Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7082-2:2002 sữa và sản phẩm sữa – xác định dư lượng hợp chất Clo hữu cơ

11.3.2. Hình thành dẫn xuất trong chất nền đặc

11.3.2.1. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

11.3.2.1.1. Nhôm oxit 60 (Al₂O₃) loại E kiềm hoạt tính, hoạt độ I, Merck 1067⁹⁾.

11.3.2.1.2. Nhôm oxit 90 (Al₂O₃), đã hoạt hóa, tính axit, hoạt độ I, Merck 10789).

Kiểm tra độ sạch của cả hai chất hấp phụ bằng cách lắc 0,5 g với 2 ml toluen tinh khiết. Để cho chất rắn lắng xuống và bơm phần nổi phía trên cho sang bộ sắc ký khí lỏng dưới cùng điều kiện đã sử dụng để phân tích thuốc trừ sâu. Nếu quan sát thấy các pic, thì làm sạch bằng cách nung ở 550⁰C ± 25⁰C ít nhất 3h.

11.3.2.1.3. Toluen, etyl axetat hoặc isooctan (2,2,4-trimetylpentan), thích hợp cho phép phân tích dư lượng thuốc trừ sâu.

11.3.2.1.4. Axit sunfuric, c(H₂SO₄) = 95% đến 97% dung dịch (phần khối lượng).

11.3.2.1.5. Axit clohidric (HCl), dễ bốc khói (ít nhất 37% phần khối lượng).

...

...

...

11.3.2.1.7. Chất nền đặc, để xử lý kiềm quy mô rất nhỏ (alumin kiềm).

Hòa tan 5 g kali hidroxit (KOH) dạng hạt trong 4 ml nước vào cốc thủy tinh 400 ml. Thêm 50 g nhôm oxit (11.3.2.1.1) với các lượng nhỏ trong khi vẫn khuấy kỹ bằng đũa thủy tinh. Chuyển sang bình 500 ml và lắc kỹ. Bảo quản trong bình hút ẩm cho đến khi sử dụng. Dung dịch này bền trên 6 tháng nếu được bảo quản khô.

11.3.2.1.8. Chất nền đặc, để khẳng định endrin (nhôm oxit axit).

Cẩn thận cho 5 ml axit sunfuric (11.3.2.1.4) vào 2,5 ml nước. Làm mát trước trong bể đá từ 20 phút đến 30 phút. Dùng chày để nghiền nhanh 50 g alumin có tính axit tinh khiết ở dạng đá lạnh (11.3.2.1.2) trong cối cùng với axit sunfuric pha loãng. Chuyển hỗn hợp này sang bình thủy tinh đậy kín và lắc trong 2 h trong máy lắc. Để bình vẫn đậy kín vào bình hút ẩm. Chất nền đặc được chuẩn bị như vậy có giá trị sử dụng trên 1 năm.

11.3.2.1.9. Chất nền đặc, để khẳng định endosunfan (nhôm oxit có tính axit mạnh).

Làm lạnh 5 ml axit sunfuric đậm đặc (11.3.2.1.4) và 25 g nhôm oxi axit đã làm sạch (11.3.2.1.2) một cách riêng rẽ đến dưới zero trong khoảng 30 phút. Trộn trong cối đã làm lạnh trước và nghiền nhanh cho đến khi thu được hỗn hợp dạng bột rời.

Bảo quản trong bình đậy kín khí để trong bình hút ẩm cho đến khi sử dụng.

11.3.2.1.10. Chất nền đặc, để khẳng định nhận biết dieldrin (nhôm oxit thấm đầy kẽm clorua và axit clohidric).

Cho 0,4g kẽm clorua dạng khan (11.3.2.1.6) vào cốc 100 ml. Thêm 0,8 ml axit clohidric (11.3.2.1.5) và khuấy nhanh bằng đũa thủy tinh cho đến khi chất rắn được hòa tan hết. Thêm 10g nhôm oxit axit (11.3.2.1.2) và trộn kỹ cho đến khi thu được hỗn hợp bột rời.

...

...

...

