Làm bay hơi các dịch chiết mẫu, bằng máy cô quay (5.3) dưới áp suất giảm và ở nhiệt độ không quá 40 °C. Trước khi làm bay hơi, nên bổ sung chất chống oxi hóa (ví dụ: 2 ml BHT 1 mg/ml trong n-hexan) vào dịch chiết mẫu.

...

...

...

Ở giai đoạn này trong quá trình phân tích, có thể cần làm sạch thêm dịch chiết mẫu để loại bỏ các chất gây nhiễu tiềm tàng. Nếu bổ sung quy trình làm sạch thì quy trình phải được kiểm tra xác nhận đầy đủ.

CHÚ THÍCH Phụ lục E đưa ra ba bước làm sạch bổ sung khác nhau. Bước làm sạch dùng cột sắc ký (E.2) và có sử dụng SPE (E.3) cho thấy có lợi đối với thực phẩm, ví dụ margarin và dầu ăn. Bước làm sạch bằng cách dùng TLC điều chế (E.1) là tốt nhất đối với thức ăn chăn nuôi và các loại thực phẩm bổ sung như viên hoặc viên nang. Đối với các loại bổ sung có thể được kết hợp với E.3, nếu cần.

6.3.4. Pha loãng

Hòa lại cặn trong một lượng nhỏ đã biết của dung môi phù hợp với hệ thống HPLC bán điều chế. Việc bổ sung một lượng nhỏ natri sulfat khan sẽ loại bỏ các vết nước còn sót lại.

6.4. Hiệu chuẩn

Sử dụng các dung dịch chuẩn vitamin D₂ (4.12.1) và vitamin D₃ (4.12.2) để hiệu chuẩn các hệ thống bán điều chế (5.6.1), các hệ thống phân tích HPLC (5.6.2) và đánh giá sự phù hợp.

6.5. Sự phù hợp của hệ thống HPLC

Cho chạy hỗn hợp vitamin D₂ và chất chuẩn vitamin D₃ bán điều chế (4.14) trên hệ thống HPLC bán điều chế (5.6.1) cho đến khi pic của từng vitamin D được phân tách với thời gian lưu ổn định. Khi đã đạt được thì thu lấy phân đoạn của từng vitamin D từ dịch chiết mẫu.

Các điều kiện sắc ký của HPLC bán điều chế phải được điều chỉnh để tách tối ưu vitamin D ra khỏi các tocopherol và các chất gây nhiễu đến chất nền thực phẩm khác. Ví dụ về sắc đồ, xem Phụ lục C.

...

...

...

6.6. Xác định

6.6.1. HPLC bán điều chế

Bơm phần dịch lỏng của dịch chiết mẫu đã cô đặc lên hệ thống HPLC bán điều chế (5.6.1) và thu lấy phân đoạn vitamin D. Khoảng thời gian để thu lấy phân đoạn này phải được xác định trước, dùng chất chuẩn vitamin D (6.5). Thời gian thu được phân đoạn phải đủ dài để thu được tất cả các vitamin D, nhưng không quá dài để giảm khả năng lẫn các tocopherol hoặc các hợp chất gây nhiễu khác.

Sắc đồ bán điều chế điển hình nêu trong Phụ lục C.

6.6.2. Phân tích HPLC

Làm bay hơi phân đoạn thu được từ HPLC bán điều chế đến khô và hòa lại trong dung môi phù hợp với pha động dùng cho HPLC.

Bơm các phần dịch lỏng của dịch chiết mẫu lên hệ thống phân tích HPLC và nhận biết các pic vitamin D₂ và D₃ (6.6.3). Các pic vitamin D₂ và D₃ phải tách ra khỏi chất gây nhiễu nền mẫu.

Sắc đồ phân tích HPLC điển hình được nêu trong Phụ lục C.

6.6.3. Nhận biết

...

...

...

6.6.4. Số lần xác định

Tiến hành ít nhất hai lần xác định độc lập.

6.7. Quy trình nội chuẩn và hệ số đáp ứng

Tính hệ số đáp ứng của vitamin D₃ so với vitamin D₂, R_f, bằng quy trình nội chuẩn, sử dụng chất chuẩn đã biết nồng độ (4.13), theo Công thức (3):

 (3)

Trong đó

A_STD3 là diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với dung dịch chuẩn vitamin D₃;

A_STD2 là diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với dung dịch chuẩn vitamin D₂;

r_STD2 là nồng độ khối lượng của vitamin D₂ trong dung dịch chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

...