11.3.2.2. Cách tiến hành

11.3.2.2.1. Khẳng định DDT, TDE, metoxyclo, anpha-clorodan, heptaclo và heptaclo epoxit

Cho vào hai ống thủy tinh 10 ml, mỗi ống khoảng 1 g chất nền có tính kiềm (11.3.2.1.7). Cho vào một ống nghiệm một phần thích hợp của dịch chiết mẫu đã làm sạch và cô đặc. Cho vào ống còn lại một phần dung dịch tiêu chuẩn chứa một lượng hợp chất clo hữu cơ giống như hợp chất đã dự đoán có trong dịch chiết mẫu.

Loại trừ các dung môi bằng cách thổi nhẹ một dòng không khí sạch hoặc làm ấm nhẹ các ống. Trộn chất nền đặc khô bằng cách đặt hai ống lên máy rung hoặc trong bể siêu âm. Tra cứu bảng 2 về các điều kiện phản ứng và dung môi sử dụng để chiết các dẫn xuất khác nhau. Thêm 1 ml hoặc 2 ml dung môi thích hợp và chiết dẫn xuất bằng cách lắc mạnh hoặc đặt các ống nghiệm trong bể siêu âm 2 phút. Để cho các hạt hấp phụ lắng xuống và bơm một phần chất lỏng nổi phía trên lên bộ sắc ký khí. Sự nhận dạng các sản phẩm phản ứng, lượng có thể phát hiện nhỏ nhất của chúng và thời gian lưu tương đối được liệt kê trong bảng 2.

Bảng 2 – Khẳng định việc nhận dạng hợp chất clo hữu cơ bằng sự hình thành dẫn xuất trong chất nền đặc nhôm oxit/KOH

Hợp chất gốc

Nhận biết chất dẫn xuất

Thời gian phản ứng ở 80⁰C

h

...

...

...

Lượng xấp xỉ tối thiểu có thể phát hiện được trong dịch chiết cuối cùng

ng/2ml

Thời gian lưu tương đối (aldrin = 1,00) trên 1,5% OV-17/1,95%

cột QF-1

Hợp chất gốc

Dẫn xuất

p,p’-DDT

p,p’-DDE

1

...

...

...

15

3,95

2,20

o,p’-DDT

o,p’-DDE

1

Toluen

50

3,07

...

...

...

p,p’-TDE

DDMU

1

Toluen

50

3,26

1,80

o,p’-TDE

Olefin

...

...

...

Toluen

50

2,53

1,57

Metoxyclo

Olefin

1

Toluen

50

...

...

...

4,78

Heptaclo

1-Hydroxicloden

2

Etyl axetat

25

0,80

1,27

Heptaclo epoxit

...

...

...

2

Etyl axetat

25

1,51

2,50

α-Cloradan

3-Clorocloden

1,5

Axetat

...

...

...

1,80

1,20

Các hợp chất clo hữu cơ khác, tức là HCB, PCB, g-clodan, aldrin, dieldrin và endrin giữ nguyên không đổi trong quá trình phản ứng. Các đồng phân HCH hoàn toàn bị phá vỡ thành các đồng phân triclobenzen, các đồng phân này rửa giải cùng với dung môi tạo pic trong suốt quá trình sắc ký khí lỏng.

Nếu có mặt một lượng HCH đáng kể, thì có thể quan sát thấy ba đồng phân triclobenze bằng cách hạ nhiệt độ cột đến khoảng 110⁰C. Đồng phân 1,2,4- chiếm phần lớn.

11.3.2.2.2. Khẳng định dư lượng endrin

Chuẩn bị các dẫn xuất như mô tả trong 11.3.2.2.1, sử dụng chất nền đặc như quy định trong 11.3.2.1.8. Sau khi đã loại dung môi và trộn xong các chất rắn, đậy nút các ống nghiệm và để cho phản ứng xảy ra ít nhất 2 h hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Thêm 1 ml hoặc 2 ml toluen. Chiết dẫn xuất và phân tích bằng sắc ký khí lỏng như mô tả trong 11.3.2.2.1 sử dụng cột 1,5% OV-17/1, 95% QF-1.

Dẫn xuất keton hexacloropentaxyclic có thời gian lưu tương đối (aldrin = 1,00) 7,9 trên cột 1,5% OV – 17/1, 95% QF-1 và 30,7 trên 2% DEGS + 0,5% H₃PO₄.

13.3.2.2.3. Khẳng định dư lượng endosulfan

Chuẩn bị các dẫn xuất như mô tả trong 11.3.2.2.1, sử dụng chất nền đặc như quy định trong 11.3.2.1.10 (nhôm oxit có tính axit mạnh). Đun nóng chất nền đặc đã tẩm ở nhiệt độ 95⁰C trong 1h.

...

...

...

Endosulfan đã nhận được khẳng định, nếu sắc ký đồ của dịch chiết mẫu đã phản ứng cho thấy không có mặt các pic đã quan sát thấy trước đó ứng với các đồng phân của alpha – và beta – và dạng ngoài của pic endosulfan ete lớn cũng có mặt trên sắc ký đồ của dung dịch tiêu chuẩn đã xử lý theo cách tương tự. Thời gian lưu tương đối (aldrin = 1,00) của endosulfan ete là 0,77 trên cột 1,5% OV-17/1, 95% QF-1 và 1,32 trên cột 2% DEGS + 0,5% H₃PO₄.

11.3.2.2.4. Khẳng định dư lượng dieldrin

Tương tự như quy trình nêu trong 11.3.2.2.1, chuẩn bị các dẫn xuất dieldrin trong chất nền đặc thích hợp (11.3.2.1.10) ở 120⁰C trong 30 phút. Chiết dẫn xuất bằng toluen và phân tích bằng sắc ký khí lỏng.

Diedrin đã nhận dạng được khẳng định, nếu sắc ký đồ của dịch chiết mẫu đã phản ứng cho thấy không có mặt dieldrin đã quan sát thấy trước đó và dạng ngoài pic của dẫn xuất (aldrin clorohydrin) cũng có mặt trên sắc ký đồ của dung dịch tiêu chuẩn đã xử lý đồng thời.

Thời gian lưu tương đối (aldrin = 1,00) của aldrin clorohydrin là 5,35 trên cột 1,5% OV-17/1, 95% QF-1.

Các thuốc trừ sâu khác không gây nhiễu. Các đồng phân của HCH, HCB, PCB, heptaclo epoxit, các đồng phân của clodan, p,p’-DDE và p,p’-TDE giữ nguyên không đổi. Endrin được chuyển thành hợp chất keton, chất này rửa giải tiếp dẫn xuất dieldrin. Heptaclo tạo ra sản phẩm phản ứng với thời gian lưu giống như thời gian lưu của hidroxycloden, trong khi p,p’-DDT lại chuyển thành p,p’-DDE trên cột OV-17/QF-1. Tuy nhiên, tốc độ chuyển hóa ít khi cao hơn 50%.

11.3.3. Khẳng định việc nhận dạng các dư lượng hexaclorobenzen (HCB)

11.3.3.1. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

...

...

...

11.3.3.1.2. Thuốc thử metoxyl hóa

Hòa tan 4 g natri hidroxit trong 25 ml metanol, dùng bộ khuấy từ. Thêm từ từ 50 ml pyridin tinh khiết (được chưng cất qua kali hidroxit). Chuẩn bị dung dịch mới hàng ngày.

11.3.3.1.3. Natri sunfat (Na₂SO₄), khan, dạng hạt.

11.3.3.2. Cách tiến hành

Cho một thể tích thích hợp dịch chiết mẫu đã làm sạch vào bình cầu đáy tròn 50 ml và cô đặc đến khoảng 2 ml. Thêm 5 ml thuốc thử metoxyl (11.3.3.1.2). Đậy chặt nắp bình và làm nóng đúng 20 phút trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 50⁰C.

Làm mát dưới dòng nước chảy và chuyển lượng hỗn hợp phản ứng sang phễu chiết 125 ml, dùng 30 ml dầu nhẹ (11.3.3.1.1). Thêm 20ml nước, lắc mạnh trong 1 phút và chuyển pha lỏng phía dưới sang phễu chiết thứ hai. Chiết lại hai lần bằng 15ml dầu nhẹ. Gộp các dịch chiết bằng dầu nhẹ và rửa bốn lần, mỗi lần dùng 15 ml nước.

Làm khô dịch chiết bằng natri sunfat khan (11.3.3.1.3) và đưa về một thể tích thích hợp và phân tích bằng sắc ký khí lỏng.

Xử lý một phần thích hợp của dung dịch tiêu chuẩn HCB theo cách tương tự.