...

...

7. Tính kết quả

Tính phần khối lượng của vitamin D₃, W_D3, bằng microgam trên 100 g (mg/100 g), theo Công thức (4):

 (4)

Trong đó

I_s là khối lượng của chất nội chuẩn của vitamin D₂ trong phần mẫu thử, tính bằng microgam (mg);

m là khối lượng của mẫu lấy để xà phòng hóa, tính bằng gam (g);

R_f xem Công thức (3);

A_SD3 là diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với vitamin D₃ trong dung dịch mẫu;

A_SD2 là diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với vitamin D₂ trong dung dịch mẫu.

...

...

...

8.1. Tóm tắt thống kê

Dữ liệu về độ chụm của các phương pháp HPLC khác nhau về xác định vitamin D₃ được thiết lập năm 1994 bởi một nghiên cứu so sánh quốc tế do chương trình Tiêu chuẩn, Đo lường và Thử nghiệm của Ủy ban Châu Âu thực hiện trên mẫu margarin [vật liệu chuẩn đã được chứng nhận (CRM 122)] và sữa bột (CRM 421) và cho thông tin thống kê nêu trong Phụ lục D.

Dữ liệu về độ chụm trên mẫu cháo đặc và sữa bột được thiết lập trong phép thử liên phòng thử nghiệm về phương pháp sử dụng cách tính dựa trên chất chuẩn ngoại, phù hợp với ISO 5725:1986 *). Xem Phụ lục D.

Dữ liệu về độ chụm trên sữa, thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh dạng lỏng, dầu ăn, margarin, thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh và dầu cá đã được thiết lập trong một phép thử liên phòng thử nghiệm theo hướng dẫn của AOAC về quy trình nghiên cứu cộng tác để đánh giá các đặc tính của phương pháp phân tích, xem Phụ lục D.

Dữ liệu thu được từ các nghiên cứu so sánh này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ chất phân tích và các chất nền khác với các dải nồng độ chất phân tích và các chất nền đã nêu trong Phụ lục D.

8.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

Các giá trị này như sau:

Margarin:

...

...

...

r = 2,32 mg/100 g

Sữa bột:

 = 14,3 mg/100 g

r = 2,09 mg/100 g

Sữa:

 = 0,418 mg/100 g

r = 0,054 mg/100 g

Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh dạng lỏng:

 =1,38 mg/100 g

...

...

...

Dầu ăn:

 = 4,61 mg/100g

r = 0,96 mg/100 g

Margarin: 

 = 8,39 mg/100 g

r = 1,52 mg/100 g

Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh: 

 = 10,1 mg/100 g

r = 0,7 mg/100 g

...

...

...

 = 11,6 mg/100 g

r = 0,7 mg/100g

8.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được khi tiến hành thử trên vật liệu giống nhau, do hai phòng thử nghiệm thực hiện không quá 5 % các trường hợp lớn giới hạn tái lập R.

Các giá trị này như sau:

Margarin:

 = 12,3 mg/100 g

R = 2,66 mg/100 g

Sữa bột:

...

...

...

R = 2,21 mg/100 g

Sữa:

 = 0,418 mg/100 g

R = 0,106 mg/100 g

Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh dạng lỏng:

 = 1,38 mg/100 g

R = 0,47 mg/100 g

Dầu ăn:

 = 4,61 mg/100 g

...

...

...

Margarin:

 = 8,39 mg/100 g

R = 1,60 mg/100 g

Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh:

 = 10,1 mg/100 g

R = 2,0 mg/100 g

Dầu cá:

 = 11,6 mg/100 g

R= 5,8 mg/100g

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử đã sử dụng;

c) các kết quả và các đơn vị biểu thị kết quả;

d) ngày và quy trình lấy mẫu (nếu biết);

e) ngày nhận mẫu;

f) ngày thử nghiệm;

g) các điểm đặc biệt quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

...

...

...

PHỤ LỤC A

(tham khảo)

CÁC VÍ DỤ VỀ HỆ THỐNG HPLC PHÙ HỢP

Bảng A.1 - Các ví dụ về hệ thống HPLC bán điều chế được dùng để làm sạch dung dịch mẫu thử trong nghiên cứu chứng nhận của EU Mat trên vitamin D [8]

Cột

Kích thước, mm

Pha động, (V + V)

Detector, l

Polygosil^® 60, 5 mm

...