Kiểm tra các dịch chiết đã phản ứng bằng sắc ký khí lỏng. Hợp chất có thời gian lưu của pentacloroanisol sẽ được quan sát trong cả hai dịch chiết nếu HCB có mặt trong dịch chiết mẫu.

...

...

...

11.4.1 Khái quát

Có thể sử dụng việc rọi ánh sáng cực tím ở bước sóng 254 nm để khẳng định các dư lượng giả định của aldrin, γ-clodan, dieldrin, endrin, hexaclobenzen và heptaclo epoxit trong số các loại khác. Việc thay đổi trong sắc đồ khí gây ra do việc rọi được đặc trưng cho các hợp chất liên quan.

11.4.2. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

11.4.2.1. Ống thủy tinh, dài 53 mm và đường kính trong 8 mm.

11.4.2.2. Đèn thủy ngân, có bước sóng chính 254 nm (thí dụ, “Pen-Ray”, Agpe 11 8c-1, 5,5W hoặc tương đương 10).

11.4.2.3. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 20⁰C ± 1⁰C.

11.4.3. Cách tiến hành

Chuyển 1 ml dịch chiết đã làm sạch trong dầu nhẹ vào ống nghiệm thủy tinh (11.4.2.1) và đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy (11.3.2.3). Đặt đèn cực tím (11.4.2.2) vào dung dịch và rọi từ 5 phút đến 10 phút. Pha loãng một lần nữa đến 1 ml, nếu cần, và bơm 5 μl dung dịch theo cách tương tự như trước khi rọi. So sánh các sắc ký khí thu được trước và sau khi rọi.

...

...

...

Chú thích – Quy trình làm sạch khuyến nghị bổ sung thêm alumin đã phủ bạc nitrat để loại bỏ các chất gây nhiễu gặp phải trong quá trình phân tích phomat có hương vị tỏi.

12.1. Nguyên tắc

Dịch chiết đã hấp phụ được làm sạch bằng sắc ký đổ trên cột nhôm oxit phủ bạc nitrat

12.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

12.2.1. Nhôm oxit (Al₂O₃) trung tính (Merck số 1077 11) hoặc tương đương).

Nung ở 550⁰C trong 4 h. Để nguội rồi cho thêm 7 phần nước vào 93 phần nhôm oxit (tính theo thể tích) và lắc mạnh cho đến khi nước đã được hấp thụ hoàn toàn và được phân bố đồng đều.

12.2.2. n-Hexan [CH₃(CH₂)₄CH₃], đạt chất lượng phân tích dư lượng.

12.2.3. Chất hấp phụ sắc ký

...

...

...

12.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

11.3.1. Cột sắc ký, dài 150 mm và đường kính trong 8 mm, có van khóa PTFE.

12.3.2. Bộ cô quay chân không (Kuderna-Danish²⁾ hoặc loại tương đương) có bình dung tích 100 ml và được gắn với ống chia độ.

12.4. Cách tiến hành

Đặt nút bông cotton hoặc bông thủy tinh vào đáy cột sắc ký (12.3.1) và rót 5 ml n-hexan (12.2.2) lên cột (12.3.1), giữ vòi ở trạng thái khóa. Trộn 2 g chất hấp phụ (12.2.3) và 10 ml n-hexan trong bình 100 ml. Rót huyền phù này lên cột và rửa sạch bình để chuyển hết hỗn hợp. Cho n-hexan chảy đến mức 10 mm cao hơn đỉnh chất hấp phụ trong cột và loại bỏ dịch rửa giải. Cho lên cột 1,0ml dịch chiết cô đặc thu được bằng quy trình làm sạch chính.

Rửa giải bằng 20ml n-hexan với tốc độ dòng không quá 3 ml/min cho vào bình cô quay chân không 100 ml (12.3.2). Cô dịch rửa giải đến khi thể tích còn từ 2 ml đến 3 ml trong bộ cô quay chân không (12.3.2) và cho dung dịch bay hơi đến chính xác 1,0 ml bằng dòng khí nitơ. Dịch chiết đã làm sạch này thích hợp cho phép phân tích sắc ký khí lỏng.

Trong suốt quy trình, heptaclo tạo ra dẫn xuất có thời gian lưu giống với thời gian lưu của aldrin trên một số cột sắc ký khí lỏng nhất định.

...

...

...

[1] GUNTHER, F.A et al. Anal, Chem., 23, 1951, p: 1835.

[2] BURKE, J.A. MILLS, P.A. and BOSTWICK, D.C.J.AOAC, 49, 1966, p.999.

[3] HORWITZ, w. (ed). Official Methods of Analysis of the AOAC, 12^th edition, Washington DC, 1975, pp. 518-525.

[4] DE FAUBER MAUNDER, M.J. et al. Clean up of Animal Fats and Dairy Products for the Analysis of Chlorinated Pesticide Residues, Analyst, 89, 1964, pp. 168-174.

[5] BRO-RASMUSSEN, F., RODIN, F. and VOLDUM-CLAUSEN, K. Uberprufung einer gaschromatographischen Methode zur Bestimmung chlorieter Insektizide in Butter and pflanzlichen Erzeugnissen. Zeitschrift fur Lebensmittel Untersuchung and –Forschung, 138, 1968, pp. 276-284.

[6] SPECHT, W. Untersuchung von Lebensmitteln auf Pestizidruckstande (Gaschromatographische Methode zur gleichzetigen Bestimmung von Ruckstanden der Organochlor and Organophosphor-Pesrizide). Working paper (1974).

[7] TELLING, G.M, SISSONS, D.J., BRINKMAN H.W.J Chromatography, 137, 1977, p.405.

[8] GREVE, P.A. and GREVENSTUK, W.B.F. A convenient small-scale-up method for extracts of fatty samples with basic alumina before GLC-analysis on organochlorine pesticides residues. Mededeling Fakulteit Landbouwwetenschappen (Gent), 40, 1975, pp. 1115-1124.

[9] STIJVE, T. and CARDINALE, E. Rapid Determination of Chlorinated Pesticides, Polychlorinated Biphenyls and a Number of Phosphated Insecticides in Fatty Foods. Mitt. Levensmitterunters. Hyg., 65, 1974, pp. 131-150.

...

...

...

[11] STIJVE, T. and BRAND, E. A Rapid Low Cost Small-Scale Clean-up. Method for the Determination of Orgnochlorine Pesticide Residues in Fats and Oils. Deutsche Lebensm. Rundschau. 37, 1977, pp. 41-42

[12] STEINWANDTER, H. Beitrage zur Verwendung von Kieselgel in der Pestizidanalytik: II. Analytik and Kapill Gas-Chromatographie von β-HCH and anderen Chlorkohlenwasserstoff-Pestiziden. Z Anal. Chem., 304, 1980, pp. 137-140.

[13] STEINWANDTER, H. Contributions to silica gel application in pesticide residue analysis: III. An online method for extracting and isolating chlorinated hydrocarbon pesticides and PCB’s from milk and dairy products. Z. Anal. Chem., 312, 1982, pp-342-345.

[14] GROB, K and GROB, G. Techniques of capillary gas-chromatography. Possibilities of the full utilization of high-performance columns. Part I: Direct sample injection. Chromatographia, 5, 1972, pp. 3-12.

[15] VAN DEN BERG, P.M.J. and COX, T.P.H. An all-glass solid sampling device for open tubular columns in gas chromatography. Chromatographia, 5, 1972, pp. 301-305.

[16] TUINSTRA, L.G.M.Th. and TRAAG, W.A. Automated glass capillary gas chromatography analysis of PCB and organochlorine pesticide residues in agricultural products. J. HRC & CC, 2, 1979, pp. 723-728.

[17] CHAU, A.S.Y and LA NOUETTE, M. J. AOAC, 55, 1972, pp. 1058-1066.

[18] CHAU, A.S.Y. Bulletin of Environmental Contamination & Toxicology, 8, 1972, pp. 169-176.

[19] CHAU. A.S.Y.J. AOAC, 55, 1972, pp. 1232-1238.

...

...

...

[21] ZIMMERLI, B. and MAREK, B. Entwicklung einer gaschromatographischen Bestimmungs- and Bestatigungsmethode fur Hexachlorbenzolruckstande in Fetten and Olen. Mitt. Lebenmittelunters. Hyg., 63, 1972, pp. 273-389.

[22] MANSOUR, M. and PARLAR, HJ. Agric. Food Chem., 26, 1978, pp. 483-485.