...

...

iso-octan + iso-butanol (99 + 1)

265 nm

LiChrospher^® Si 60, 5 mm

250 x 4

n-hexan + 2-propanol (99 + 1)

265 nm

LiChrospher^® Si 100, 5 mm

250 x 8

n-hexan + 2-propanol (98 + 2)

...

...

...

m Porasil^® silica

300 x 3,9

n-hexan + THF + 2-propanol (98 + 1 + 1)

265 nm

Partisil^® PAC, 5 mm

250 x 4,6

n-hexan + isoamylalcohol (99 + 1)

265 nm

LiChrosorb^® Si 60

...

...

...

n-hexan + 2-propanol + THF (98 + 1 + 1)

265 nm

LiChrosorb^® Si 60

250 x 4

n-hexan + 2-propanol (95 + 5)

265 nm

LiChrosorb^® Si 60

250 x 4

n-hexan + 2-propanol (97 + 3)

...

...

...

Tất cả các tên thương mại này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng.

Bảng A.2 - Các ví dụ về hệ thống HPLC phân tích được dùng để xác định vitamin D trong dung dịch mẫu thử trong nghiên cứu chứng nhận của EU MAT, xem [8]

Cột

Kích thước, mm

Pha động, (V + V)

Detector, l

Hypersil^®ODS, 5 mm

250 x 4,6

metanol

...

...

...

LiChrospher^®100 RP 18, 5 mm

250 x 4

metanol + nước (95 + 5)

264 nm

Vydac^® 201TP54

250 x 4,6

metanol + nước (93 + 7)

265 nm

Vydac^® 201TP54

...

...

...

axetontril + metanol (80 + 20)

265 nm

Spherisorb^® ODS 2, 5 mm

250 x 4,6

axetonitril + diclometan + metanol (93 + 4 + 3)

mảng diot

Nucleosil^® C₁₈, 5 mm

250 x 4

axetonitril + metanol (70 + 30)

...

...

...

Zorbax^® ODS

250 x 4,6

axetonitril + metanol (95 + 5)

265 nm

Tất cả các tên thương mại này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng.

PHỤ LỤC B

(tham khảo)

CÁC VÍ DỤ VỀ CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾT VÀ XÀ PHÒNG HÓA THÍCH HỢP

...

...

...

Bảng B.1 - Các ví dụ về các hệ thống HPLC được dùng để xác định vitamin D trong dung dịch mẫu thử của các nước thành viên tham gia trong nghiên cứu chứng nhận của EU MAT

Xà phòng hóa

Chiết

16 g chất béo + 150 ml etanol + 1 g pyrogallol + [75 ml nước + 30 g KOH^a)] + thổi nitơ; 70 °C trong 30 min

PE ^b) + DEE^c) (9 + 1) 2 x 100 ml; rửa bằng nước 5 x 100 ml

8 g chất béo + 100 ml etanol + 1 g natri ascobat + 0,04 g natri sulfit + 12 g KOH + 50 ml nước + thổi nitơ; 80 ^oC trong 30 min

n-hexan, 3 x 100 ml và 3 x 50 ml; rửa bằng nước 4 x 100 ml

8 g chất béo + 35 ml etanol + 2 g natri ascobat + 10 g KOH + 50 ml nước; 100 ^oC trong 45 min

n-hexan, 1 x 100 ml; rửa bằng KOH 5 % , 1 x 100 ml; rửa bằng etanol 30 % trong natri clorua 9 %, 1 x 100 ml; rửa bằng natri clorua 0,9 % ; 1 x 100 ml

...

...

...

DEE, 2 x 100 ml; rửa bằng nước, 4 x 50 ml

6 g đến 8 g chất béo + 100 ml etanol + 1 g axit ascorbic + 50 ml KOH 50 % + thổi nitơ; 20 ^oC trong 20 h

PE + DEE (1 + 1), 2 x 200 ml; rửa bằng nước, 6 x 50 ml

8 g chất béo + 1 g pyrogallol + 150 ml KOH 28 % trong etanol và nước (9 + 1) + thổi nitơ; đối lưu ở 100 ^oC trong 30 min

DEE + PE (1 + 1), 2 x 500 ml; rửa bằng nước, 5 x 150 ml

24 g chất béo + 90 ml etanol + 0,5 g natri ascorbat + 30 ml KOH 60 % + thổi nitơ; đối lưu ở 100 ^oC trong 45 min

DEE, 1 x 150 ml, 3 x 75 ml; rửa, 5 x 200 ml

a) KOH = kali hydroxit

b) PE = dầu nhẹ

...

...

...

PHỤ LỤC C

(tham khảo)

CÁC VÍ DỤ VỀ SẮC PHỔ PHÂN TÍCH HPLC VÀ HPLC BÁN ĐIỀU CHẾ THÍCH HỢP

CHÚ DẪN

x thời gian (min)

y tín hiệu (đơn vị tùy chọn)

1 vitamin D trong sữa bột

...

...

...

Hình C.1 - Sắc đồ điển hình của HPLC bán điều chế dùng cho pha thường của sữa bột (CRM 421) đã xà phòng hóa, xử lý lỏng/ lỏng và chất chuẩn vitamin D (vitamin D₂ và vitamin D₃)

CHÚ DẪN

x thời gian (min)

y tín hiệu (đơn vị tùy chọn)

1 vitamin D₂

2 vitamm D₃

Hình C.2 - Sắc đồ điển hình của chất chiết từ sữa bột (CRM 421) phân tích bằng HPLC pha đảo của phần vitamin D có thời gian từ 11,5 min đến 12,5 min trong bước bán điều chế (xem Hình C.1)

...

...

...

(tham khảo)

DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

Các thông số nêu trong Bảng D.1 trên margarin (CRM 122) và sữa bột (CRM 421) đã được xác định trong phép thử liên phòng thử nghiệm [8], phù hợp với các hướng dẫn nghiên cứu chứng nhận của EU MAT. Nghiên cứu này do phòng thử nghiệm hóa học của chính phủ Anh tổ chức.

Các thông số trong Bảng D.2 trên sữa, thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh dạng lỏng, dầu ăn, margarin, thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh và dầu cá đã được xác định trong phép thử liên phòng thử nghiệm theo Hướng dẫn của AOAC đối với quy trình nghiên cứu cộng tác để đánh giá các đặc tính của phương pháp phân tích [13]. Nghiên cứu này do NMKL (Ủy ban về phân tích thực phẩm của Bắc Âu) [11] tổ chức. Phương pháp này bao gồm việc xà phòng hóa, chiết, cô đặc, sử dụng HPLC điều chế và HPLC phân tích.

Bảng D.1 - Dữ liệu về độ chụm đối với margarin và sữa bột

Mẫu

1

2

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

...

...

...

1994

Số lượng phòng thử nghiệm

11

11

Số lượng mẫu

5

5

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

11

...

...

...

Số lượng các phòng thử nghiệm ngoại lệ

0

0

Số lượng các kết quả được chấp nhận

48

47

Giá trị trung bình, , mg/100 g

12,30

14,30

...

...

...

0,82

0,74

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD, %

6,7

5,2

Giới hạn lặp lại, r [r = 2,8 x s_r], mg/100 g

2,32

2,09

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/100 g

...

...

...

0,78

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

7,6

5,5

Giới hạn tái lập, R [R = 2,8 x s_R), mg/100 g

2,66

2,21

Chi số Horat R

0,3

...

...

...

1 Margarin có bổ sung vitamin D₃ (CRM 122)

2 Sữa bột sấy phun, sữa nguyên chất (CRM 421) có bổ sung vitamin D₃

Bảng D.2 - Dữ liệu về độ chụm đối với sữa, thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh dạng lỏng, dầu ăn, margarin, thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh, dầu cá

Mẫu

1

2

3

4

5

...

...

...

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1997

1997

1997

1997

1997

1997

Số lượng phòng thử nghiệm

8

...

...

...

8

8

8

8

Số lượng mẫu

2

2

2

2

...

...

...

2

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

7

8

8

7

7

8

Số lượng các phòng thử nghiệm ngoại lệ

...

...

...

0

0

1

1

0

Số lượng các kết quả được chấp nhận

14

16

16

...

...

...

14

16

Giá trị trung bình, , mg/100 g

0,418

1,38

4,61

8,39

10,1

11,6

...

...

...

0,019

0,08

0,34

0,54

0,2

0,3

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r, %

4,6

5,9

...

...

...

6,5

2,4

2,2

Giới hạn lặp lại, r [r= 2,8 x s_r], mg/100 g

0,054

0,23

0,96

1,52

0,7

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/100 g

0,038

0,17

1,11

0,57

0,7

2,1

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

9,1

...

...

...

24,1

6,8

7,1

17,7

Giới hạn tái lập, R [R = 2,8 x s_R], mg/100 g

0,106

0,47

3,11

1,60

...

...

...

5,8

Độ thu hồi, %

-

-

102

-

93,9

92,9

Chỉ số Horrat R ^a)

...

...

...

0,6

1,1

0,3

0,3

0,8

1 sữa tiệt trùng (UHT) có hàm lượng lactoza thấp, không bổ sung vi chất

2 thực phẩm ăn liền, có bổ sung vi chất, thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh dạng lỏng (bột nhão), vitamin D₃ công bố trên nhãn là 1,3 mg/100 g

3 dầu ăn có bổ sung vitannin D₃ dùng cho thử nghiệm cộng tác

4 margaiin có bổ sung vitamin D₃ dùng cho thử nghiệm cộng tác

...

...

...

6 dầu cá có bổ sung vitamin D₃ dùng cho thử nghiệm cộng tác

a) Các giá trị này khác với các giá trị trong tài liệu tham khảo [10] vì giá trị Horwits được đặt ở 22 %, đối với các giá trị trung bình nhỏ hơn 120 ppb theo Tài liệu tham khảo [12].

PHỤ LỤC E

(tham khảo)

BƯỚC LÀM SẠCH BỔ SUNG ĐỂ XÁC ĐỊNH VITAMIN D CÓ SỬ DỤNG TLC ĐIỀU CHẾ, SẮC KÝ CỘT VÀ HOẶC SPE

E.1. Bước làm sạch bổ sung có sử dụng TLC điều chế

E.1.1. Yêu cầu chung

Quy trình này đã được sử dụng rộng rãi để làm sạch các dịch chiết vitamin D trước khi đưa vào HPLC điều chế. Quy trình đã được đánh giá trên các loại thức ăn chăn nuôi như thức ăn cho lợn con chứa 50 mg vitamin D/kg.

...

...

...

- vùng có chứa vitamin D có thể dễ dàng quan sát được dưới ánh sáng UV. Tùy thuộc vào sự phân bố chất nền mà quy định mức độ nhỏ của vùng D₂/D₃. Vì vậy các chất gây nhiễu chất nền phải được giảm thiểu;

- sử dụng nhiều bước khai triển các tấm TLC, có thể cải thiện thêm sự phân biệt của vùng D₂/D₃ và các vùng chất nền.

Nhược điểm của phương pháp này là không thể thực hiện tự động. Thời gian luân chuyển bị hạn chế. Các thông tin bổ sung về quy trình này có trong [11].

E.1.2. Nguyên tắc

Phần dịch lỏng của dịch chiết thô sau khi xà phòng hóa được làm sạch bằng TLC điều chế. Vùng chứa vitamin D₂/D₃ được cạo ra khỏi tấm TLC rồi chuyển vào cột nhỏ và vitamin D₂/ D₃ được chiết. Thể tích của các dịch chiết này cần được giảm trước khi đưa vào để phân tích bằng HPLC.

E.1.3. Thuốc thử

E.1.3.1. Các tấm TLC, ví dụ silica gel 60 F 254, Merck 5715 1), cỡ hạt 0,25 mm, 20 cm x 20 cm.

E.1.3.2. Hydroxytoluen đã butyl hóa (BHT).

E.1.3.3. n-hexan.

...

...

...

E.1.3.5. Axeton.

E.1.3.6. Dietyl ete.

E.1.3.7. Dung môi khai triển các tấm TLC, hỗn hợp của 88 ml n-hexan, 2 ml metanol, 10 ml axeton và 10 mg BHT.

E.1.3.8. Dung môi để rửa giải vùng vitamin D₂/D₃ đã được phân lập, hỗn hợp của 60 ml dietyl ete và 40 ml n-hexan.

E.1.3.9. Dung dịch chuẩn vitamin D₃, 250 mg/ml trong metanol.

E.1.4. Thiết bị, dụng cụ

E.1.4.1. Hộp khai triển TLC dùng cho các tấm TLC 20 cm x 20 cm.

E.1.4.2. Xyranh, kín khí, dung tích 1 ml hoặc hệ thống chấm thích hợp dùng cho TLC.

E.1.4.3. Đèn UV, 254 nm.

...

...

...

E.1.4.5. Dao nhỏ, lưỡi sắc

E.1.5. Cách tiến hành

Đổ đầy dung môi (E.1.3.8) vào hộp triển khai TLC và đợi khoảng 2 h để bão hòa.

Làm bay hơi phần dịch lỏng thích hợp của dịch chiết thô sau khi xà phòng hóa cho đến khô dưới áp suất giảm và ngay sau đó hòa lại trong 2 ml n-hexan. Chấm 1 ml dung dịch này nhiều lần lên tấm TLC (E.1.3.1) để có được một vùng dài 10 cm và không rộng hơn 1 cm. Để xác định vị trí và nhận biết, chấm từ 5 ml đến 10 ml chất chuẩn vitamin D₃ (E.1.3.9) lên cả các cạnh của vùng này.

Cho triển khai tấm sắc ký hai lần đến gần mép trên. Để tăng khả năng tách thì nên triển khai theo nhiều hướng. Trước khi bắt đầu bước tách mới, sau lần chạy cuối, thì dung môi được cho bay hơi dưới dòng nitơ. Cho hiện hình vùng vitamin D₃/D₂ tách được dưới ánh sáng UV (E.1.4.3) và đánh dấu bằng bút chì (0,5 cm đến 1,5 cm). Cạo vùng tương ứng bằng dao (E.1.4.5) cho lên mẩu giấy và chuyển sang cột mao quản (E.1.4.4) đã đổ đầy 10 ml dung môi (E.1.3.8).

Vitamin D₂/D₃ được rửa giải 5 lần, mỗi lần đùng 10 ml dung môi (E.1.3.8). Làm bay hơi hỗn hợp các dịch rửa giải đến khô dưới áp suất giảm và hòa lại ngay trong 1 ml dung môi HPLC (dung dịch mẫu).

E.2. Bước làm sạch bổ sung bằng sắc ký cột

E.2.1. Nguyên tắc

Phương pháp làm sạch được thực hiện trên cột celit polyetylenglycol. Nhược điểm của phương pháp làm sạch này là không thể thực hiện tự động. Thời gian luân chuyển bị hạn chế.

...

...

...

E.2.2.1. Ete dầu mỏ, có dải sôi từ 40 ^oC đến 60 ^oC, đã được chưng cất.

E.2.2.2. Ete dầu mỏ, có dải sôi từ 60 ^oC đến 70 ^oC, đã được chưng cất.

E.2.2.3. Diatomit, natri cacbonat đã nung chảy CAS No.: 68855-54-9.

E.2.2.4. Natri sulfat

E.2.2.5. Polyetylenglycol 600

E.2.3. Thiết bị, dụng cụ

E.2.3.1. Máy cô quay, có nồi cách thủy duy trì ở 40 ^oC.

E.2.3.2. Máy trộn tốc độ cao chống nổ

E.2.3.3. Ống sắc ký, dài 30 cm, đường kính trong 2,5 cm, có nút bằng polytetrafloetylen (PTFE) ở đáy ống. Trên đỉnh cột có gắn một bể 100 ml, dài 10 cm, đường kính trong 1,4 cm, đáy hẹp.

...

...

...

E.2.4. Cách tiến hành

E.2.4.1. Chuẩn bị cột

Tạo huyền phù của 25 g diatomit (E.2.2.3) và 200 ml ete dầu mỏ (E.2.2.2) trong máy trộn (E.2.3.2). Trong khi trộn, thêm nhanh 15 ml polyetylenglycol (E.2.2.5) và tiếp tục trộn trong khoảng 20 s.

Cách khác, tạo huyền phù bằng cách tạo ra bột nghiền polyethylenglycol tương đương trên chất mang. Rót một lượng nhỏ ete dầu mỏ (E.2.2.2) vào ống sắc ký (E.2.3.3), nút đáy ống bằng nút len cotton kín khí vào và phủ một lớp natri sulfat (E.2.2.4) dày 1 cm. Rót huyền phù vào chai và nén cột dùng pittông để nén cột cho đến khi chiều dài của cột cuối cùng khoảng 15 cm. Tại thời điểm này, tất cả ete dầu mỏ dư thừa cho chảy hết. Phủ lên đỉnh cột một lớp natri sulfat dày 1 cm.

E.2.4.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu, rửa giải và thu lấy dịch rửa giải

Chuyển dịch chiết từ bình cầu đáy tròn, dùng 3 phần ete dầu mỏ (E.2.2.2), mỗi phần khoảng 3 ml để tráng bình. Chuyển tất cả sang cột. Rửa giải bằng cách dùng ete dầu mỏ (E.2.2.2). Loại bỏ 30 ml dịch rửa giải đầu tiên. Thu lấy 50 ml dịch rửa giải tiếp theo hoặc cho đến khi dải băng retinol chạm vào đáy của cột diatomit. Điều này có thể nhìn thấy được bằng cách dùng đèn tử ngoại sóng dài (E.2.3.4). Làm bay hơi dịch rửa giải đến khô trong máy cô quay (E.2.3.1) và thêm 2 ml đến 3 ml ete dầu mỏ (E.2.2.1) hoặc (E.2.2.2). Tiếp tục với bước làm sạch sử dụng SPE (xem E.3).

E.3. Bước làm sạch bổ sung bằng SPE

E.3.1. Nguyên tắc

Phần này mô tả phương pháp làm sạch bằng SPE và silica. Nhược điểm của phương pháp làm sạch này là không thể thực hiện tự động. Thời gian luân chuyển bị hạn chế.

...

...

...

E.3.2.1. n-heptan p.a.

E.3.2.2. Dietyl ete

Loại bỏ các peroxil bằng cách chưng cất trên các viên KOH mỗi ngày trước khi sử dụng.

E.3.2.3. Ete dầu mỏ, dải sôi từ 40 ^oC đến 60 ^oC, đã được chưng cất.

E.3.3. Thiết bị, dụng cụ

E.3.3.1. Cột chiết silica pha rắn, khoảng 700 mg.

E.3.3.2. Bình nón 50 ml, có các khớp nối mài B 29

E.3.4. Cách tiến hành

Làm bay hơi dịch rửa giải và hòa tan trong 10 ml heptan (E.3.2.1). Hoạt hóa ống (E.3.3.1) bằng 10 ml heptan. Chuẩn bị và rửa giải 10 ml dịch chiết mẫu. Dùng 10 ml dietyl ete 6 % (E.3.2.2) trong heptan để tráng rửa và dùng 20 ml dietyl ete 20 % (E.3.2.2) trong heptan để rửa giải. Thu lấy dịch rửa giải vào bình nón (E.3.3.2), làm bay hơi và hòa tan phần còn lại trong 1 ml đến 2 ml ete dầu mỏ (E.3.2.3). Tiếp tục với bước làm sạch TLC hoặc HPLC bán điều chế.

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Johnsson, H., Hessel, H., and Thorzell, K. Internat. J. Vitamin & Nutr. Res., 1987, 57, 357-365.

[2] Johnsson, H., Halen, B., Hessel, H., Nyman, A., and Thorzell, K., Internat. J. Vitamin & Nutr. Res.,1989, 59, 262-268.

[3] Reynolds, S.L., and Judd, H.J. The Analyst, 1984, 109. 489-492.

[4] Bognar, A., Z. Lebensm. Unters. Forsch., 1992, 194, 469-475.

[5] Van Den Berg, J. Agric. Fd. Chem., 1986, 34, 264-268.

[6] Mattila, P., Piironen, V., Bäckman, C., Asunmaa, A. Uusi-Rauva, E. and Koivistoinen, P., J. FoodComp. Anal., 1992, 5, 281-290.

[7] Lumley, I.D. and Lawrance, P.R. J. Micronutrient Anal., 1990, 7, 301-313.

[8] Finglas, P.M., van den Berg, H. and de Froidmont-Görtz, I., 1997. The certification of the mass fractions of vitamins in three reference materials: margarin (CRM 122), milk powder (CRM 421), and lyophilized Brussels sprouts (CRM 431). EUR-Report 18039, Commission of the European Union, Luxembourg.

...

...

...

[10] Staffas, A., Nyman, A , J. AOAC Int., 2003, 86, 400-406

[11] Methode 13.8.1 (Method 13.8.1): Die Bestimmung von Vitamin D - HPLC Verfahren (The determination of Vitamin D - HPLC Method); in: Methodenbuch 3.4. Ergänzungslieferung 1997. VDLUFA Verlag Deutschland

[12] Thompson, M., 2000, 125, 385-386

[13] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, Associate Referee's Manual on development, Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies p. 23 - 51

[14] ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests

*) ISO 5725:1986 đã được hủy bỏ. Hiện nay có bộ tiêu chuẩn TCVN 6910 (ISO 5725), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo gồm có 6 phần.

1) Silica gel 60 F 254. Merck 5715 là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng.